Tintoria Insetti per comportamentali saggi: il comportamento di accoppiamento di anestetizzati
22 aprile 2015
Questo protocollo descrive un modo semplice ed economico per identificare individualmente la Drosophila o altri insetti. I dati dimostrativi che studiano il successo dell'accoppiamento in tre specie di Drosophila mostrano che questo metodo è paragonabile o migliore dell'uso dell'anestesia con CO2.
L'obiettivo generale di questa procedura è rendere gli insetti visivamente distinguibili l'uno dall'altro in modo non invasivo, al fine di identificarli in esperimenti comportamentali. Questo risultato si ottiene colorando visibilmente la superficie del normale alimento per drosophile in una provetta standard per moscerini con poche gocce di colorante alimentare. Successivamente, si aggiungono le mosche alla provetta per tre ore, al termine delle quali la drosophila dovrebbe mostrare una marcata colorazione dell'addome.
È possibile eseguire esperimenti d'accoppiamento, ad esempio, per osservare se le femmine trovano più attraenti i maschi colorati con un determinato colore. In definitiva, questa tecnica di colorazione rappresenta un metodo rapido, semplice e non invasivo per etichettare insetti, facilitandone l'identificazione sperimentale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'asportazione di una parte dell'ala della mosca, è che è più rapida, meno invasiva e meno probabile che influisca sul comportamento successivo.
Questo metodo può essere utile in una vasta gamma di esperimenti in cui è importante identificare individui o classi di moscerini. È inoltre abbastanza semplice da poter essere utilizzato in esperimenti semplici nelle scuole o nei college. A dimostrazione di questa tecnica saranno Rudy Verse Bo e Chloe Hayes, entrambi studenti di dottorato presso l'Università di Liverpool. Dopo che il cibo si è raffreddato e solidificato, iniziare aggiungendo da 0,5 a un millilitro di colorante alimentare blu sulla superficie del cibo, distribuendo il colorante su tutta la superficie della provetta.
Quindi conservare il cibo a quattro gradi Celsius per due giorni per permettere alla dieta di essere assorbita dallo strato superiore del cibo. Successivamente, trasferire le mosche sul cibo in base alle esigenze dell'esperimento. Entro un giorno, le mosche trattate con la dieta possono essere facilmente distinte rispetto alle mosche non colorate, per eseguire una prova di accoppiamento con le mosche colorate.
Utilizzare un aspiratore per trasferire singoli maschi vergini in provette di plastica standard di 75 per 20 millimetri contenenti 20 millilitri di cibo. Se si esegue un test d'accoppiamento con due maschi, posizionare metà dei maschi di ciascun gruppo di trattamento in provette con cibo colorato. Successivamente, trasferire femmine appena emerse in provette con cibo fresco in gruppi di 10.
Ora lasciare che entrambi i sessi maturino fino all'età riproduttiva alla temperatura appropriata per la specie. Quando i drosophila sono pronti, sottoporre i maschi sperimentali al trattamento desiderato. Ad esempio, gli altri insetti vengono anestetizzati con anidride carbonica ed etichettare le provette per identificare sia il trattamento sia lo stato cromatico degli insetti il giorno precedente la prova.
Spostare le femmine in provette singole contenenti 20 millilitri di cibo per acclimatare i moscerini alla provetta di accoppiamento, etichettando le provette con etichette neutre per rendere cieco l'esperimento. Quindi aggiungere uno o due moscerini maschi a ciascuna provetta di accoppiamento contenente una singola femmina. Ove appropriato.
Iniziare la prova di accoppiamento in concomitanza con l'accensione delle luci nell'incubatore per due prove di accoppiamento maschili. Accertarsi che ciascun maschio provenga da un trattamento diverso e che un moscerino presenti una colorazione addominale. Registrare il trattamento e la colorazione di ciascun moscerino maschio.
Se l'accoppiamento avviene entro due ore, registrare lo stato del dado del maschio che si accoppia per le prove di accoppiamento con un singolo maschio. Registrare l'ora di inizio e di fine dell'accoppiamento. Successivamente, calcolare la latenza di successo nell'accoppiamento e i dati sulla durata della prova.
Il modello migliore trovato per spiegare la variazione nell'effetto dell'anidride carbonica. L'anestesia include la specie come fattore. Ad esempio, in questi esperimenti rappresentativi, l'anestesia con anidride carbonica non ha mostrato un effetto significativo sul successo riproduttivo di drosophila.
Pseudo obscure e drosophila sub obscure in due prove con maschi per drosophila melanogaster; tuttavia, si è osservato un successo riproduttivo significativamente inferiore nei maschi esposti all'anestesia con anidride carbonica, con un effetto ancora maggiore quando drosophila melanogaster erano esposti al gas al momento del prelievo o un giorno prima delle prove. Non sono state osservate differenze significative nell'accoppiamento nelle mosche allevate con cibo colorato per nessuna delle tre specie, né includendo il trattamento nell'analisi né lo stato riproduttivo degli insetti nelle prove di accoppiamento singole. Nessuna differenza nell'accoppiamento.
È stata osservata una latenza per ciascuna delle tre specie quando è stata utilizzata l'anestesia con anidride carbonica per raccogliere gli adulti appena emersi. Un effetto sulla durata dell'accoppiamento è stato mostrato soltanto dalle mosche drosophila sub obscure quando sono state esposte all'anidride carbonica due giorni prima delle prove di accoppiamento. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea chiara su come utilizzare la colorazione intestinale come tecnica non invasiva per etichettare le mosche durante i vostri esperimenti.
Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante verificare eventuali effetti del colorante di interesse sulla specie in esame. Alcuni coloranti possono essere tossici e alcuni colori possono influenzare direttamente il successo riproduttivo. Ad esempio, il colorante alimentare rosso potrebbe essere preferito in alcune specie.
Abbiamo utilizzato questa tecnica di colorazione per distinguere tra moscerini in prove di accoppiamento competitive. Tuttavia, può essere impiegata anche in una varietà di altri esperimenti in cui è necessario identificare singolarmente i moscerini, come saggi per valutare l'aggressività, la difesa del territorio, le preferenze alimentari o i comportamenti sociali.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo non invasivo per identificare singoli esemplari di Drosophila e altri insetti utilizzando coloranti alimentari. La tecnica consente un'agevole identificazione durante esperimenti comportamentali, mostrando risultati paragonabili o migliori rispetto ai metodi tradizionali come l'anestesia con CO2.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia del Comportamento
- Entomologia
Sfondo
- L'identificazione di singoli insetti è fondamentale per gli studi comportamentali.
- I metodi tradizionali possono essere invasivi e influenzare il comportamento.
- I coloranti alimentari offrono un'alternativa rapida e semplice.
- Questo metodo è adatto a diverse configurazioni sperimentali, inclusi istituti educativi.
Scopo dello studio
- Sviluppare una tecnica non invasiva per l'identificazione degli insetti.
- Valutare l'attrattiva di maschi di diverso colore nei confronti delle femmine.
- Confrontare l'efficacia di questo metodo con quella dell'anestesia da CO2.
Metodi Utilizzati
- Colorazione del cibo per Drosophila con colorante alimentare.
- Lasciare che le mosche si nutrano del cibo colorato per tre ore.
- Eseguire prove di accoppiamento con mosche colorate e non colorate.
- Registrare il successo riproduttivo e il comportamento in condizioni controllate.
Risultati principali
- Nessuna differenza significativa nel successo riproduttivo tra moscerini colorati e non colorati.
- L’anestesia con CO2 ha influenzato negativamente il successo riproduttivo in alcune specie.
- La tecnica del colorante si è rivelata efficace per l'identificazione individuale.
- Gli effetti comportamentali del colore del colorante dovrebbero essere testati per specie specifiche.
Conclusioni
- Il metodo del colorante alimentare è un'alternativa valida per l'identificazione degli insetti.
- Questa tecnica è meno invasiva e più rapida rispetto ai metodi tradizionali.
- Può essere applicata in diversi contesti sperimentali oltre ai test di accoppiamento.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I metodi di marcatura non invasivi sono fondamentali per mantenere l'integrità dei saggi comportamentali nei flussi di lavoro di validazione precoce delle target e di screening fenotipico. Questa tecnica basata su coloranti alimentari riduce le variabili di confondimento derivanti da procedure invasive, favorendo uno screening dei composti più affidabile e una riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta neurocomportamentale. L'approccio consente un'identificazione individuale scalabile e riproducibile tra diverse specie, in linea con le esigenze aziendali di modelli preclinici standardizzati.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente la verifica di ipotesi negli esperimenti sul comportamento riproduttivo senza introdurre artefatti comportamentali derivanti da etichettature invasive.
- Valore operativo: Fornisce un'identificazione individuale rapida ed economica, compatibile con disegni sperimentali ad alto rendimento.
- Valore predittivo: Supporta la validazione degli obiettivi isolando gli effetti genetici o farmacologici sul comportamento grazie a un rumore procedurale ridotto al minimo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera parametri comportamentali quantificabili (successo nell'accoppiamento, latenza, durata) con una variabilità tecnica ridotta.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dei saggi tra diversi laboratori grazie a una colorazione semplice e trasferibile basata sul cibo.
- Scalabilità: Compatibile con formati a multi-pozzetti e sistemi automatizzati di tracciamento per lo screening di librerie di composti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Permette il confronto comportamentale interspecifico (D. melanogaster, D. pseudoobscura, D. subobscura) per studi sulla conservazione degli obiettivi.
- De-risking meccanicistico: Consente la valutazione degli effetti di geni o composti sul comportamento senza interferenze indotte dall'anestesia.
- Conferma predittiva: Permette il monitoraggio longitudinale del comportamento in modelli rilevanti per le malattie in cui è richiesto un campionamento ripetuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della biologia della scoperta come fase di preelaborazione per la fenotipizzazione comportamentale, precedente all'esposizione al composto e alla raccolta dei dati negli schemi di identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta l'isolamento di variabili indipendenti (ad esempio genotipo, trattamento) garantendo un monitoraggio individuale coerente in diverse condizioni sperimentali.
- Screening: Permette misurazioni di base riproducibili, essenziali per rilevare lievi variazioni comportamentali negli screening di composti.
- Analisi: Produce dati comportamentali categoriali e temporali (stato riproduttivo, latenza, durata) adatti alla modellizzazione statistica e al calcolo dell'effetto.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'uso di endpoint comportamentali allineati a biomarcatori in modelli preclinici di disturbi neuropsichiatrici.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità di etichettatura indipendente dalla piattaforma, applicabile a svariati saggi comportamentali su insetti in contesti accademici e industriali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica eliminando i fattori di confondimento comportamentali dei metodi tradizionali di marcatura.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la confrontabilità tra laboratori grazie a un'identificazione standardizzata e non invasiva.
- Valore strategico: Aumenta la sicurezza nelle decisioni di avanzamento o interruzione nelle fasi iniziali della scoperta, migliorando il rapporto segnale-rumore del saggio.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione degli obiettivi in base al rischio grazie a dati fenotipici più accurati nelle cascade di validazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di saggi comportamentali e nella verifica della tolleranza ai coloranti specifica per specie.
- Si basa su attrezzature di laboratorio standard (provette, coloranti alimentari, aspiratori), senza necessità di strumentazione specializzata.
- Necessita di una standardizzazione del protocollo tra gruppi diversi per quanto riguarda concentrazione del colorante, tempo di esposizione e scelta del colore, in diversi sistemi modello.
- Comporta considerazioni adattative relative alla permeabilità del cuticolo e all'assorbimento dei pigmenti in diverse specie di insetti e stadi di sviluppo.
- Comprende limitazioni pratiche, come la potenziale tossicità dei coloranti o preferenze cromatiche specifiche per specie, che richiedono una validazione empirica.
