Name: Sincronizzazione di Caulobacter crescentus Per Indagine del ciclo cellulare batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Impara a sincronizzare Caulobacter crescentus per studiare il ciclo cellulare batterico usando centrifugazione a densità differenziale. Questo metodo consente di isolare rapidamente cellule swarmer per saggi biochimici e microscopia.

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Gli autori ringraziano i membri del laboratorio Shapiro e Erin Schrader per i commenti sul manoscritto. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario da: borsa di studio post-dottorato NIH F32 GM100732 a JMS e sovvenzioni NIH R01 GM51426 e R01 GM32506 a LS.

1. larga scala Synchrony - ottimale per Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e altro materiale saggi Intensive <ol><li> Da uno stock congelatore o un piatto, crescere a 5 ml O / N cultura del ceppo NA1000 agitando a 28 ° C in PYE medio. </li><li> Inoculare 0,5 ml delle cellule dal punto 1 in 25 ml di M2G (Tabelle 1-2) e agitare a 28 ° C fino alla cultura raggiunge un OD 600 tra 0,5 e 0,6. </li><li> Inoculare le cellule in 1 L di M2G e agitare a 28 ° C. </li><li> Una volta OD 600 raggiunge 0.5 a 0.6, confermare la presenza di swarmer cellule utilizzando liquido montato microscopio fase. Spot 1 ml di cellule su un vetrino, coprire con un vetrino, e l&#39;immagine al microscopio fase. Confermare la presenza di cellule Swarmer visualizzando cellule in rapida nuoto nella popolazione. </li><li> Spin cellule per 15 minuti a 7 kxg a 4 ° C in un rotore JA-10. </li><li> Scartare il surnatante e aggiungere 180 ml di freddo M2 (Tabelle 1-2) e res delicatamenteuspend tutte le cellule utilizzando una pipetta sierologica. Eliminare le celle liberamente pellet; sono cellule predivisional e se ne andò. </li><li> Aggiungere 60 ml di soluzione fredda di silice colloidale (assicuratevi di mescolare la sospensione di silice colloidale bene prima di aggiungere alle cellule) e mescolare bene la sospensione cellulare. </li><li> Versare la sospensione cellulare in otto 30 ml provette e centrifugare per 30 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. NOTA: Si dovrebbe vedere due bande distinte; la band Swarmer è la banda più bassa, mentre le cellule / predivisional stalking sono nella fascia superiore (Figura 1B). </li><li> Aspirare accuratamente la banda superiore e rimuovere il liquido ~ 1 cm sopra la banda swarmer (la banda inferiore). </li><li> (Critico) Usando una pipetta Pasteur, rimuovere con attenzione la band swarmer e posto in una provetta pulita. Per lavare via la silice colloidale, superiore al tubo via con freddo M2 e girare per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un JA-20 del rotore. </li><li> Eliminare attentamente il surnatante e risospendere ilcellule in 20 ml di freddo M2 e centrifuga per 10 minuti a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. </li><li> Risospendere i pellet in 30 ml di freddo M2 e misurare la OD 600 utilizzando uno spettrofotometro e vuoto utilizzando freddo medio M2. Salva 1 ml per l&#39;imaging di fase per verificare swarmer cellule; 90-95% delle cellule dovrebbe essere sciami. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C in un rotore JA-20. Risospendere le cellule in 28 ° C M2G media in modo che la A 600 è ~ 0,3-0,4 e iniziare agitazione a 28 ° C. NOTA: i rendimenti tipici sono tra 30 e 60 ml di swarmer coltura cellulare da 1L di cellule non sincronizzate. </li><li> Cominciare a prendere punti di tempo (la cultura di tipo selvatico richiede circa 135-140 minuti per dividere) 8,9. Ad ogni punto di tempo, misurare il diametro esterno 600. Controllare che la OD 600 dopo la divisione è pari a circa 2 volte l&#39;OD iniziale 600. </li><li> Per macchia o di espressione genica test occidentali, rimuovere 1 ml aliquote della culture nei punti di tempo desiderato, centrifugare a velocità massima in una centrifuga da tavolo per 30 sec, rapidamente decantare o aspirare il mezzo, e flash congelare il pellet cellulare in azoto liquido. Conservare le cellule a -80 ° C fino all&#39;analisi valle. </li></ol> 2. piccola scala Synchrony - ottimale per Microscopia <ol><li> Da uno stock congelatore o un piatto, crescere un / cultura 5 ml O N agitazione a 28 ° C in M2G. </li><li> Diluire in 15 ml di M2G (Tabelle 1-2) e crescere fino a metà-log (OD 600 = 0.5-0.6). </li><li> Spin a 6.4 kxg per 10 minuti a 4 ° C in un JA-20 del rotore, e risospendere in 1 ml freddi M2 (Tabelle 1-2) e trasferimento in una provetta 2 ml. </li><li> Spin a 15 kxg per 3 minuti in una provetta a pellet cellule, aspirare il surnatante, mettere il pellet sul ghiaccio, e risospendere in 900 ml di freddo M2. </li><li> Aggiungere 900 ml di PVP freddo rivestiti di silice colloidale e girare per 20 minuti a 15 kxg a 4 ° C in un microfonotubo rocentrifuge. </li><li> (Critico) Aspirare o pipettare dalla cima pedinato banda di cellule / predivisional e raccogliere il fondo swarmer banda in una nuova provetta. </li><li> Lavare le cellule due volte swarmer in 1 ml di freddo M2 mentre centrifugazione a 15 kxg per 3 min. </li><li> Prima della centrifuga finale, spostare le celle in un pre-raffreddata 1 ml provetta di vetro e misurare la OD 600 delle cellule rispetto ad un bianco di M2. </li><li> Risospendere il pellet cellulare finale in 28 ° C M2G ad un OD tra 0,3-0,4 e scuotere cellule / rotolo a 28 ° C. NOTA: i rendimenti tipici sono tra 2 e 4 ml di coltura cellulare swarmer. </li><li> Per gli esperimenti di microscopia, a intervalli di tempo desiderato posto 1 ml di cellule su un pad agarosio M2G per l&#39;imaging. </li></ol>

<ol><li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-level+design+of+bacterial+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">System-level design of bacterial cell cycle control.</a> FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+and+conservation+pattern+of+whole-cell+control+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry.</a> J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).</li>
<li>McAdams, H. H., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacterial+cell-cycle+regulatory+network+operating+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space.</a> Science. 301, 1874-1877 (2003).</li>
<li>Ptacin, J. L., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+bacterial+mitosis%3A+understanding+the+mechanism+of+ParA-mediated+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation.</a> Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).</li>
<li>Evinger, M., Agabian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Envelope-associated+nucleoid+from+Caulobacter+crescentus+stalked+and+swarmer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells.</a> J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).</li>
<li>Tsai, J. W., Alley, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+of+the+Caulobacter+McpA+chemoreceptor+is+cell+cycle+regulated+by+a+ClpX-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway.</a> J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).</li>
<li>Marks, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+laboratory+adaptation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus.</a> J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).</li>
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<li>Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+bacterial+DNA+replication+by+a+cell+cycle+regulatory+protein+that+binds+at+the+chromosome+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).</li>
<li>Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+directly+controlled+by+CtrA%2C+a+master+regulator+of+the+Caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).</li>
<li>Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+an+essential+bacterial+two-component+signal+transduction+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein.</a> Cell. 84, 83-93 (1996).</li>
<li>Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+Escherichia+coli+using+the+stringent+response%2C+with+fluorescence+labeling+assays+for+DNA+content+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication.</a> Methods. 48, 8-13 (2009).</li>
<li>Degnen, S. T., Newton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+replication+during+development+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus.</a> J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).</li>
<li>Bates, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+baby+cell+column%3A+a+novel+cell+synchronization+method+provides+new+insight+into+the+bacterial+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle.</a> Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).</li>
<li>Abel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-modal+distribution+of+the+second+messenger+c-di-GMP+controls+cell+fate+and+asymmetry+during+the+caulobacter+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle.</a> PLoS Genet. 9, e1003744(2013).</li>
<li>Johnson, R. C., Ely, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+spontaneously+derived+mutants+of+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus.</a> Genetics. 86, 25-32 (1977).</li>
<li>Britos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+response+to+carbon+starvation+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus.</a> PLoS One. 6, e18179(2011).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+logic+of+stringent+response+regulation+in+Caulobacter+crescentus%3A+starvation+signalling+in+an+oligotrophic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment.</a> Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il ciclo cellulare batterico è un processo fondamentale nella vita ed è importante per lo studio della crescita e come bersaglio per gli antibiotici di nuova generazione. Qui, abbiamo dettagliato le procedure di sincronizzazione rapida per C. crescentus NA1000, un organismo modello per lo studio del ciclo cellulare batterico e della divisione cellulare asimmetrica. Questo metodo è modificabile per il western blot, la profilazione dell'espressione genica e i saggi di microscopia a fluorescenza per studiare la re...

Il ciclo cellulare batterica controlla sia la replicazione del genoma e la divisione di cellule figlie. È importante sottolineare che, come la resistenza agli antibiotici è una crescente minaccia per la salute pubblica, il ciclo cellulare batterica presenta un obiettivo non sfruttata per lo sviluppo di antibiotici. In batterio Caulobacter crescentus, ogni ciclo cellulare porta ad una divisione asimmetrica, ottenendo due cellule figlie di sorti diverse (Figura 1A) 1,2. Una cellula figlia eredita un flagello ed è mobile, mentre l&#39;altra figlia eredita un gambo ed è sessile. Un circuito genetico integrato controlla la progressione del ciclo cellulare e destino cellulare da regolazione trascrizionale, fosfo-segnalazione, e proteolisi regolata 3. Inoltre, la replicazione dei cromosomi e cellule figlie rendimento segregazione simultanee che contengono esattamente una copia del cromosoma 4. È importante sottolineare che questi due tipi di cellule possono essere rapidamente separati da colloIdal particella di silice centrifugazione densità nel ceppo sincronizzabile NA1000 5-7 consente l&#39;isolamento delle cellule swarmer dal resto della popolazione con rese elevate (Figura 1B). Isolato swarmer cellule quindi procedere in modo sincrono attraverso la divisione cellulare asimmetrica. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo usato per la sincronizzazione Caulobacter ceppo NA1000. Forniamo protocolli e risoluzione dei problemi comuni sia larga e piccola scala sincronizzazioni. Questa procedura sperimentale fornisce un potente strumento per interrogare il controllo spazio-temporale del ciclo cellulare Caulobacter e il destino delle cellule.

<table><tbody><tr><td>Silice colloidale rivestita PVP (Percoll)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td></td></tr><tr><td>Silice colloidale (Ludox AS-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420840</td><td></td></tr><tr><td>JA10 Rotore</td><td>Beckman-Coulter</td><td>369687</td><td></td></tr><tr><td>JA20 Rotore</td><td>Beckman-Coulter</td><td>334831</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di chelato di solfato ferroso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0518</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 30 ml</td><td>Corning</td><td>8445</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>BDH9268-500G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

sincronizzazione di<em&gt; caulobacter crescentus</em&gt; per indagine del ciclo cellulare batterica

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Il ciclo cellulare è importante per la crescita, la replicazione del genoma e lo sviluppo in tutte le cellule. Nei batteri, gli studi sul ciclo cellulare si sono concentrati in gran parte su cellule non sincronizzate, rendendo difficile ordinare gli eventi temporali necessari per la progressione del ciclo cellulare, la replicazione del genoma e la divisione. Il Caulobacter crescentus fornisce un eccellente sistema modello per il ciclo cellulare batterico in base al quale le cellule possono essere rapidamente sincronizzate in uno stato G0 mediante centrifugazione per densità. Gli esperimenti di sincronizzazione del ciclo cellulare sono stati utilizzati per stabilire gli eventi molecolari che regolano la replicazione e la segregazione cromosomica, per mappare una rete di regolazione genetica che controlla la progressione del ciclo cellulare e per identificare la creazione di complessi di segnalazione polare necessari per la divisione cellulare asimmetrica. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la sincronizzazione rapida delle cellule di Caulobacter NA1000. La sincronizzazione può essere eseguita in un formato su larga scala per la profilazione dell'espressione genica e i saggi western blot, nonché in un formato su piccola scala per la microscopia o i saggi FACS. La rapida sincronizzabilità e l'elevata resa cellulare di Caulobacter rendono questo organismo un potente sistema modello per lo studio del ciclo cellulare batterico.

Sincronizzazione tipicamente produce due bande di cellule (Figura 1B): la banda swarmer, che ha una densità più elevata, e una banda cellulare pedinato / predivisional di densità inferiore. Per garantire la sincronizzazione efficiente controlli comuni comprendono il monitoraggio della OD 600 e misurando i livelli di proteina Ctra da Western Blot in distinte del ciclo cellulare punti di tempo. La OD 600 dovrebbe aumentare di circa 2 volte nel corso del ciclo cellulare (Figur...

La sincronizzazione delle cellule batteriche è essenziale per gli studi sul ciclo e lo sviluppo delle cellule batteriche. Il Caulobacter crescentus è sincronizzabile attraverso la centrifugazione per densità, consentendo uno strumento rapido e potente per lo studio del ciclo cellulare batterico. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la sincronizzazione delle cellule di Caulobacter.

Sincronizzazione di<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Per Indagine del ciclo cellulare batterica

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule nuotatrici di Coob Backer al fine di stabilire una coltura cellulare sincronizzata. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando una coltura mista di cellule Coob Backer, per poi arrestare brevemente la crescita sospendendo le cellule in un mezzo freddo mediante Resus. Il secondo passaggio consiste nel separare le cellule nuotatrici mediante centrifugazione a densità differenziale.Il passaggio successivo consiste nel risospendere le cellule a nuoto in un mezzo caldo, il che permette alle cellule di entrare nel ciclo cellulare. Infine, le cellule a nuoto isolate possono essere seguite durante tutto il ciclo cellulare mediante saggi biochimici o microscopia. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la macchina per cellule figlie, è che le cellule possono essere isolate rapidamente e amplificate in quantità sufficienti per studi biochimici.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come ad esempio quali fattori controllano la segregazione dei cromosomi e il ciclo di divisione cellulare asimmetrica. Per iniziare, inoculare cinque millilitri di mezzo PYE con batteri provenienti da una piastra del ceppo colo backer CSIS, NA 1000. Far crescere la coltura per tutta la notte a 28 gradi Celsius con agitazione; il giorno successivo, trasferire 0,5 millilitri della coltura notturna in un matraccio contenente 25 millilitri di mezzo M2G ed agitare il matraccio a 28 gradi Celsius finché la coltura non raggiunge una densità ottica compresa tra 0,5 e 0,6.Successivamente, diluire la coltura in un litro di mezzo M due G per ottenere la densità ottica iniziale desiderata e agitare il matraccio a 28 gradi Celsius. Quando la densità ottica della coltura raggiunge 0,5, pipettare un microlitro della coltura su un vetrino, quindi coprire il liquido con un coprioggetto. Acquisire le immagini delle cellule mediante microscopia a contrasto di fase per confermare la presenza di cellule nuotanti rapidamente. Trasferire la coltura in un tubo da centrifuga sterile e quindi centrifugare le cellule a 7.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, scartare le cellule leggermente pellettizzate versando il soprannatante e aggiungere 180 millilitri di mezzo M due freddo. Utilizzare una pipetta sierologica per risospendere delicatamente le cellule. Quindi aggiungere 60 millilitri di soluzione fredda di silice colloidale alla sospensione cellulare e mescolare bene.Versare la sospensione cellulare in otto provette da 30 millilitri e centrifugare a 6.400 ×g per 30 minuti. Impostare a quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente le provette dalla centrifuga e controllare la presenza di due bande distinte nella provetta.La banda inferiore contiene le cellule nuotatrici e le cellule pre-divisionali si trovano nella banda superiore. Successivamente, aspirare con attenzione la banda superiore e il liquido fino a circa un centimetro sopra la banda inferiore. Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere la banda di nuoto e trasferirla in una provetta pulita.Riempire il tubo con mezzo M due freddo e quindi centrifugare il tubo per eliminare la silice colloidale. Successivamente, eliminare con attenzione il soprannatante e risospendere le cellule in 20 millilitri di mezzo M due freddo; centrifugare nuovamente per ottenere il pellet cellulare. Risospendere quindi i pellet in 30 millilitri di mezzo M due freddo e misurare l'assorbanza del sospensione.Posizionare un microlitro della sospensione cellulare su un vetrino da microscopia e utilizzare l'immagine di fase per verificare la presenza di cellule a nuoto. Successivamente, centrifugare le cellule e risospendere il pellet in mezzo M due G fino a un'assorbanza ottica compresa tra 0,3 e 0,4. Incubare la coltura con agitazione a 28 gradi Celsius per analisi di immunoblotting o espressione genica.Prelevare aliquote di un millilitro ogni 10-30 minuti per circa 140 minuti, fino a quando la densità ottica della coltura raddoppia. Utilizzare una centrifuga da banco per pellettizzare le cellule per 30 secondi, quindi aspirare rapidamente il mezzo. Congelare i pellet cellulari in azoto liquido e conservarli a -80 °C per sincronizzazioni su piccola scala. Inoculare cinque millilitri di mezzo M2G con 1000 cellule NA e coltivare le cellule durante la notte con agitazione a 28 °C il giorno successivo.Diluire la coltura in 15 millilitri di mezzo M due G e far crescere le cellule fino a quando la densità ottica è compresa tra 0,5 e 0,6. Centrifugare le cellule, quindi risospendere il pellet in un millilitro di mezzo M due freddo. Trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga da due millilitri, pellettizzare le cellule mediante centrifugazione ed aspirare il sopranatante.Quindi posizionare il tubo sul ghiaccio e risospendere il pellet cellulare in 900 microlitri di mezzo M due freddo. Successivamente, aggiungere 900 microlitri di silice colloidale rivestita con PVP fredda e centrifugare il tubo per 20 minuti. Aspirare con attenzione la banda superiore di cellule pre-divisionali e quindi raccogliere la banda inferiore di cellule nuotatrici in un nuovo tubo da microcentrifuga.Lavare le cellule swarmer due volte in un millilitro di mezzo M2 freddo, centrifugando per tre minuti tra ogni lavaggio, subito prima della centrifugazione finale. Collocare la sospensione cellulare in un tubo di vetro da un millilitro preraffreddato e misurare la densità ottica delle cellule. Successivamente, trasferire le cellule in una provetta microcentrifuga e centrifugare dopo la centrifugazione.Reese, sospendere il pellet cellulare finale nel mezzo M due G preriscaldato a una densità ottica compresa tra 0,3 e 0,4 e agitare le cellule a 28 gradi Celsius. Se si desidera effettuare una microscopia, depositare un microlitro della coltura su un disco aeros M due G nei punti temporali appropriati. Una centrifugazione a gradiente di densità su una coltura asincrona produce due bande di cellule.La banda inferiore contiene cellule swarmer, che hanno una densità maggiore, mentre la banda superiore contiene cellule ripiene e pre-divisionali, che hanno una densità minore. La densità ottica della coltura aumenta di circa due volte nel corso del ciclo cellulare. Durante questo periodo, le cellule swarmer si differenziano in cellule ripiene, le quali poi si replicano e subiscono divisione cellulare asimmetrica.Con ogni divisione che genera una nuova cellula nuotatrice e la cellula madre ripiena, un'analisi di Western blot per il regolatore principale del ciclo cellulare CTRA costituisce un controllo utile per verificare la sincronizzazione; CTRA blocca la replicazione del DNA nelle cellule nuotatrici e viene degradato al momento della replicazione del DNA. CTRA viene quindi sintetizzato nuovamente in una fase successiva del ciclo cellulare, impedendo la re-iniziazione della replicazione del DNA e attivando la trascrizione di numerosi geni dello sviluppo. Questo andamento oscillante dei livelli proteici di CTRA indica una sincronia riuscita.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sincronizzare cellule callback o NA 1000 per studiare il ciclo cellulare batterico. Questa procedura di sincronizzazione cellulare può essere eseguita in uno o due ore se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione della procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente.

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Sincronizzazione delle colture cianobatteriche e compattazione del DNA guidate da cicli luce-buio

Capire la funzione dei processi essenziali nei batteri è complesso. Microscopia a fluorescenza con target-specifici coloranti possa fornire spunti preziosi per progressione di crescita e ciclo cellulare delle cellule microbiche. Qui, Agrobacterium tumefaciens è usato come un batterio modello per evidenziare i metodi per l'imaging di cellule vive per la caratterizzazione dei processi essenziali.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Le cellule batteriche sono spazialmente altamente organizzate. Per seguire questa organizzazione nel corso del tempo in lenta crescita xanthus di Myxococcus cellule, è stato sviluppato un set-up per l'imaging di cellule vive di fluorescenza ad alta risoluzione spazio-temporale sopra parecchie generazioni. Utilizzando questo metodo, potrebbe essere determinato spatiotemporal dinamica di proteine importanti per la segregazione del cromosoma e la divisione cellulare.

Imaging di fluorescenza Live-cella del completo ciclo cellulare vegetativo della lenta crescita sociale batterio xanthus di Myxococcus

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Questo lavoro presenta un metodo di microscopia che consente l'imaging vivo di una singola cellula di Escherichia coli per l'analisi e la quantificazione del comportamento stocastico dei circuiti genetici sintetici.

Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia Coli utilizzando la microscopia time-lapse

Molti batteri usano la motilità guidata dalla flagella per navigare nel loro ambiente e colonizzare un ambiente favorevole sia individualmente che collettivamente. Qui è dimostrato l'uso di tre metodi consolidati che sfruttano la motilità come strumento di selezione per identificare componenti / percorsi che contribuiscono al nuoto e alla motilità brulicante.

Investigare la motilità guidata dalla Flagella in Escherichia coli applicando tre tecniche consolidate in una serie

La persistenza degli antibiotici descrive la capacità di piccole sottopopolazioni all'interno di una popolazione isogena sensibile di tollerare transitoriamente alte dosi di antibiotici battericidi. Il presente protocollo combina approcci per caratterizzare il fenotipo di persistenza antibiotica a livello molecolare e cellulare dopo aver esposto Escherichia coli a dosi letali di ofloxacina.

Analisi di popolazione e monocellulare della persistenza antibiotica in Escherichia coli

Una sfida nell'analizzare gli esperimenti sincronizzati di serie temporali è che gli esperimenti spesso differiscono nella durata del recupero dalla sincronia e nel periodo del ciclo cellulare. Pertanto, le misurazioni di diversi esperimenti non possono essere analizzate in forma aggregata o facilmente confrontate. Qui, descriviamo un metodo per allineare gli esperimenti per consentire confronti specifici di fase.

Allineamento di dati di serie temporali sincronizzati utilizzando il modello caratterizzante della perdita di sincronia del ciclo cellulare per confronti cross-experiment

Impara a sincronizzare Caulobacter crescentus per studiare il ciclo cellulare batterico usando centrifugazione a densità differenziale. Questo metodo consente di isolare rapidamente cellule swarmer per saggi biochimici e microscopia.

Sincronizzazione di

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