Name: Imaging Upright di Drosophila Chambers Egg (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Impara un metodo di imaging verticale per visualizzare i poli delle camere d'uovo di Drosophila melanogaster con microscopia confocale. Questa tecnica rivela l'organizzazione cellulare e subcellulare dell'epitelio follicolare.

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Apprezziamo l'assistenza dei membri della comunità delle mosche, in particolare la dottoressa Denise Montell, la dottoressa Lynn Cooley e la dottoressa Pernille Rorth, per i reagenti. Ringraziamo Flybase, il Bloomington Drosophila Stock Center e la Developmental Studies Hybridoma Bank rispettivamente per le informazioni e per la fornitura di stock di mosche e anticorpi. LM è supportato dalla borsa di studio del Dipartimento dell'Istruzione, dalla borsa di studio per la formazione (P200A120017) Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) e da una sovvenzione NIGMS Initiative for Maximizing Student Development (2 R25-GM55036). Una parte del lavoro di microscopia è stata supportata dalla sovvenzione NSF MRI DBI-0722569 e dalla Keith R. Porter Core Imaging Facility. La ricerca è stata supportata in parte da un NSF CAREER Award (1054422) e da un Basil O'Connor Starter Scholar Award della March of Dimes, entrambi assegnati a MSG.

1. dissezione ovarioli <ol><li> Trasferire una quindicina di 2-4 giorni di età mosche femmine e alcuni maschi di una nuova mosca alimento flacone con aggiunta di lievito secco attivo. Utilizzare il cotone come una presa per i flaconi, e aggiungere qualche goccia di acqua per il cotone per mantenere l&#39;umidità alta. </li><li> Luogo flacone in un incubatore a 25 ° C per 14-16 ore per massimizzare il numero di stage 8-10 camere uovo. NOTA: Il tempo di incubazione varia a seconda della temperatura e la fase desiderata. </li><li> Preparare i media dissezione, 0.1M KPO 4 e NP40 soluzioni come necessario per il giorno successivo (vedi Materiali). </li><li> Anestetizzare linea con CO 2, e mettere sotto un microscopio dissezione. Dispensare alcune gocce di media dissezione in ogni cavità nella diapositiva depressione vetro. </li><li> Tenere pinze in ogni mano ad un angolo di circa 30 ° rispetto al piano del tavolo e orientare una mosca femmina con le ali giù. Con la mano non dominante, prendere la femmina usando pinze, afferrando il suo al dinterior dell&#39;addome, vicino al torace, e la immergere nei media dissezione nella depressione slitta (Figura 1A riquadro). </li><li> Con l&#39;altra coppia di pinze, afferrare l&#39;esoscheletro al posteriore ventrale dell&#39;addome e perforare attraverso. Afferrare le ovaie alla estremità posteriore, quindi tirare fuori dell&#39;addome e posto in media fresca sull&#39;altro lato della slitta depressione. (Figura 1A riquadro). Evitare di tirare a parte l&#39;intestino. Eliminare la carcassa. </li><li> Ripetere con gli altri mosche femminili fino a quando tutte le ovaie vengono sezionati. Eliminare i maschi. </li><li> Con una coppia di pinze, tenere un&#39;ovaia alla fine posteriore (vicino più grandi camere d&#39;uovo), e con l&#39;altra mano usare un paio di pinze per pizzicare una delle camere più uova anteriori (germarium). (Figura 1A). </li><li> Lentamente e costantemente, tirare una catena ovariole dalla guaina dell&#39;ovaio. Continuare a sezionare fuori ovarioli individualmente fino a quando tutte le camere uovo desiderati sono rdell&#39;uso e rimossi. </li><li> Ripetere i passaggi 1,7-1,8 per tutti ovaie sezionati. </li><li> Una volta completato, il trasferimento ovarioli ad un tubo 0,6 ml con una pipetta di trasferimento di plastica. </li><li> Lasciate ovarioli depositano sul fondo della provetta, quindi procedere al fissaggio e colorazione passi. </li></ol> 2. immunofluorescenza (IF) La colorazione di ovarioli <ol><li> Rimuovere con attenzione i media dissezione da ovarioli con una pipetta. Assicurarsi di non rimuovere eventuali ovarioli o camere di uova. Lasciare circa 50 ml di ovarioli e media dissezione. </li><li> Aggiungere 50 ml di 16% paraformaldeide a 150 ml di 0,1 M KPO 4 Buffer in un tubo, e aggiungere la soluzione alle camere uovo di correggerli. Incubare mentre a dondolo per 10 min. ATTENZIONE: paraformaldeide è tossico. </li><li> Rimuovere fissativo e lavare due volte con 0,5 ml di tampone di lavaggio NP40. </li><li> Lavare due volte per 15 minuti ciascuno a RT. </li><li> Fare riferimento alla norma se il protocollo 15 per passi successivi. <ol><li> In breve, dopo la fissazione, aggiungereanticorpi primari alle diluizioni appropriati e incubare O / N a 4 ° C. Lavare in NP40 più volte, quindi aggiungere anticorpi secondari (1: 200) diluizioni. </li><li> Lavare più volte in NP40, quindi aggiungere DAPI (1: 1.000) per 10 minuti, quindi ripetere lavaggi. Una volta se il protocollo è completo, aggiungere 200 ml di glicerolo al 50% in PBS per camere d&#39;uovo e lasciate riposare a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Rimuovere la soluzione, sostituirlo con il 70% glicerolo in PBS, e coprire con un foglio. Posizionare campione a 4 ᵒC fino al momento per il montaggio. Nel frattempo, continuare con il passo 3. </li></ol></li></ol> 3. preparazione preliminare di diapositive gelatina glicerina <ol><li> Misurare almeno 4 ml di glicerina gelatina con una spatola e riempire un tubo di coltura cellulare di vetro per il marchio a metà strada. Sciogliere gelatina glicerina in un bagno di acqua a 55 ° C per 30 min. </li><li> Versare una piccola goccia di glicerolo, circa 300 ml, dalla soluzione madre su due vetrini da microscopio. Utilizzando un tessuto, diffuso glicerolo in un sottile layer su ciascuna delle diapositive. Ciò fornisce una base e consente una facile rimozione di gelatina glicerina al punto 5.6. </li><li> Tagliare la punta fuori di un filtrato puntale 1.000 ml. Usa taglio puntale per trasferire 1000-1500 ml di caldo gelatina glicerina lentamente ad ogni vetrino da microscopio. Fare attenzione per evitare le bolle. </li><li> Lasciate diapositive gelatina glicerina riposare per 5 minuti a temperatura ambiente per impostare. </li><li> Collocare ogni diapositiva gelatina glicerina in 60 mm × 15 mm piatto di Petri e coprire con pellicola trasparente. Posto a 4 ° CO / N. Facoltativamente, negozio di glicerina scivoli gelatina per un massimo di 5 giorni a 4 ° C. </li></ol> 4. Montaggio Egg Chambers <ol><li> Utilizzando campioni dal punto 2.5, pipette alcune gocce 3 microlitri delle camere uovo nel 70% glicerolo attraverso uno glicerina gelatina diapositiva. Continuare pipettaggio 3 gocce microlitri fino a quando tutte le camere di uova sono in questa diapositiva. Assicurarsi che ogni goccia contiene almeno dieci camere d&#39;uovo. Nel frattempo, scaldare un tubo cultura di gelatina glicerina in un bagno di 55 ° C Acque. </li><li> Posizionare il vetrino gelatina glicerina con le camere d&#39;uovo al microscopio dissezione. Regolare ingrandimento in modo che solo una goccia di camere uovo è nel campo di vista (Figura 1B). </li><li> Utilizzando un ago calibro 30 come un cucchiaio, prendere la camera stadio di uovo desiderato. Quando necessario, camere uovo desiderati separati da una catena ovariole utilizzando l&#39;ago come un coltello. </li><li> Per evitare detriti che possono interferire con le immagini, trasferire la camera delle uova alla seconda diapositiva gelatina glicerina, con la parte anteriore rivolta verso sinistra (Figura 1E -1). Ripetere finché ci sono almeno sette camere uovo allineati in una colonna (Figura 1C). </li><li> Formare nuove colonne di sette finché tutte le camere uovo desiderati vengono trasferiti alla seconda slitta gelatina glicerina. </li><li> Strappare un piccolo pezzo di tessuto e di torsione. Usare questo per assorbire l&#39;eccesso di PBS-Glicerolo dalle camere di uova da sfiorando ciascuno. Fare attenzione a non rimuovere le camere di uova. </li><li> Tagliare ilpunta di un filtrato puntale 200 microlitri. Utilizzare questo per trasferire 150 ml di glicerina gelatina per coprire tutte le colonne delle camere uovo. NOTA: La quantità di glicerina gelatina necessario per coprire le colonne si riferiscono al fasi camera d&#39;uovo e il numero di colonne. Importo può essere regolata. </li><li> Lasciate che le camere d&#39;uovo montati riposare per 5 minuti a temperatura ambiente fino a quando lo strato superiore della gelatina glicerina è completamente solidificato (Figura 1D). </li><li> Luogo di diapositive delle camere uovo montati in un piatto di 60 mm × 15 millimetri di Petri e coprire con pellicola trasparente. Conservare a 4 ° CO / N per consentire gli strati gelatina glicerina per solidificare insieme (posto al buio se non vi è preoccupazione per photobleaching). </li></ol> 5. Preparazione di uova Chambers for Imaging <ol><li> Mettere diapositive delle camere uovo montati sotto un microscopio dissezione. Regolare ingrandimento in modo che solo una colonna di camere uovo è nel campo visivo. </li><li> Utilizzando un angolo di 45 ° bisturi in miniatura, tagliare un straight linea lungo il lato destro della prima colonna di camere d&#39;uovo (vicino al lato posteriore delle camere d&#39;uovo). (Figura 1D-E) </li><li> Quindi, tagliare sopra la prima camera uovo in alto e in basso l&#39;ultima camera di uovo in colonna. A questo punto la colonna di camere uovo deve essere tagliato su tre lati. </li><li> Utilizzando un microknife, fetta lungo il lato sinistro della colonna, il più vicino possibile al lato anteriore delle camere d&#39;uovo (Figura 1E -3). </li><li> Dispensare 100 ml di freddo 1X PBT sulla colonna di taglio. </li><li> Utilizzare una spatola rotonda taglio per rimuovere la gelatina glicerina in eccesso intorno a tre lati della colonna taglio delle camere uovo e scartare, lasciando il resto della diapositiva. </li><li> Inserire la spatola nella taglio effettuato sul lato anteriore della camere d&#39;uovo e separare la colonna dal blocco gelatina glicerina primaria. </li><li> Preparare i campioni per entrambi invertiti (5.8.1) o verticale (5.8.2) microscopia. <ol><li> Per invertito Microscopio: t Transferegli colonna camere uovo per un coprioggetto con il lato anteriore delle camere uovo rivolto verso il basso. Ripetere i passaggi 5,2-5,8 fino a quando tutte le colonne di gelatina glicerina sono stati rimossi e montato. Aggiungere un paio di gocce di 50% PBS-glicerolo su ogni blocco di camere d&#39;uovo per evitare che si secchi. Camere di uova Immagine direttamente sul coprioggetto. </li><li> Per microscopio verticale: Trasferire la colonna di camere uovo di un vetrino da microscopio con il lato anteriore rivolto verso l&#39;alto. Ripetere i passaggi 5,2-5,9 fino a quando tutte le colonne di gelatina glicerina sono stati rimossi e montati su vetrini da microscopio. Aggiungere un paio di gocce di 50% PBS-glicerolo su ogni blocco di camere d&#39;uovo e blocchi di copertura con un # 1 ½ coprioggetto. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Qui si descrive un metodo per montare e immagine piccola, sviluppando camere uovo da una prospettiva dall&#39;estremità. Tecniche comuni per le camere di imaging di uova sono ottimizzati per le viste laterali e soprattutto permettono una visualizzazione precisa delle cellule del follicolo medio-laterale quando colorati con anticorpi fluorescenti. L&#39;uso di Z-stack o 3-D ricostruzioni aiuti in visualizzazione di più piani focali, ma è ancora insufficiente per la risoluzione sub-cellulare dei poli delle camere uovo ell...

Studio di Drosophila melanogaster ha fornito grandi intuizioni nella regolazione genetica di una vasta gamma di fenomeni. In particolare, non vi è stata un&#39;ampia ricerca sullo sviluppo delle uova, perché ovogenesi fornisce un modo trattabili per indagare molti diversi processi di sviluppo, tra cui patterning tessuti, i cambiamenti di polarità cellulare, la commutazione del ciclo cellulare, e la regolazione traslazionale 1,2,3,4. Un importante evento morfogenica durante oogenesi è la specificazione, l&#39;acquisizione di motilità e la migrazione di un insieme di cellule chiamate cellule di confine (recensito in 5). Poiché la migrazione delle cellule è una caratteristica chiave della morfogenesi animali, e perché la regolazione genetica di questo processo è ben conservato, meccanismi di determinati in mosche sono suscettibili di essere importante in altri contesti. Quindi, stiamo studiando il controllo molecolare della migrazione delle cellule di confine. Per i nostri studi, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per osservare i poli anteriori di sviluppo delle uova,dove sorgono le cellule di confine, per esaminare come si sviluppano nel dettaglio. All&#39;interno l&#39;ovaio, esistono camere uovo a vari stadi di sviluppo lungo le catene di chiamate ovarioli, che sono racchiusi in un sottile guaina (Figura 1A). Ogni camera di uovo andrà a formare un uovo. Durante oogenesi, diversi tipi di cellule devono sviluppare in modo coordinato. Il D. Camera melanogaster uovo è composto da 16 celle germinali, tra cui un ovocita, circondato da un singolo strato epitelio follicolare 6. Un piccolo numero di cellule specializzate, chiamate cellule polari, sorgono a anteriore e posteriore poli dell&#39;epitelio. Le cellule di frontiera 6-8 originano nell&#39;epitelio anteriore della camera di uovo, indotta dalle cellule polari 5,7. A metà oogenesi (fase 9), le cellule di confine si staccano dai loro vicini e migrano tra le cellule nutrici per raggiungere l&#39;ovocita al posteriore della camera di uovo 5,7. Questo movimento deve essere realizzatomentre le cellule di confine rimangono in un cluster circostante due celle polari non mobili, rendendo questo tipo di migrazione cellulare collettiva. La migrazione di successo del cluster cella di bordo assicura il corretto sviluppo del micropilo del guscio d&#39;uovo, che è necessaria per la fecondazione. Le cellule polari anteriori istruiscono il destino delle cellule di confine attivando una cascata di trasduzione del segnale. Cella polare secernono una citochina, non accoppiato (UPD), che si lega ad un recettore transmembrana, Domeless (DOME), sulla vicina cellule del follicolo durante fase 8 dello sviluppo dell&#39;ovocita 8,9. Il legame di UPD provoca Janus tirosin chinasi (JAK) di fosforilare il trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT) 8,10,11. STAT sposta quindi al nucleo di attivare la trascrizione. Le cellule di confine lenti (SLBO) è un fattore di trascrizione che è un bersaglio trascrizionale diretta di STAT ed è anche necessario per la migrazione delle cellule di confine 12. Viste laterali delle camere uovo indicano tattività di STAT cappello è regolata in un gradiente attraverso l&#39;epitelio anteriori 8,11,13. Cellule del follicolo vicini alle cellule polari hanno i più alti livelli di attivazione STAT, quindi diventano cellule di frontiera e invadono il tessuto germinale adiacente. Per capire come le cellule di confine sono specificati all&#39;interno e si staccano dal epitelio, abbiamo bisogno di osservare come il tessuto è organizzato. Se consideriamo le camere di uova da una prospettiva antero-on, ci aspetteremmo simmetria radiale di attività STAT nelle cellule follicolari che circondano le cellule polari. Un dall&#39;estremità vista sarebbe anche mostrare più accurato differenze di proteine ​​di membrana e interfacce cellula-cellula prima e durante il distacco che confrontando cellule in differenti piani focali. Perché le camere di uova sono oblunghe e attaccato tra loro da cellule gambo, si depositano su vetrini lateralmente, il che rende difficile osservare l&#39;architettura anteriore. Pertanto, molte informazioni sulle cellule ai poli della camera uovo hastato dedotto da viste laterali. Anche se alcune informazioni possono essere ottenute attraverso algoritmici 3-D ricostruzioni di sezioni ottiche, dispersione della luce, photobleaching e limiti più poveri della risoluzione dell&#39;asse Z rendere queste informazioni meno dettagliate e affidabili, in assenza di tecniche costose come super-risoluzione microscopio 14 . Altri tipi di immagini sezione a base (per esempio, microscopia elettronica o microtomo sezionamento) richiedono ampie manipolazione dei tessuti, comprendenti disidratazione, aumentando la probabilità di artefatti. Così, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per l&#39;immagine D. camere melanogaster uovo mentre in posizione verticale. Questo metodo è già dimostrato utile nel chiarire come cellule mobili sono fated (vedere risultati rappresentativi e Manning et al, in esame), ed è probabile che sia più ampiamente prezioso negli studi di altri aspetti della oogenesis.

<table><tbody><tr><td>0,1 M Tampone fosfato di potassio (KPO4 Buffer)</td><td></td><td></td><td>Aggiungere 3,1 g di NaH2PO4&bull; H2O e 10,9 g di Na2HPO4 (anidro) a H2O distillato per ottenere un volume di 1 L. Il pH della soluzione finale sarà 7,4. Questo tampone può essere conservato fino a 1 mese a 4°C.</td></tr><tr><td>Soluzione acquosa di paraformaldeide al 16%,</td><td>microscopia elettronica</td> di grado EM <td>Scienze 15710</td><td>senza metanolo per preservare la fluorescenza GFP</td></tr><tr><td>30G x 1/2 pollice ago&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BD305106</td> Lievito secco attivo a <td>smusso regolare</td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td>Per ingrassare le mosche femmine</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>PAA-azienda di coltura cellulare</td><td>A15-701</td><td>Utilizzato in NP40 Wash Buffer</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>11295-10</td><td>Lega Dumostar, punta biologie; le punte affilate sono essenziali per la dissezione</td></tr> <tr><td>ovarioleDAPI (4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/ml soluzione madre&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Aggiunto al mezzo di dissezione supplementare (10%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta per coltura in vetro</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini a depressione in vetro</td> da 14 ml <td>VWR</td><td>470019-020</td> Gelatina di glicerina <td>a doppia cavità da 1,2 mm di spessore</td></tr><tr><td></td><td>Electron Microsocpy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Mezzi di montaggio</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15760</td><td>70% in PBS</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-500ML</td> <td>(intercambiabile per Nonidet P-40)&nbsp; Utilizzato nel tampone di lavaggio NP40</td></tr><tr><td>Stereoscopio fluorescente Leica&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale Leica SP5</td> Obiettivo a secco <td>Leica Microsystems</td><td></td><td>40x/0.55NA&nbsp;</td></tr><tr><td>Micro spatola&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82027-518</td><td>Vetrino</td></tr> per <tr><td>microscopio</td> in acciaio inossidabile <td>VWR</td><td>16004-368</td><td>75x25x1 mm</td></tr><tr><td>NP40 Tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA e 0,02% sodio azide</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>Aggiunto al mezzo di dissezione supplementare (0,6X)</td></tr><tr><td>Petridish- Polisterina, sterile</td><td>VWR</td><td>82050-548</td><td>60 L x 15 H mm</td></tr><tr><td>Tampone fosfato Soluzione salina</td><td>Sigma</td><td>Aldrich P3813-10PAK</td><td>10 confezioni di polvere</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>Utilizzato in 0,1 M KPO4 Buffer&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791-500G</td><td>Utilizzato in 0,1 M KPO4 tampone&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[intestazione]</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Life Technologies</td><td> 11720018</td><td>Con L-glutammina e bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Azoturo di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Utilizzato nella colorazione di anticorpi fluorescenti</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Utilizzato nel tampone di lavaggio NP40</td></tr><tr><td>TRIS-HCl</td><td>IBI Scientific IB70144</td><td></td><td>1 M TRIS-HCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Volocity Immagine 3D Software di analisi</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Per l'elaborazione di Z-stack confocali</td></tr></tbody></table>

imaging upright di<em&gt; drosophila</em&gt; chambers egg

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

L'oogenesi di Drosophila melanogaster fornisce un contesto ideale per lo studio di vari processi di sviluppo poiché l'ovaio è relativamente semplice in architettura, è ben caratterizzato ed è suscettibile di analisi genetica. Ogni camera uovo è costituita da cellule germinali circondate da un singolo strato epiteliale di cellule follicolari somatiche. Sottogruppi di cellule follicolari subiscono la differenziazione durante fasi specifiche per diventare diversi tipi di cellule. Le tecniche standard consentono principalmente una visione laterale delle camere uovo e quindi una visione limitata dell'organizzazione e dell'identità delle cellule follicolari. Il protocollo di imaging verticale descrive una tecnica di montaggio che consente una nuova visione verticale delle camere delle uova con un microscopio confocale standard. I campioni vengono prima montati tra due strati di gelatina di glicerina in posizione laterale (orizzontale) su un vetrino da microscopio in vetro. La gelatina con le camere delle uova racchiuse viene quindi tagliata in blocchi, trasferita su un vetrino coprioggetti e capovolta per posizionare le camere delle uova in posizione verticale. Le camere delle uova montate possono essere visualizzate su un microscopio confocale verticale o invertito. Questa tecnica consente di studiare la specificazione, l'organizzazione, i marcatori molecolari e lo sviluppo delle cellule follicolari con nuovi dettagli e da una nuova prospettiva.

Il metodo di imaging in posizione verticale ha permesso di vedere direttamente l&#39;organizzazione delle cellule dell&#39;epitelio follicolare anteriore in fase 8. indicatore generale per il destino delle cellule del follicolo, il Occhi Assente (EYA) di proteine, così come il marcatore DNA nucleare DAPI, ha mostrato anche espressione in questo campo delle celle, e hanno dimostrato che tutte le cellule potrebbero essere visti con simili intensità di colorazione (Figura 2b &quot;). Proteine ​​regolate in...

Il metodo di imaging verticale descritto in questo protocollo consente la visualizzazione dettagliata dei poli di un uovo di Drosophila melanogaster in via di sviluppo. Questa visione finale fornisce una nuova prospettiva sulle disposizioni e le morfologie di più tipi di cellule nell'epitelio follicolare.

Imaging Upright di<em&gt; Drosophila</em&gt; Chambers Egg

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è consentire l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione dei poli delle camere ovariche di drosophila. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando le ovari e colorandole con anticorpi fluorescenti. Il secondo passaggio consiste nell'identificare e separare le camere ovariche di interesse.I campioni successivi vengono orientati e allineati, quindi inclusi in blocchi di gelatina glicerica. L'ultimo passaggio consiste nel tagliare e ruotare i blocchi per montare le camere dell'uovo in modo che l'asse longitudinale sia verticale. Infine, la microscopia confocale viene utilizzata per rivelare l'organizzazione cellulare e subcellulare alle estremità della camera dell'uovo.L'epitelio, come le disposizioni delle cellule di confine, può essere osservato con metodi esistenti in sezioni ottiche perpendicolari al piano di imaging e con ricostruzione tridimensionale algoritmica, ma questi possono causare fotobleaching e scattering della luce, fornendo una risoluzione inferiore e immagini meno accurate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di montare i campioni a un nuovo angolo e osservarli direttamente. Utilizziamo questa tecnica per acquisire immagini dei poli di camere ovariche in via di sviluppo, ottenendo informazioni sull'organizzazione delle cellule follicolari.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di preparazione e montaggio sono difficili da apprendere, in quanto richiedono una micro-manipolazione dei campioni colorati e un riposizionamento dei campioni rispetto ai punti di vista convenzionali. A dimostrare la procedura sarà Lathea Manning, una studentessa laureata nel mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, procurarsi una vetrata portaoggetti con depressione e aggiungere con una pipetta diverse gocce di mezzo di dissezione in ogni cavità.Anestetizzare le mosche con anidride carbonica e posizionarle sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, orientare una mosca femmina con le ali rivolte verso il basso e la testa rivolta a sinistra. Tenere la pinzetta in ciascuna mano ad un angolo di 30 gradi rispetto al piano del tavolo, utilizzando la mano non dominante.Prendere la mosca utilizzando una pinzetta. Afferrare la mosca nella parte anteriore dell'addome, vicino al torace, e immergerla nel mezzo di dissezione. Posizionarla sulla cavità del vetrino portaoggetti con l'altra coppia di pinzette.Afferrare l'esoscheletro nella parte ventrale posteriore dell'addome e perforarlo. Afferrare le ovaie all'estremit&agrave; posteriore, quindi estrarle dall'addome e posizionarle nel mezzo fresco sull'altro lato del vetrino con depressione. Successivamente, tenere un'ovaio all'estremit&agrave; posteriore vicino alle camere uovali pi&ugrave; grandi e, con l'altra mano, pizzicare lentamente e con decisione una delle camere uovali pi&ugrave; anteriori o il jammer.Estrai una catena di ovari dall'involucro ovarico e continua a dissezionare singolarmente gli ovari finché non saranno rimossi tutti i camere embrionali desiderati. Al termine della dissezione, utilizza una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire l'ovario in un tubo da 0,6 millilitri e lascialo depositare sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta, rimuovi con attenzione la maggior quantità possibile del mezzo di dissezione dall'ovario.Attenzione a non trasferire ovuli o camere ovariche in un nuovo tubo. Aggiungere 50 microlitri di paraformaldeide al 16% a 150 microlitri di tampone fosfato di potassio 0,1 M, quindi aggiungere questa soluzione alle camere ovariche. Incubare con agitazione per 10 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere il fissativo.Sciacquare due volte con tampone NP-40, quindi lavare su aliquote due volte con 0,5 millilitri di tampone NP-40 per 15 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Dopo la fissazione e il lavaggio, aggiungere gli anticorpi primari e incubare l'ovulo tutta la notte a quattro gradi Celsius o per tre ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, lavare i campioni quattro volte per 20 minuti ciascuna con 0,5 millilitri di tampone NP-40 a temperatura ambiente.Quindi aggiungere gli anticorpi secondari in un rapporto di diluizione 1:200 e incubare il tubo per tre ore o tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere il DPI in un rapporto di diluizione 1:1000 e incubare il tubo per 10 minuti. Poi lavare i campioni quattro volte con 0,5 millilitri di buffer di lavaggio NP 40 per 20 minuti per ogni lavaggio a temperatura ambiente.Una volta completato il protocollo di immunofluorescenza o IF, aggiungere 200 microlitri di glicerolo al 50% in PBS alle camere ovariche e lasciare a temperatura ambiente per due ore al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione, quindi sostituirla con glicerolo al 70% in PBS e coprire il tubo con della stagnola. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius fino al momento del montaggio.Per preparare l’aliquota di gelatina glicerina, prelevare con una spatola la gelatina glicerina e riempire per metà circa un tubo di cultura in vetro Pyrex da 15 millilitri; sciogliere quindi la gelatina glicerina in un bagno termico a 55 gradi Celsius per 30 minuti. Nel frattempo, depositare una goccia di 300 microlitri di glicerolo dalla soluzione stock su due vetrini microscopici. Utilizzando un fazzoletto di carta, stendere il glicerolo in un sottile strato su ciascun vetrino.Per fornire una base che permetta una facile rimozione della gelatina glicerina. Verificare che la gelatina glicerina sia completamente sciolta. Successivamente, tagliare la punta di una pipetta filtrata da 1000 microlitri e trasferire da 1000 a 1.500 microlitri di gelatina glicerina tiepida su ogni vetrino, facendo attenzione a evitare la formazione di bolle.Lasciare riposare le lamelle di gelatina glicerina per cinque minuti a temperatura ambiente per fissare ciascuna lamella di gelatina glicerina. Posizionare ogni lamella in una piastra di Petri da 60 millimetri per 15 millimetri. Coprire la piastra con pellicola trasparente e conservare le lamelle a quattro gradi Celsius durante la notte.Pipettare diverse gocce di tre microlitri di camere ovariche dai campioni precedentemente preparati in glicerolo al 70% su un vetrino con gelatina glicerica. Continuare a pipettare gocce di tre microlitri finché tutte le camere ovariche non saranno sul vetrino, assicurandosi che ogni goccia contenga almeno 10 camere ovariche. Successivamente, riscaldare il tubo con gelatina glicerica in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius, posizionare un vetrino con gelatina glicerica contenente le camere ovariche sotto un microscopio stereoscopico e regolare l'ingrandimento in modo che un'unica goccia di camere ovariche sia visibile nel campo microscopico.Quando necessario, utilizzare un ago da 30 come cucchiaio per prelevare la camera ovarica allo stadio desiderato. Separare le camere ovariche desiderate da una catena ovarica usando l'ago come un coltello, per evitare detriti che potrebbero interferire con l'acquisizione delle immagini. Trasferire la camera ovarica al secondo vetrino con gelatina di glicerina.Ripetere questo passaggio fino a quando non ci saranno almeno sette camere ovariche allineate in una colonna, con i lati anteriori rivolti a sinistra. Rimuovere i detriti o le camere ovariche indesiderate con l'ago, formando nuove colonne di sette camere fino a quando tutte le camere ovariche desiderate non saranno trasferite al secondo vetrino con gelatina di glicerolo. Arrotolare un piccolo pezzo di carta Kimwipe, quindi assorbire l'eccesso di PBS/glicerolo dalle camere ovariche toccandole delicatamente una alla volta. Fare attenzione a non rimuovere alcuna camera ovarica.Tagliare la punta di una pipetta filtrante da 200 microlitri e trasferire 150 microlitri di gelatina glicerina per coprire tutte le colonne delle camere ovariche. Verificare al microscopio che tutte le colonne delle camere ovariche siano coperte. Lasciare le camere ovariche montate a riposo per cinque minuti a temperatura ambiente, fino a quando lo strato superiore di gelatina glicerina si sia completamente solidificato.Quindi posizionare un vetrino con camere embrionali montate in una piastra di Petri da 60 millimetri per 15 millimetri e coprirlo con della pellicola trasparente. Conservare la piastra a quattro gradi Celsius durante la notte per permettere ai livelli di gelatina glicerica di solidificarsi insieme al buio. Se potesse verificarsi fotodegradazione, posizionare un vetrino con le camere embrionali montate sotto un microscopio stereoscopico.Regolare l'ingrandimento in modo che nel campo visivo sia presente una sola colonna di camere ovariche. Utilizzando un bisturi miniatura con angolo di 45 gradi, effettuare un taglio dritto lungo il lato destro della prima colonna di camere ovariche, vicino al lato posteriore delle camere ovariche.Successivamente, effettuare un taglio al di sopra della prima camera uovo in alto e al di sotto dell'ultima camera uovo nella colonna, in modo che le camere uovo risultino ora tagliate su tre lati. Utilizzare un microbisturi per tagliare lungo il lato sinistro della colonna, il più vicino possibile al lato anteriore delle camere uovo. Quindi aggiungere con una pipetta 100 microlitri di uno XPBT freddo sulla colonna tagliata insieme alla sua spatola.Rimuovere il gel di glicerina in eccesso intorno ai tre lati della colonna tagliata di camere ovariche e scartare l'eccesso. Inserire la spatola nel taglio effettuato sul lato anteriore delle camere ovariche e staccare la colonna dal blocco principale di gel di glicerina per montarla su un vetrino ed eseguire l'analisi mediante microscopia. Il metodo di imaging in posizione eretta consente una visualizzazione diretta dell'organizzazione delle cellule nell'epitelio follicolare anteriore allo stadio otto.Un marcatore generale per il solfato dei follicoli, la proteina eyes absent o IA, così come il marcatore del DNA nucleare DPI mostrano un'espressione uniforme in questo campo di cellule e dimostrano che tutte le cellule possono essere osservate con intensità di colorazione simili. La visione convenzionale di una camera ovarica contrasta con quella ottenuta mediante una ricostruzione tridimensionale della camera ovarica. L'ingrandimento mostra l'asse ruotato.L'asse x è orientato verso il basso. L'asse z è ora orientato verso sinistra, e l'asse y è orientato verso l'osservatore. Le singole cellule risultano sfocate a causa della bassa risoluzione lungo l'asse z.Pertanto, il nuovo approccio rappresenta un notevole miglioramento nell'imaging. Il metodo di imaging in posizione eretta visualizza efficacemente l'epitelio anteriore nelle camere ovariche allo stadio nove. In questo stadio di sviluppo, le cellule di confine si raggruppano attorno alle cellule polari.Questi ammassi compatti vengono osservati mediante imaging endon. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come montare i campioni per consentire nuove prospettive di osservazione. Abbiamo utilizzato questa tecnica per acquisire immagini dei poli di camere ovariche in via di sviluppo in stadi selezionati.Questa tecnica generale potrebbe essere utilizzata per altre fasi della drosophila, per l'ovogenesi o per altri tipi di tessuti piccoli.

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