Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la reattività al freddo dei topi. Ciò si ottiene raffreddando o riscaldando prima il vetro alla temperatura desiderata. Il secondo passo è acclimatare i topi fino a quando non sono a riposo.

Il terzo passo consiste nel comprimere la polvere di ghiaccio secco in un pellet in una siringa. Il passaggio finale consiste nel testare i topi utilizzando il pellet di ghiaccio secco e un cronometro per misurare la latenza di prelievo. In definitiva, il test della fioriera a freddo viene utilizzato per misurare la reattività e l'adattamento al freddo nei topi che si comportano liberamente.

Il vantaggio principale del nostro test rispetto ai test attualmente esistenti, come il test dell'acetone e il test su piastra fredda, è che possiamo testare sia l'ipersensibilità che l'analgesia al basale in una varietà di circostanze ambientali. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulla reattività al freddo dei topi. Può essere utilizzato anche in altri sistemi come la scimmia, il ratto e gli esseri umani A dimostrare la procedura sarà Daniel Brenner, uno studente laureato nel mio laboratorio.

Dopo aver pulito la superficie del vetro, fissare la sonda della termocoppia a filamento di tipo T alla superficie al centro della lastra di vetro con del nastro da laboratorio. Posiziona i recinti degli animali sulla lastra di vetro in un'unica linea lungo il centro. Quindi infilare la sonda della termocoppia attraverso l'involucro centrale degli animali e collegarla al data logger.

Accendere il data logger e disattivare la funzione di spegnimento automatico. Collegare il data logger al computer con il cavo in dotazione. Separare i recinti degli animali con inserti neri per evitare interazioni visive tra i topi e posizionare gli specchi sotto il vetro per consentire la visione della parte inferiore dei recinti.

Per iniziare il test, posiziona le scatole di alluminio sulla lastra di vetro su entrambi i lati dell'animale, i recinti a una distanza fissa. Se il test è a 30 gradi Celsius, collegare i circolatori d'acqua riscaldata alle scatole di alluminio posizionate a 0,25 pollici di distanza dal recinto degli animali. Riempi le scatole con acqua a metà mentre i fori di scarico sono ostruiti.

Posizionare i circolatori in modo che l'acqua calda delle scatole di alluminio scarichi direttamente nel serbatoio del circolatore su ciascun lato. Sarà necessario aggiungere acqua a ciascun circolatore. Una volta riempite le scatole di metallo, impostare i circolatori a una temperatura compresa tra 45 e 60 gradi Celsius e riempire le scatole di alluminio con un flusso costante di acqua calda.

Quando gli occhiali raggiungono l'intervallo di temperatura desiderato, posizionare i mouse negli involucri sulla piastra. Lasciare che i topi si acclimatino all'apparecchio e alla temperatura. Questi topi si acclimatano per 2,5 ore.

Quando ci si avvicina alla fine del periodo di acclimatazione, riempire un secchiello del ghiaccio per circa metà di ghiaccio secco e utilizzare un martello o un martello per frantumare il ghiaccio secco in polvere. Fallo al di fuori della stanza comportamentale per evitare di disturbare i topi. Quindi, usa una lama di rasoio o delle forbici per tagliare la parte superiore di una siringa da tre millilitri.

Quindi utilizzare un ago calibro 21 per praticare due serie di tre fori sui lati opposti della siringa per diminuire la pressione generata dalla sublimazione mentre si comprime il ghiaccio secco nella stanza comportamentale, riempire la camera della siringa per metà di polvere di ghiaccio secco. Tenere l'estremità tagliata della siringa contro un oggetto piatto e comprimere saldamente la polvere usando lo stantuffo. Estendere la punta della tavolozza di ghiaccio secco compresso oltre il bordo della siringa.

Ora, metti alla prova quei topi che hanno tutte e quattro le zampe nel vetro e non si muovono, ma non sono completamente addormentati. Usando gli specchi per mirare delicatamente ma con fermezza, premi il pallino piatto a filo contro la superficie di vetro sotto la zampa posteriore del topo. Contemporaneamente, premere start su un timer.

Quando il mouse si allontana dal vetro raffreddato, verticalmente o orizzontalmente, arrestare il timer e rimuovere il pellet di ghiaccio secco. Tuttavia, se il mouse muove molto brevemente la zampa e poi la riporta sulla superficie di raffreddamento, continua a cronometrare e stimolare fino a quando il mouse non si allontana definitivamente. Se il mouse non si allontana dal vetro raffreddato, interrompere lo stimolo dopo 20 secondi.

Ripetere questa procedura di test fino a quando non vengono raccolti almeno tre valori su ciascuna zampa dell'animale per testare i topi a 17 gradi Celsius. Ripeti l'esperimento come appena mostrato, ma invece di riempire le scatole di alluminio con acqua riscaldata, usa del ghiaccio umido e posiziona le scatole a circa 0,25 pollici di distanza dagli involucri per testare i topi. A 12 gradi Celsius, viene utilizzato ghiaccio secco, ma le scatole sono posizionate a 1,25 pollici di distanza dagli involucri.

Questo protocollo alternativo testa i topi mentre la temperatura della piastra diminuisce piuttosto che dopo che si è stabilizzata. Questo ci permette di testare l'adattamento dei topi mentre sta accadendo dopo aver installato l'apparato. Come in precedenza, eseguire l'esperimento come descritto in precedenza per effettuare misurazioni a temperatura ambiente.

Una volta misurate le latenze basali a temperatura ambiente. Utilizzando la procedura mostrata in precedenza, riempire le scatole di alluminio vuote con ghiaccio secco e posizionarle a 1.25 pollici dagli involucri su entrambi i lati. Infine, ripeti l'esperimento per effettuare misurazioni della latenza mentre la lastra di vetro si raffredda.

Effettuare le misurazioni il più spesso possibile. Questo grafico mostra la latenza media di prelievo per i topi a partire da 12 gradi Celsius, 17 gradi Celsius, 23 gradi Celsius o 30 gradi Celsius. Le latenze di prelievo sono costanti a tutte le temperature.

Gli effetti analgesici possono essere misurati utilizzando il test della seminatrice a freddo come mostrato qui. L'iniezione sottocutanea di 1,5 milligrammi per chilogrammo di morfina aumenta la latenza di astinenza dei topi 30 minuti dopo l'iniezione, misurata da un test post-hoc a due vie innova con Bonferroni 60 minuti dopo l'iniezione. Non vi è alcuna differenza significativa tra morfina iniettata e soluzione salina.

Qui si può misurare anche l'ipersensibilità dei topi. L'iniezione intra planter di 10 microlitri di adiuvante fros completo riduce significativamente la latenza di astinenza dei topi due e tre ore dopo l'iniezione, misurata da un test post-hoc a due vie innova con bonferroni. Agli stessi topi sono state somministrate iniezioni sottocutanee di morfina a quattro ore e tutte le latenze di astinenza a 4,5 ore erano significativamente più alte rispetto alle tre ore misurate da un test a senso unico con fatto il test post hoc.

Una volta che la morfina è stata metabolizzata a 5,5 ore dopo l'iniezione, i topi a cui è stato iniettato CFA avevano ancora latenze di astinenza inferiori rispetto ai topi iniettati con soluzione salina, come misurato da un inova a due vie con test post-hoc di Bonferroni. L'adattamento ai cambiamenti ambientali di raffreddamento può essere misurato in tempo reale con questo saggio. I topi wild type hanno la stessa latenza di astinenza quando la lastra di vetro si raffredda, suggerendo che si adattano alle temperature di raffreddamento più velocemente di quanto possa essere misurato con il CPA, che non ha differenze significative tra i gruppi.

Tuttavia, quando ai topi è stato iniettato U 7 3 1 2 2 per bloccare l'idrolisi PIP due, la loro latenza diminuisce man mano che la piastra della temperatura diminuisce, suggerendo un adattamento alterato Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque ore, compreso il tempo di acclimatazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la sensazione di freddo e l'adattamento nei topi svegli che si comportano liberamente. Non dimenticare che lavorare con il ghiaccio secco può essere eccezionalmente pericoloso e che è necessario garantire una ventilazione adeguata e lo spazio libero dell'aria durante questo metodo.