Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la risposta al freddo nei topi. Questo viene ottenuto raffreddando o riscaldando inizialmente il vetro alla temperatura desiderata. Il secondo passaggio consiste nell'abituare i topi fino a quando non sono a riposo.

Il terzo passaggio consiste nel comprimere la polvere di ghiaccio secco in un pellet all'interno di una siringa. L'ultimo passaggio prevede di testare i topi utilizzando il pellet di ghiaccio secco e un cronometro per misurare la latenza del riflesso di ritrazione. In definitiva, il test del pianter freddo viene utilizzato per misurare la sensibilità al freddo e l'adattamento in topi completamente liberi di muoversi.

Il principale vantaggio del nostro saggio rispetto ai saggi attualmente esistenti, come il test con l'acetone e il test della piastra fredda, è che possiamo valutare sia l'ipersensibilità che l'analgesia a livello basale in diverse condizioni ambientali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla risposta al freddo dei topi, può essere utilizzato anche in altri sistemi, come la scimmia, il ratto e l'uomo. La procedura sarà dimostrata da Daniel Brenner, uno studente laureato del mio laboratorio.

Dopo aver pulito la superficie di vetro, fissare la sonda del termocoppia di tipo T al centro della piastra di vetro utilizzando nastro da laboratorio. Posizionare le recinzioni per gli animali sulla piastra di vetro in una singola fila lungo la linea centrale. Quindi far passare la sonda del termocoppia attraverso la recinzione centrale per gli animali e collegarla al registratore di dati.

Accendere il registratore di dati e disattivare la funzione di spegnimento automatico. Collegare il registratore di dati al computer utilizzando il cavo fornito. Separare gli alloggiamenti per gli animali con inserti neri per impedire interazioni visive tra i topi e posizionare specchi sotto il vetro per consentire la visualizzazione della parte inferiore degli alloggiamenti.

Per iniziare i test, posizionare delle scatole di alluminio sul piatto di vetro su entrambi i lati dell'animale, a una distanza fissa dalle recinzioni. Se il test viene effettuato a 30 gradi Celsius, collegare circolatori d'acqua riscaldati alle scatole di alluminio posizionate a 0,25 pollici di distanza dalla recinzione dell'animale. Riempire le scatole d'acqua fino a metà, tenendo tappate le aperture di scarico.

Posizionare i circolatori in modo che l'acqua calda proveniente dalle scatole di alluminio defluisca direttamente nel serbatoio del circolatore su ciascun lato. Sarà necessario aggiungere acqua a ciascun circolatore. Una volta riempite le scatole metalliche, impostare i circolatori su una temperatura compresa tra 45 e 60 gradi Celsius e riempire le scatole di alluminio con un flusso costante di acqua calda.

Quando i vetri raggiungono il range di temperatura desiderato, posizionare i topi nei recinti sulla piastra. Lasciare che i topi si abituino all'apparecchiatura e alla temperatura. Questi topi si abitueranno per 2,5 ore.

Quando si è quasi alla fine del periodo di ambientamento, riempire un secchiello per ghiaccio per circa metà con anidride carbonica solida (ghiaccio secco) e utilizzare un martello o un mazzuolo per ridurre il ghiaccio secco in polvere. Eseguire questa operazione all'esterno della stanza comportamentale per evitare di disturbare i topi. Successivamente, utilizzare una lametta o delle forbici per tagliare la parte superiore di una siringa da tre millilitri.

Quindi utilizzare un ago da 21 gauge per praticare due serie di tre fori su lati opposti della siringa al fine di ridurre la pressione generata dalla sublimazione, mentre si comprime la polvere di ghiaccio secco nuovamente nella stanza comportamentale; riempire la camera della siringa per metà con polvere di ghiaccio secco. Tenere l'estremità tagliata della siringa contro una superficie piana e comprimere con fermezza la polvere utilizzando lo stantuffo. Estendere la punta della paletta di ghiaccio secco compresso oltre il bordo della siringa.

Ora, testare quei topi che hanno tutte e quattro le zampe sul vetro e non si muovono, ma non sono completamente addormentati. Utilizzando gli specchi per prendere la mira, premere con decisione ma delicatamente il pellet piatto contro la superficie di vetro al di sotto della zampa posteriore del topo. Contemporaneamente, premere il pulsante di avvio del cronometro.

Quando il mouse si allontana dal vetro raffreddato, sia verticalmente che orizzontalmente, fermare il cronometro e rimuovere il pellet di ghiaccio secco. Tuttavia, se il mouse sposta brevemente la zampa e la riporta subito sulla superficie di raffreddamento, continuare la temporizzazione e la stimolazione fino a quando il mouse non si allontana definitivamente. Se il mouse non si allontana dal vetro raffreddato, interrompere lo stimolo dopo 20 secondi.

Ripetere questa procedura di prova fino a quando non vengono raccolti almeno tre valori per ogni zampa dell'animale per testare i topi a 17 gradi Celsius. Ripetere l'esperimento come appena mostrato, ma invece di riempire le scatole di alluminio con acqua riscaldata, utilizzare ghiaccio bagnato e posizionare le scatole a circa 0,25 pollici di distanza dalle gabbie per testare i topi. A 12 gradi Celsius si utilizza ghiaccio secco, ma le scatole vengono posizionate a 1,25 pollici di distanza dalle gabbie.

Questo protocollo alternativo prevede il test dei topi durante la diminuzione della temperatura della piastra, anziché dopo che questa si è stabilizzata. Ciò ci consente di valutare l'adattamento dei topi mentre avviene, dopo aver allestito l'apparato. Come in precedenza, eseguire l'esperimento seguendo la procedura descritta per effettuare le misurazioni a temperatura ambiente.

Dopo aver misurato le latenze di base a temperatura ambiente, utilizzando la procedura precedentemente illustrata, riempire le scatole di alluminio vuote con ghiaccio secco e posizionarle a 1,25 pollici dalle strutture su entrambi i lati. Infine, ripetere l'esperimento per rilevare le misurazioni della latenza mentre la piastra di vetro si raffredda.

Effettuare le misurazioni il più spesso possibile. Questo grafico mostra la latenza media del riflesso di ritrazione nei topi a partire da 12 gradi Celsius, 17 gradi Celsius, 23 gradi Celsius o 30 gradi Celsius. Le latenze di ritrazione sono costanti a tutte le temperature.

Gli effetti analgesici possono essere misurati utilizzando il test del pianter freddo come mostrato qui. L'iniezione sottocutanea di 1,5 milligrammi per chilogrammo di morfina aumenta la latenza del ritiro nei topi a 30 minuti dall'iniezione, come misurato da un test innova a due vie con test post-hoc di Bonferroni a 60 minuti dall'iniezione. Non vi è alcuna differenza significativa tra i topi iniettati con morfina e quelli iniettati con soluzione salina.

È inoltre possibile misurare l'ipersensibilità nei topi. L'iniezione intra-plantare di 10 microlitri di adiuvante completo di Freund riduce significativamente la latenza del riflesso di ritrazione nei topi due e tre ore dopo l'iniezione, come misurato da un'analisi a due vie ANOVA con test post-hoc di Bonferroni. Gli stessi topi hanno ricevuto iniezioni sottocutanee di morfina a quattro ore e tutte le latenze di ritrazione alle 4,5 ore sono risultate significativamente maggiori rispetto a quelle alle tre ore, come misurato da un'analisi a una via ANOVA con test post-hoc di Dunnett.

Una volta che la morfina è stata metabolizzata, a 5,5 ore dall'iniezione, i topi a cui era stato somministrato CFA presentavano comunque latenze di ritiro inferiori rispetto ai topi a cui era stato somministrato soluzione salina, come misurato da un test ANOVA a due vie con test post-hoc di Bonferroni. L'adattamento ai cambiamenti ambientali di raffreddamento può essere misurato in tempo reale con questo saggio. I topi di tipo selvatico presentano la stessa latenza di ritiro man mano che la piastra di vetro si raffredda, suggerendo che si adattano alle temperature più fredde più rapidamente di quanto possa essere misurato con il CPA, nel quale non si sono osservate differenze significative tra i gruppi.

Tuttavia, quando i topi sono stati iniettati con U 7 3 1 2 2 per bloccare l'idrolisi del PIP due, la loro latenza diminuisce al diminuire della temperatura della piastra, il che suggerisce un adattamento compromesso. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore, compreso il tempo di acclimatazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la sensazione al freddo e l'adattamento in topi svegli e liberi di comportarsi naturalmente. Non dimenticare che lavorare con la neve carbonica può essere estremamente pericoloso e che è necessario garantire un'adeguata ventilazione e il libero passaggio dell'aria durante questo metodo.