Name: Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Impara i protocolli per ottenere embrioni zigotici e somatici in Medicago truncatula per studiare la regolazione genetica dell'embriogenesi precoce. Questo metodo facilita la ricerca sullo sviluppo vegetale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questa ricerca è stata supportata dall'Australian Research Council grant CEO348212 e dall'Università di Newcastle. Si riconosce l'assistenza del Dr. Sam Zhang.

1. Zygotic Sviluppo embrionale <ol><li> Impianto Materiale <ol><li> Far crescere la Medicago truncatula wild type Jemalong o il suo vicino isogenico, altamente ri-generabile genotipo Jemalong 2HA 13 (noto come 2HA) in una serra con un fotoperiodo 14 ore e 23 ° C / 19 ° C di temperatura giorno / notte. <ol><li> Pierce la superficie del rivestimento del seme (con un ago G 23) prima di seminare il seme in modo che l&#39;acqua è permesso di entrare il seme e ammollo in acqua durante la notte. Aggiungere acqua sufficiente a coprire interamente il seme. </li><li> Seminare 3 semi in ogni 15 centimetri pentola diametro (totale di 10 vasi) in miscela di impregnazione (grossa sabbia, perlite, fibra di cocco-peat (1: 1: 1) più 5 g di Osmocote standard Exact: concime a lenta cessione) e trasferimento serra. Conservare la piantina più sano dopo la germinazione per cui vi è 1 pianta per vaso e surround un traliccio per l&#39;impianto nasce a salire. </li></ol></li></ol></li><li> Baccelli raccolta <ol><li> Raccogliere baccelli del wtipo ild Jemalong o 2HA per ottenere le opportune fasi embrione precoce come prima descritto 9. NOTA: Le diverse fasi pod sono mostrati in figura 1 e le fasi embrionali corrispondenti sono mostrati nella Figura 2. </li><li> Verificare le diverse fasi pod al momento della raccolta in base a criteri come da tabella 1. Misurare il tempo trascorso dallo stadio 6 per aiutare fasi distinte 6 e 7 (Tabella 2). </li></ol></li><li> Dissezione ovuli da baccelli e controllando la fase embrionale <ol><li> Isolare ovuli da cialde utilizzando una pinza sottile da solo o un microscopio da dissezione stereo e pinze, se necessario. Se necessario, la fase embrionale può essere rapidamente controllata usando un microscopio composto standard (Figura 3B). </li><li> Preparare modificato soluzione di Hoyer contenente 7,5 g gomma arabica, 100 g di cloralio idrato, 5 ml di glicerolo, 60 ml di acqua distillata deionizzata. Sciogliere mescolando per 3-5 ore o durante la notte. </li><li> Per ulteriori affinared microscopia cancellare gli ovuli sezionato in soluzione 15,16 modificata di Hoyer. Prendere con cautela ovuli intatti e posto in un piccolo volume di soluzione di Hoyer (sufficiente a coprire l&#39;ovulo) a temperatura ambiente fino chiaro. </li><li> Guarda i campioni con contrasto interferenziale differenziale (DIC) ottica. Catturare le immagini iwth una fotocamera digitale 9 (Figura 2). </li><li> Ottenere gli ovuli più uniformi dalla regione centrale del baccello e accumulare il numero desiderato. Un esempio è mostrato in Figura 3A. Raccogliere gli ovuli su ghiaccio e conservare a temperatura desiderata (acidi -80 ° C per nucleici) per ulteriori analisi. NOTA: Per i dettagli sulla analisi delle sezioni istologiche, microscopia elettronica a trasmissione, e ibridazione in situ consultare documenti 8,9. </li></ol></li></ol> 2. Somatic sviluppo embrione in vitro <ol><li> Utilizzare un M. truncatula cultivar tcappello è in grado di formare facilmente embrioni in coltura. Per questo protocollo per espianti fogliari utilizzare le piante 2HA 13,17 che sono 2-4 mesi di età. </li><li> Prendere volantini dall&#39;ultima foglia trifogliato quasi completamente ampliata di uno stelo allungamento. </li><li> Mantenere le foglie trifogliolate su carta umida spugna in una pentola coltura per evitare la disidratazione. NOTA: Una volta che le foglie trifogliolate vengono raccolti hanno bisogno di essere utilizzato con un ritardo minimo. </li><li> Preparazione del terreno di coltura <ol><li> Utilizzare il P4 10: 4: 1: 5 medie agar (0,8% w: v) in 9 piatti cm Petri. NOTA: Il P4 10: 4: 1: 5 media consiste mezzo P4 basale 18 più 10 mM di acido 1-naftalenacetico (NAA), 4 mM 6-benzilaminopurina (BAP), 1 mM di acido abscissico (ABA) e 5 mM gibberellico Acido (GA). L&#39;uso di GA + ABA accelera la formazione dell&#39;embrione e provoca un aumento sostanziale nel numero di embrioni 14. </li><li> Portare il supporto basale P4 in 1 L; costituito da importanti sali (fare Calcium separatamente), sali e vitamine minori (Tabella 3), di ferro chelato (make up a parte), Casamino acidi (caseina idrolizzato), 30 g di saccarosio, 8 g di agar. </li><li> Conservare le soluzioni stock di grandi sali, calcio, acidi, sali Casamino minori e vitamine a -20 ° C in aliquote adatti. Conservare ferro chelato a 4 ° C. </li><li> Portare il ferro chelato (200x) sciogliendo 7,44 g di Na 2 EDTA • 2H 2 O in circa 900 ml di acqua distillata deionizzata agitando, quindi portare la soluzione a 98-99 ° C durante l&#39;aggiunta di 1.853 g di FeSO 4 • 7H 2 O. Infine portare a 1 L quando gli ingredienti sono sciolti. Conservare in ambra bottiglie a 4 ° C colorato. </li><li> Portare il mezzo basale P4 con le soluzioni madre come in Tabella 4. Gli ormoni nel mezzo sono 10 pM NAA, 4 mM BAP, 1 pM ABA, 5 mM GA (vedere Tabella 4 e Materiali specifici Tabella). Aggiungere la NAAe BAP prima autoclave e aggiungere ABA e GA dopo autoclavaggio e raffreddamento a circa 55 ° C, per mezzo del filtro di sterilizzazione con un filtro di 0,22 micron attaccato ad una siringa. Mescolare bene agitando delicatamente. </li><li> Regolare i media a pH 5,8 con 1 M KOH prima della sterilizzazione in autoclave. Autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Dopo autoclave aggiungere il filtro ABA sterilizzato e GA, e versare circa 25 ml di media in sterili 9 centimetri piastre di Petri in una cappa a flusso laminare o un armadietto a rischio biologico. Fresco e lasciare che l&#39;agar impostato con il coperchio. Poi mettere il coperchio e assicurarsi che non vi è alcuna condensa sul coperchio. Etichetta come richiesto e conservare a 4 ° C (in una scatola di cartone per evitare che il coperchio di condensa). </li></ol></li><li> Sterilizzazione di Leaf Tissue <ol><li> Lavorare in una cappa a flusso laminare-UV sterilizzati o armadio rischio biologico. </li><li> Inserire lascia in palla maglie di una precedenza autoclavato tè primavera infusore. </li><li> Immergere tè infusore contenente le foglie nel 70% (v: v) di etanolo in un culpentola ture per 30 sec. NOTA: per tutti i passaggi di questa procedura usa da 250 ml con tappo a vite pentole cultura policarbonato che vengono sterilizzati in autoclave. </li><li> Scolare e poi trasferire e immergere il tessuto fogliare in 1: 8 (v: v) candeggina diluita (0,5% cloro) per 10 min. Agitare delicatamente di tanto in tanto. </li><li> Scolare la candeggina e trasferire l&#39;infusore tè in una pentola di coltura contenente acqua distillata deionizzata sterile. Agitare delicatamente e drenare l&#39;acqua in eccesso. Ripetere ancora una volta con una cultura pentola fresco di acqua distillata deionizzata sterile. </li><li> Togliere le foglie dalla infusore tè con pinza sterile a una cultura pentola fresco di acqua distillata deionizzata sterile. Avvitare il tappo sterile e lavare capovolgendo e vorticoso. Lascia foglie galleggianti in acqua sterile fino al momento di preparare espianti. </li></ol></li><li> Preparazione e placcatura espianti <ol><li> Usando tecniche sterili, tagliare singoli depliant sterilizzati dal bordo con un bisturi, e tagliare il rettangolo rimanenti in due o three espianti rettangolari (8-10 x 3-5 mm) con la metà vena del centro di ogni espianto (Figura 5A). NOTA: La dimensione del espianto è molto importante nell&#39;avvio del prima formazione del callo. Effettuare il taglio sui coperchi sterili da contenitori di cibo take-away. </li><li> Piastra 6 espianti di agar-solidificato terreno di coltura in 9 cm di diametro di Petri (Figura 5B). Piatto il espianti lato abaxial giù per mantenere consueto orientamento foglia. </li><li> Sigillare le piastre di Petri con Parafilm (Figura 5C) allungate intorno al piatto. Il tessuto è ora pronto per l&#39;incubazione. </li></ol></li><li> Tissue Incubazione <ol><li> Incubare le piastre al buio a 28 ° C in un ambiente a temperatura controllata o armadio crescita durante il periodo di coltura. NOTA: Le espianti avvieranno dedifferenziazione, subire la divisione cellulare, la proliferazione (formazione del callo) e embriogenesi (differenziazione). </li><li> Sottocultura il fornire i chiarimenti di differenziazionenti dopo 3 settimane a mezzo fresco. A questo subcultura trasferire l&#39;intera espianto usando una spatola inox sterili e pinze, in una cappa a flusso laminare o un armadietto rischio biologico. Come avviene formazione del callo e il callo supera la dimensione del più grande in figura 5C, trasferire il 50% del callo specifico quando subcoltura terreno fresco. </li><li> Osservare i primi embrioni in circa 4 settimane. Mentre vi è un grado di sincronia, raccogliere diverse fasi di embrione in un periodo di incubazione di 4-8 settimane (Figura 6A, B). Raccogliere sotto un microscopio e di processo dissezione in funzione degli obiettivi sperimentali. </li><li> Sottocultura ogni 3 settimane e rimuovere periodicamente embrioni in modo che gli espianti continueranno a produrre embrioni per 3 mesi. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li>
<li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes%3A+importance+and+constraints+to+greater+use%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li>
<li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li>
<li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li>
<li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li>
<li>Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies%3A+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li>
<li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li>
<li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Botany%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li>
<li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li>
<li>Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+across+kingdoms%3A+regeneration+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li>
<li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li>
<li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis%2C+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).</li>
<li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li>
<li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+%28SERK1%29+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li>
<li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIantcheva%2C+A+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.noble.org/MedicagoHandbook">http://www.noble.org/MedicagoHandbook</a> (2006).</li>
<li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOchatt%2C+SJ+%22Plant+Embryo+Culture%3A+Methodsand+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).</li>
<li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

I protocolli descritti sono relativamente semplice e permettono indagini dell&#39;embriogenesi legume con tutta la cellula contemporanea e tecniche molecolari. Si riconosce che ci sono vantaggi e svantaggi di entrambi in vivo e in vitro approcci. Entrambi permettono maggiore attenzione per embriogenesi precoce rispetto alla cultura dei semi immaturi 19. Nel caso di studi in vivo quanto descritto è prevalentemente l&#39;isolamento dell&#39;ovulo dal bacce...

I legumi sono la terza più grande famiglia di piante superiori con circa 20.000 specie e la (o Fabaceae) famiglia delle leguminose sono secondi a cereali in superficie coltivata e produzione totale 1. La soia è la terza più grande coltivato. Legumi granella forniscono circa un terzo delle proteine ​​alimentari e un terzo di olio vegetale per il consumo umano 2. Legumi con la loro capacità di fissaggio N 2 contribuiscono a sistemi agricoli sostenibili. Medicago truncatula, come la soia, i negozi di proteine ​​e olio nelle cotiledoni di suoi semi ed è un modello di legume genetica e genomica, con notevoli risorse genetiche e genomiche 3,4. Mentre M. truncatula ha consentito progressi nella comprensione del legume-rhizobium simbiosi 4 è stato sempre impiegato per studiare sementi di leguminose biologia 5-7 e embriogenesi 8,9. Arabidopsis embriogenesi è stato ampiamente studiato 10,11 ma isa non legume ei dettagli dell&#39;embriogenesi non sono identici a Medicago 8,10. Zigotica in M. truncatula ha caratteristiche interessanti, con un ipofisi multicellulare distintivo, un suspensor endoployploid e cellule basali trasferimento 8. Embriogenesi somatica (SE) è comunemente utilizzato per la rigenerazione piante 12. Nel modello legume M. truncatula, la linea seme Jemalong 2HA (2HA) è stato sviluppato dal genitore Jemalong di avere alti tassi di embriogenesi somatica 13. Il numero di embrioni prodotti è stata recentemente sostanzialmente aumentato aggiungendo sia l&#39;acido gibberellico (GA) e l&#39;acido abscissico (ABA) al mezzo di lunga data 14. In questo caso, GA e ABA agiscono in sinergia, che è inusuale visto che GA e ABA di solito agiscono antagonisticamente 14. Gli embrioni ottenuti da callo sviluppano sulla superficie che permette la fase dell&#39;embriogenesi per essere facilmente determinata Visually e prontamente raccolto. Avendo in prossimità di linee isogeniche che sono embryogenic (2HA) e non-embriogenetica (Jemalong) facilita l&#39;indagine di embriogenesi somatica e avendo sia in vivo che in vitro sistemi fornisce diverse possibilità sperimentali. La comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo embrionale è essenziale per le sementi di comprensione e lo sviluppo delle piante. In legumi, come in altre dicotiledoni, sono i cotiledoni dell&#39;embrione che immagazzinare i prodotti che vengono utilizzati per l&#39;alimentazione umana. Embriogenesi precoce coinvolge rapida divisione cellulare, e corretta patterning dell&#39;embrione. In circa 8 giorni dopo la fecondazione, la M. truncatula embrione raggiunge stadi cotyledon iniziali. La caratterizzazione morfologica non è esattamente indicato da giorni dopo la fecondazione in condizioni serra. Così, un approccio standardizzato efficace per indicare la fase di embrioni in via di sviluppo è prezioso per lo studio della genetica regulzione del primo zigotica. In questo lavoro, mettiamo a disposizione due protocolli standardizzati per raccogliere embrioni in via di sviluppo per gli studi biologici della embriogenesi nel modello legume M. truncatula. Il primo è quello di raccogliere gli embrioni zigotici associando embriogenesi e pod morfologia mentre il secondo è embriogenesi somatica via espianti fogliari coltura di fornire un gran numero di embrioni facilmente accessibili.

<table><tbody><tr><td>P4 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Utilizzare Sigma-Aldrich Chemicals o altro fornitore di grado analitico</td></tr><tr><td>Sali</td><td></td><td></td><td></td>principali</tr><tr><td>Sali minori Vitamine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Ormoni</td><td></td><td></td><td></td>vegetali</tr><tr><td>1- Acido naftaleneacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Sciogliere in piccola quantità di 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Acido abscissico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Sciogliere in piccola quantità di 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-benzilamminopurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Sciogliere in acqua MQ con riscaldamento e poche gocce 1N HCl</td></tr><tr><td>Acido gibberellico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Sciogliere in piccola quantità di etanolo</td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione stereo</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>O simile</td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>O simile, con ottica adatta</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>O simile</td></tr><tr><td>Foglie</td><td></td><td></td><td></td>sterilizzanti</tr><tr><td>Contenitore in policarbonato con tappo a vite da 250 mL con coperchio in polipropilene</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoclavabile</td></tr></tbody></table>

protocolli per ottenere zygotic e somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel modello leguminose<em&gt; medicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Embriogenesi precoce a partire da una singola cellula zigote attraversa rapida divisione cellulare e la morfogenesi, ed è morfologicamente caratterizzato da fasi di pre-globulare, globulari, cuore, siluri e cotyledon. Questo progressivo sviluppo è sotto la stretta regolazione di una rete molecolare complessa. Raccolta sufficienti embrioni in uno stadio di sviluppo è essenziale per studiare la regolazione cellulare e molecolare del primo embriogenesi. Questo non è semplice da inizio embriogenesi subisce una rapida morfogenesi in breve tempo ad esempio, 8 giorni per i Medicago truncatula per raggiungere la fase cotyledon precoce. Qui, affrontiamo il problema da due approcci. Il primo stabilisce un legame tra lo sviluppo embrionale e pod morfologia nell&#39;aiutare indica la fase dell&#39;embrione zigotico. Questo è particolarmente basa sul numero di spirali pod e sviluppo delle spine. Un modo alternativo per integrare in vivo sTUDI è via espianti fogliari coltura per la produzione di embrioni somatici. Il supporto include una combinazione di ormoni insolito - un&#39;auxina (acido 1-naftalenacetico), un citochinine (6-benzilaminopurina), acido abscissico e acido gibberellico. Le diverse fasi possono essere individuate a crescere senza il callo senza dissezione.

Per zigotici embriogenesi differenti strutture pod corrispondenti alle diverse fasi embrionali sono mostrate in Figura 1A - F mentre le diverse fasi embrionali sono mostrati in Figura 2A - F. Selezionando baccelli nella stessa fase, campioni di ovuli che sono piuttosto uniforme può essere ottenuta (Figura 3A). Usando RT-qPCR embrione geni specifici possono essere facilmente individuati e gli studi del corso di tempo valutato 9.</su...

L'obiettivo è illustrare che il modello di leguminose Medicago truncatula può essere facilmente utilizzato per studiare la regolazione dell'embriogenesi precoce delle piante per integrare il modello Arabidopsis non leguminoso. La morfologia dei baccelli è collegata alle fasi di embriogenesi zigotica e viene fornito anche un protocollo per raccogliere gli embrioni utilizzando la coltura tissutale.

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

L'obiettivo generale delle seguenti procedure è dimostrare quanti embrioni di tula cargo possono essere ottenuti a diverse fasi di sviluppo per studiare la regolazione genetica dell'embriogenesi nelle piante; ciò può essere raggiunto collegando la morfologia del baccello alle diverse fasi di sviluppo dell'embrione zigotico e coltivando espianti fogliari per ottenere embrioni somatici a stadi differenti. Infine, la PCR quantitativa e la beta-glucuronidasi possono essere utilizzate per valutare l'espressione genica durante l'embriogenesi nelle specifiche fasi di sviluppo di interesse. I vantaggi di queste tecniche sono che non è richiesta l'etichettatura individuale dei fiori per esperimenti in vivo e che le procedure ottimizzate in vitro forniscono approcci sperimentali complementari.La dimostrazione visiva della procedura di coltura è importante perché consente di seguire più attentamente i dettagli delle manipolazioni. La procedura in vivo sarà eseguita da ing Wang, mentre Kim Nolan mostrerà la procedura in vitro. Per facilitare lo sviluppo dell'embrione zigotico, perforare la superficie dei tegumenti dei semi provenienti da una pianta trinoculare Monte cargo e lasciare in ammollo

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo...

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

Il fringuello zebra (Taeniopygiaguttata) è un prezioso organismo modello; tuttavia, le prime fasi dello sviluppo del fringuello zebra non sono state studiate in modo approfondito. Il protocollo descrive come sezionare gli embrioni precoci per applicazioni molecolari e di sviluppo.

Dissezione e analisi valle di Zebra Finch embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo

I metodi che producono embrioni morphant sono essenziali per studiare i meccanismi di sviluppo e reti di regolazione genica. La stella di mare Patiria miniata è un sistema modello emergente per questi studi. Qui vi presentiamo un protocollo per l'ottenimento di gameti, la produzione di colture di embrioni, e la rapida microiniezione di zigoti di questa specie.

Un metodo per la microiniezione di Patiria minata zigoti

L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.

Un metodo per la caratterizzazione di embriogenesi in Arabidopsis

Questo manoscritto descrive un in vitro dell'ovulo metodo di coltivazione che permette l'imaging di cellule vive di Arabidopsis zigoti ed embrioni. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare le dinamiche intracellulare durante la polarizzazione di zigote e la specifica di destino delle cellule nello sviluppo di embrioni.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

I geni morfogenici delle piante possono essere utilizzati per migliorare la trasformazione genetica dei genotipi recalcitranti. Descritto qui è un protocollo di trasformazione genetica mediata agrobatterica(QuickCorn) per tre importanti linee pubbliche di mais.

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Descriviamo metodi per visualizzare la trascrizione nascente durante l'attivazione del genoma zigotico nelle singole cellule durante l'embriogenesi precoce.

Visualizzazione dell'attivazione del genoma zigotico nelle singole cellule degli embrioni precoci

Descriviamo un metodo di costrizione fisica per produrre mini embrioni da embrioni a 1 cellula di Xenopus laevis .

Manipolazione fisica per generare embrioni mini di Xenopus

Impara i protocolli per ottenere embrioni zigotici e somatici in Medicago truncatula per studiare la regolazione genetica dell'embriogenesi precoce. Questo metodo facilita la ricerca sullo sviluppo vegetale.

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal

Protocolli per ottenere Zygotic e Somatic embrioni per lo studio della regolazione dello sviluppo embrionale precoce nel Modello leguminose

Esplora altri video