Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose Medicago truncatula

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è dimostrare quanti embrioni di tula cargo possono essere ottenuti in diversi stadi di sviluppo per studiare la regolazione genetica dell'embriogenesi nelle piante, questo può essere ottenuto collegando la morfologia del baccello con i diversi stadi di sviluppo dell'embrione zigotico e coltivando l'explan fogliare per ottenere embrioni somatici nei diversi stadi. In definitiva, la PCR quantitativa e la beta glucuronidasi possono essere utilizzate per valutare l'espressione dei geni durante l'embriogenesi nelle specifiche fasi di sviluppo di interesse. I vantaggi di queste tecniche sono che l'etichettatura dei singoli fiori non è richiesta per gli esperimenti in vivo, e sono procedure ottimizzate in vitro, forniscono approcci sperimentali complementari.

La dimostrazione visiva della procedura di coltura è importante perché consente di seguire più da vicino i dettagli delle manipolazioni. A dimostrare la procedura in vivo sarà Wang mentre Kim Nolan dimostrerà la procedura in vitro. Per facilitare lo sviluppo dell'embrione zigotico, forare la superficie dei rivestimenti dei semi di una pianta trinoculare Monte cargo e immergere i semi per una notte, completamente coperti d'acqua.

Il giorno successivo, semina tre semi in ciascuno dei 10 vasi da 15 centimetri di diametro in un terriccio e trasferisci i vasi in una casa di vetro. Coltiva le piante in un periodo fotografico di 14 ore con una temperatura da 23 a 19 gradi Celsius giorno e notte, conservando le piantine più sane dopo la germinazione in modo che ci sia una pianta per vaso e circondando le piantine con un traliccio per far arrampicare gli steli delle piante quando compaiono i baccelli. Raccogliere nelle fasi appropriate descritte nella tabella uno e nella figura uno per ottenere la fase di sviluppo embrionale precoce desiderata.

Quindi, usa una pinza per isolare i les dai baccelli. In alternativa, per una microscopia più raffinata, completamente chiara nella soluzione di Hoyer, gli stadi embrionali possono essere confermati mediante imaging degli embrioni con un microscopio composto standard. Quindi raccogliere il numero di UL necessario per l'esperimento dalla regione centrale del pod e conservarlo alla temperatura appropriata per l'analisi a valle per lo sviluppo dell'embrione somatico.

Raccogli in vitro le foglioline dall'ultima foglia di tate, quasi completamente espansa, di uno stelo allungato di una cultivar tran atula che è in grado di formare facilmente embrioni in coltura. Conserva le foglie di tate su carta assorbente umida in un vaso di coltura per evitare la disidratazione. Quindi, lavorando in una cabina di biosicurezza sterilizzata con raggi UV, ho posizionato le foglie nella palla a rete di un infusore per tè primaverile in autoclave.

Un infusore immerso in etanolo al 70% in un'autoclave tappo a vite da 250 millilitri. Vaso di coltura in policarbonato dopo 30 secondi, scolare il tessuto fogliare e quindi immergere l'infusore in una soluzione di candeggina diluita da uno a otto per 10 minuti. Con un leggero vortice di tanto in tanto, agitare delicatamente la pentola e scolare l'acqua in eccesso.

Quindi risciacquare l'infusore. Ancora una volta in acqua fresca deionizzata in una pentola nuova. Ora usa una pinza sterile per trasferire le foglie dall'infusore del tè in una coltura fresca, una pentola di acqua distillata deionizzata sterile, avvita il tappo sterile.

Quindi sciacquare le foglie per inversione e roteandole. Quindi lasciare che i lembi galleggino sull'acqua sterile per placcare gli impianti. Rifilare i bordi dei singoli foglietti sterilizzati utilizzando la tecnica sterile.

Quindi tagliare il rettangolo rimanente in due o tre, da otto a 10 per tre o cinque millimetri rettangolari explan con la vena centrale al centro di ciascuna piastra X explan. Sei espianti per agar terreno di coltura solidificato con un diametro di nove centimetri. Piastre di Petri con il sigillo ABA rivolto verso il basso per mantenere il consueto orientamento dell'anta.

Quindi sigillare le piastre di Petri con perfil e incubare le piastre al buio a 28 gradi Celsius in una stanza a temperatura controllata. Dopo tre settimane, utilizzare una spatola sterile in acciaio inossidabile e una pinza per sottocoltura gli espianti del foro di differenziazione su terreno fresco. I primi embrioni dovrebbero essere osservati in circa quattro settimane poiché si verifica il callosità e il callo supera le dimensioni dell'esemplare più grande mostrato qui.

Trasferire solo il 50% del callo individuale quando la sottocoltura su un terreno fresco. Infine, utilizzare uno stereomicroscopio per raccogliere i diversi stadi embrionali in un periodo di incubazione da quattro a otto settimane, elaborando gli espianti in base agli obiettivi sperimentali. Dopo aver raccolto embrioni zigotici, come appena dimostrato a valle in C, possono essere impiegate due ibridazioni o altre strategie appropriate di particolare interesse, come dimostrato in queste immagini, la distintività di SSIS e Spencer può essere osservata seguendo i piani a X placcati.

Durante la quarta o l'ottava settimana è possibile localizzare e prelevare embrioni somatici in fasi discrete per un'analisi immediata. Ad esempio, questi dati illustrano come gli embrioni allo stadio iniziale di oleina mostrino l'espressione di un tipo di gene medicago Tula eoin, ma non di un altro. Un vantaggio particolare del sistema embrionale somatico è che la trasformazione del callo può essere effettuata senza rigenerare un'intera pianta.

Infatti, come dimostrato qui. La beta glucuronidasi può essere utilizzata per visualizzare l'espressione genica nelle diverse fasi dell'embriogenesi. Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come selezionare e dissezionare il pod per ottenere Andres.

Dovresti anche avere una buona comprensione di come preparare e impiattare l'explan sterile per l'embriogenesi somatica dopo il loro sviluppo. Queste tecniche hanno permesso di studiare la regolazione della trascrizione delle prime fasi dell'embriogenesi in relazione alla crescita embrionale, allo sviluppo e all'immagazzinamento dei nutrienti.