Una procedura Grande laterale Craniotomia per Mesoscale Wide-field Optical Imaging di Brain Activity

L'obiettivo generale di questa grande craniotomia laterale è eseguire un'immagine in tempo reale su un'ampia area di un emisfero corticale. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'esporre vaste aree della corteccia all'osservazione, consentendone l'uso in combinazione con tecnologie come l'optogenetica. Questa tecnica può fornire informazioni utili per caratterizzare la dinamica neuronale tra cellule e tra diversi circuiti cerebrali a diverse risoluzioni temporali e spaziali.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale a causa del rischio aumentato di emorragia e di danni corticali, poiché la dura madre è spesso aderente alla superficie cerebrale e ai vasi sanguigni. Questo metodo può essere applicato per studiare i meccanismi neurobiologici alla base dello sviluppo dei circuiti cerebrali e dei loro cambiamenti nel corso della vita in risposta a nuove esperienze o a patologie come la malattia di Alzheimer o l'ictus. Per iniziare questa procedura, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici mediante autoclave ed assicurarsi che la sterilità venga mantenuta per tutta la durata dell'intervento chirurgico.

Assicurarsi che ci sia abbastanza soluzione cerebrale per l'intervento chirurgico. Successivamente, trasferire un topo anestetizzato sul supporto per il capo e posizionarlo su un tappetino riscaldante termoregolato impostato a 37 gradi Celsius. Fissare i denti superiori del topo nel supporto per i denti.

Quindi ruotare la testa verso sinistra di circa 30 gradi per esporre il lato laterale destro della testa. Successivamente, fissare la testa del mouse con l'estremità smussata delle barre auricolari. Poi applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccamento della cornea.

Per ridurre l'edema cerebrale, somministrare dexametasona a una dose di quattro milligrammi per chilogrammo per via intramuscolare. Pulire la cute nella zona chirurgica con bastoncini di cotone imbevuti di clorhexidina al 4% per tre volte, quindi con alcol al 70% per tre volte. Iniettare lidocaina per via sottocutanea nella sede della craniotomia.

Sotto un microscopio stereoscopico, sollevare la pelle a un millimetro a sinistra della linea mediana appena dietro l'orecchio con una pinzetta ed effettuare un piccolo taglio orizzontale con forbici chirurgiche. Eseguire un taglio laterale lungo cinque-sei millimetri in direzione dell'orecchio destro, quindi proseguire verso l'estremità rostrale della testa. Inserire le forbici nel punto del taglio iniziale e tagliare per 10 millimetri in direzione rostrale.

In seguito, praticare un'incisione cutanea intorno all'orecchio destro e in prossimità dell'occhio destro per esporre il lato destro del cranio e il muscolo temporale. Assicurarsi che la parte più larga della zona esposta sia di almeno sette millimetri. Quindi, rimuovere ulteriormente la cute qualora fosse necessario estendere l'area chirurgica.

Utilizzando un bastoncino di cotone, strofinare la superficie del cranio con un movimento circolare per rimuovere il periostio dal cranio. Assicurarsi che non rimanga alcun periostio e che il cranio sia completamente asciutto, condizione fondamentale per un attacco corretto della piastra cranica. Successivamente, utilizzando forbici a molla e pinzette, separare il muscolo temporale dal cranio.

Tagliare e ritrarre il muscolo lateralmente fino a raggiungere l'osso squamoso. Prestare la massima attenzione a non danneggiare la vena temporale superficiale che corre lungo il livello dell'osso squamoso in prossimità dell'occhio, altrimenti potrebbe verificarsi un'emorragia. Controllare il sanguinamento con schiuma gel pre-impregnata in tampone cerebrale.

Per emorragie gravi, utilizzare un cauterizzatore a caldo. Applicare colla di butil cianoacrilato sulle sedi emorragiche. Per iniziare questa procedura, segnare prima il bregma per orientare le regioni cerebrali sottostanti, applicare colla di etil cianoacrilato lungo il bordo inferiore della piastra cranica e fissare la piastra sopra l'area di craniotomia.

In seguito, riempire lo spazio vuoto tra il cranio e la piastra cranica con del cemento dentale, lasciando esposta solo l'area della craniotomia. Attendere quindi che il cemento dentale si asciughi e indurisca. Successivamente, delimitare la regione della finestra cranica incidendo leggermente la superficie del cranio con il trapano dentale.

Seguire delicatamente la scanalatura iniziale con il trapano per approfondirla, assicurandosi che il trapano non penetri attraverso il cranio fino al cervello. Nel frattempo, alternare ogni pochi minuti tra la fase di trapanazione e l’uso di tamponi di carta inumiditi arrotolati per asciugare la superficie del cranio. Questa fase iniziale particolarmente complessa richiede ai chirurghi di trapanare attraverso il cranio senile per liberarlo e rimuoverlo senza danneggiare la corteccia sottostante.

Lento è stabile, morbido è veloce. Durante la perforazione, controllare periodicamente la comparsa di flessione del cranio premendo delicatamente con una pinzetta o con la punta della trapano ferma. Quando l'osso inizia a flettersi, interrompere la perforazione e immergere completamente la finestra nel buffer cerebrale.

Attendere almeno cinque minuti prima della rimozione del cranio per ammorbidire l'osso e ridurre la probabilità che la dura madre aderisca all'osso, facilitando così il processo di rimozione del cranio. Successivamente, eseguire la rimozione del cranio a partire dal margine anteriore. Sollevare delicatamente il cranio dalla dura madre utilizzando pinzette.

Una volta che l'osso è sciolto e galleggia sulla dura, afferrarlo saldamente con la pinzetta e sollevarlo dalla dura. Assicurarsi che l'osso non penetri mai nel cervello. Utilizzare la pinzetta e le forbici a molla per strappare e tagliare delicatamente la dura.

È necessario prestare attenzione per evitare di danneggiare il parenchima cerebrale e i vasi sanguigni. Proseguire finché tutta la dura madre non viene rimossa dal sito della finestra cranica. Se eseguita correttamente, il cervello apparirà molto pulito, con vasi sanguigni ben definiti e senza imperfezioni.

Nebulizzare la lamella con etanolo al 70% e asciugarla delicatamente con una bomboletta d'aria. Assicurarsi che il vetro sia completamente pulito, senza aloni né polvere. Successivamente, preparare l'agarosio al 1,3% riscaldando 200 milligrammi di polvere di agarosio disciolti in 15 millilitri di buffer cerebrale.

Inserire un termometro nell'agarosio caldo e raffreddare l'agarosio fino a raggiungere una temperatura appena superiore a quella di solidificazione, circa 40 gradi Celsius. Il raffreddamento può essere accelerato facendo scorrere acqua fredda sul tubo, avendo cura di non far entrare acqua nell'agar. Mescolare delicatamente con il termometro mentre si monitora la temperatura.

Immediatamente prima di applicare l'agar, rimuovere il buffer cerebrale dalla camera cranica. Accertarsi che non siano presenti bolle o particelle, poiché interferirebbero con l'acquisizione delle immagini. Prelevare ora l'agarosio con una pipetta transfer e depositarlo direttamente sul cervello.

Quindi posizionare rapidamente il coprioggetto sulla superficie e fissarlo con gocce di agarosio agli angoli. Qui viene mostrata una microfotografia della craniotomia unilaterale ampia, con il bregma indicato da un cerchio bianco in ciascuna immagine. I modelli di attivazione corticale sono mostrati in un topo anestetizzato con isoflurano 0,5% dopo stimolazione dei vibrisi controlaterali, stimolazione uditiva, stimolazione dell’arto anteriore controlaterale, stimolazione dell’arto posteriore controlaterale e stimolazione visiva dell’occhio controlaterale mediante un diodo a emissione luminosa.

Si è verificata un'attivazione mediana da tutte le forme di stimolazione sensoriale tra 10 e 25 millisecondi dopo l'attivazione della corteccia sensoriale primaria. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in tre o quattro ore. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo la perdita di sangue e di garantire che la corteccia non venga danneggiata.

Utilizzando questo procedimento, altre tecniche di imaging come l'imaging ottico possono contribuire a rispondere a domande fondamentali, ad esempio in che modo la dinamica neurale è influenzata dall'attività spontanea nel cervello normale e in quello malato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha agevolato il cammino dei ricercatori nel campo della neuroscienza dei sistemi, permettendo di esplorare le interazioni e la dinamica neurale tra regioni corticali distanti nei topi. Questo video mostra come eseguire una craniotomia laterale ampia nel topo con perdita ematica minima e danno corticale ridotto, consentendo di raccogliere i dati necessari per rispondere alle domande scientifiche più urgenti.