Sincronizzazione di Caulobacter crescentus Per Indagine del ciclo cellulare batterica

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule dello sciame Coob backer al fine di stabilire una coltura cellulare sincronizzata. Ciò si ottiene coltivando prima una coltura mista di cellule sostenitrici del coob, e poi arrestando brevemente la crescita sospendendo le cellule in mezzo freddo. Il secondo passo consiste nel separare le celle dello sciame attraverso la centrifugazione a densità differenziale.

Il passo successivo consiste nel risospendere le cellule dello sciame in un mezzo caldo, che consente alle cellule di entrare nel ciclo cellulare. Infine, le cellule dello sciame isolate possono essere seguite durante tutto il ciclo cellulare utilizzando saggi biochimici o microscopia. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la macchina per cellule baby, è che le cellule possono essere isolate rapidamente e ingrandire quantità sufficienti per gli studi biochimici.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come ad esempio cosa controlla la segregazione cromosomica e il ciclo di divisione cellulare asimmetrico. Per iniziare, inoculare cinque millilitri di terreno PYE con batteri da una piastra di ceppo CSIS sostenitore del colo, NA 1000. Far crescere la coltura durante la notte a 28 gradi Celsius con agitazione il giorno successivo, trasferire 0,5 millilitri di coltura notturna in un pallone contenente 25 millilitri di mezzo M due G e agitare il pallone a 28 gradi Celsius fino a quando la coltura raggiunge una densità ottica compresa tra 0,5 e 0,6.

Quindi, diluire la coltura in un litro di terreno M due G per ottenere la densità ottica iniziale desiderata e agitare il pallone a 28 gradi Celsius quando la densità ottica della coltura raggiunge 0,5, pipettare un microlitro di coltura su un vetrino, quindi coprire il liquido con un vetrino coprioggetti. Visualizzare le cellule mediante microscopia di fase per confermare la presenza di cellule a sciame che nuotano rapidamente. Trasferire la coltura in una provetta da centrifuga sterile e quindi centrifugare le cellule a 7.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, scartare le celle leggermente pellettate quando si versa il surnatante e aggiungere 180 millilitri di terreno freddo M two. Utilizzare una pipetta sierologica per risospendere delicatamente le cellule. Quindi aggiungere 60 millilitri di soluzione fredda di silice colloidale alla sospensione cellulare e mescolare bene.

Versare la sospensione cellulare in otto provette da 30 millilitri e centrifugarle a 6, 400 volte G per 30 minuti. Impostare quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente le provette dalla centrifuga e controllare che la provetta non presenti due bande distinte.

La banda inferiore contiene le cellule dello sciame e le cellule predivisionali si trovano nella banda superiore. Quindi, aspirare con cura la fascia superiore e il liquido fino a circa un centimetro sopra la fascia inferiore. Utilizzare una pipetta per pasta per rimuovere la banda dello sciame e trasferirla in una provetta pulita.

Riempire la provetta con mezzo M two freddo e quindi centrifugare la provetta per lavare via la silice colloidale. Quindi, scartare con cura il surnatante e risospendere le cellule in 20 millilitri di centrifuga fredda M two medium. Sempre per pellettare le celle, risospendere i pellet in 30 millilitri di mezzo freddo M due, e poi misurare la densità ottica della sospensione.

Posizionare un microlitro di sospensione cellulare su un vetrino da microscopio e utilizzare l'imaging di fase per verificare la presenza di cellule dello sciame. Successivamente, centrifugare le cellule e risospenderle in mezzo M due G a una densità ottica compresa tra 0,3 e 0,4. Incubare la coltura con agitazione a 28 gradi Celsius per saggi di trama occidentale o di espressione genica.

Rimuovere un millilitro di aliquote ogni 10-30 minuti per circa 140 minuti fino a quando la densità ottica della coltura raddoppia. Utilizzare una centrifuga da tavolo per far girare le celle per 30 secondi, quindi aspirare rapidamente il flash medio. Congelare i pellet cellulari in azoto liquido e conservarli a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per la sincronia su piccola scala, inoculare cinque millilitri di terreno M due G con cellule NA 1000 e far crescere le cellule durante la notte con agitazione a 28 gradi Celsius il giorno successivo.

Diluire la coltura in 15 millilitri di terreno M due G e far crescere le cellule fino a quando la densità ottica è compresa tra 0,5 e 0,6. Centrifugare le cellule e poi risospenderle in un millilitro di terreno M due freddo. Trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da due millilitri, pellettare le cellule mediante centrifugazione e aspirare il supponante.

Quindi posizionare il tubo sul ghiaccio e risospendere il pellet cellulare in 900 microlitri di terreno M due freddo. Quindi, aggiungere 900 microlitri di silice colloidale rivestita di PVP a freddo e centrifugare la provetta per 20 minuti. Aspirare con cautela la banda di celle predivisionali superiore e quindi raccogliere la banda dello sciame inferiore in una nuova provetta per microcentrifuga.

Lavare le celle dello sciame due volte in un millilitro di terreno freddo M due mentre centrifugano per tre minuti tra ogni lavaggio subito prima della centrifuga finale. Posizionare la sospensione cellulare in una provetta di vetro da un millilitro pre-raffreddata e misurare la densità ottica delle cellule. Quindi trasferire le cellule in una provetta per microfusibile e centrifugare dopo la centrifusione.

Reese, sospendere il pellet finale della cella in terreno di preriscaldamento M due G a una densità ottica compresa tra 0,3 e 0,4 e agitare le celle a 28 gradi Celsius. Se si desidera la microscopia, posizionare un microlitro di coltura su un tampone aerosico M due G nei punti temporali appropriati. La centrifugazione a densità differenziale di una coltura asincrona produce due bande di cellule.

La banda inferiore contiene le cellule swarmer, che hanno una densità maggiore, e la banda superiore contiene le cellule stoccate e pre-divisionali, che hanno una densità inferiore. La densità ottica della coltura aumenta di circa il doppio durante il corso del ciclo cellulare. Durante questo periodo, le cellule dello sciame si differenziano in cellule immagazzinate, le cellule immagazzinate si replicano e subiscono una divisione cellulare asimmetrica.

Con ogni divisione che produce una nuova cellula swarmer e la cellula madre immagazzinata, un western blot per il regolatore principale del ciclo cellulare CTRA è un controllo utile per verificare la sincronizzazione, CTRA blocca la replicazione del DNA nelle cellule swarmer e viene degradato dopo la replicazione del DNA. Il CTRA viene quindi sintetizzato più tardi nel ciclo cellulare impedendo il riavvio della replicazione del DNA e attivando la trascrizione di molti geni dello sviluppo. Questo modello oscillante dei livelli di proteina CTRA indica una sincronia di successo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sincronizzare il callback o le cellule NA 1000 per studiare il ciclo cellulare batterico. Questa procedura di sincronizzazione delle celle può essere eseguita in una o due ore se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura è importante ricordare di lavorare rapidamente.