A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un'analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in
25 aprile 2015
Questo manoscritto descrive l'uso della tecnologia all'avanguardia fornita dai DNA-microarrays. I microarray forniscono una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri che si verificano in una condizione specifica. Inoltre, sottolineiamo la facilità con cui è possibile analizzare grandi quantità di dati utilizzando comodi pacchetti software sviluppati internamente.
L'obiettivo generale di questa procedura è fornire una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri indotti da una condizione specifica. Questo viene raggiunto innanzitutto coltivando e raccogliendo cellule batteriche in una condizione specifica. Successivamente, l'RNA totale viene isolato dalle cellule raccolte e il cDNA viene sintetizzato a partire dall'RNA.
Successivamente, i cDNA vengono marcati e ibridati su vetrini per microarray preparati in laboratorio. Infine, il vetrino viene lavato e quindi scansionato e analizzato. In ultima analisi, il microarray viene utilizzato per mostrare le variazioni trascrittomiche nelle cellule batteriche in condizioni specifiche.
Il principale vantaggio della tecnologia del DNA microarray rispetto ad altri metodi esistenti per lo studio dell'espressione genica, come la QPCR o il northern blotting, è che fornisce una panoramica globale di tutti i cambiamenti trascrittomici indotti in una specifica condizione. È rapida, affidabile e relativamente economica. A illustrare la procedura saranno Mohammed Sal e Airon Manzu, studenti PSD del mio laboratorio di genetica molecolare. Dopo lo scongelamento, s pmo, ED 39 pellet cellulari e risospendere in 400 microlitri di te secondo il protocollo indicato nel testo, preparare quanto segue in provette con tappo a vite prive di RNA: 0,5 grammi di perle di vetro, 50 microlitri di SDS al 10%, 500 microlitri di fenolo-cloroformio precedentemente preparato e i pellet cellulari risospesi.
Per rompere le cellule, inserire i tubi in un omogeneizzatore a sferette e omogeneizzare due volte per 60 secondi ciascuna, ponendo i tubi sul ghiaccio per un minuto tra un impulso e l'altro; quindi centrifugare i campioni a 10.000 G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire la fase superiore in un tubo nuovo e aggiungere 500 microlitri di cloroformio, quindi centrifugare per ulteriori cinque minuti. Pipettare 500 microlitri della fase superiore in tubi freschi.
Aggiungere due volumi di buffer di lisi e di legame e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta. Quindi, utilizzando un kit per l'isolamento dell'RNA, isolare l'RNA totale seguendo il protocollo del produttore per rimuovere l'RNA contaminato da DNA. Aggiungere 100 microlitri di D a's one mix e incubare a 15-25 gradi Celsius per 20-30 minuti.
Utilizzare il kit RN a per lavare l'RNA purificato ed eluire in un volume di 50 microlitri per eseguire la reazione di an kneeling in provette PCR da 300 microlitri. Mescolare l'RNA totale con due microlitri di monomeri casuali e utilizzare acqua priva di nucleasi se necessario per portare il volume a 18 microlitri. Incubare la miscela di an kneeling a 70 gradi Celsius per cinque minuti.
Quindi raffreddare le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti e centrifugare brevemente prima di posizionare i tubi sul ghiaccio per almeno un minuto. Per effettuare la trascrizione inversa del cDNA, preparare il mix di trascrizione inversa, unire 18 microlitri del mix con 12 microlitri del mix master e incubare la reazione a 42 gradi Celsius per due fino a 16 ore. Degradare l'mRNA dalla reazione aggiungendo tre microlitri di NaOH 2,5 M e incubare a 37 gradi Celsius per circa 15 minuti.
Quindi aggiungere 15 microlitri di acido fosforico due molare per neutralizzare l'NAOH. Successivamente, utilizzare colonne di purificazione PCR per purificare il cDNA e misurare la concentrazione di cDNA mediante spettrofotometro per etichettare il cDNA. Aggiungere cinque microlitri di un colorante reattivo ammino a 20-60 nanogrammi per microlitro di cDNA.
Collocare la miscela al buio e incubare a temperatura ambiente per 60-90 minuti prima di utilizzare colonne di purificazione PR per purificare il cDNA marcato, eluendo in 50 microlitri di tampone di eluizione. Con uno spettrofotometro, verificare che la concentrazione di cDNA marcato sia almeno di 0,5 picomoli per microlitro in un volume totale di 50 microlitri. Dopo aver preparato il tampone shy, secondo il protocollo indicato, preriscaldare il tampone a 68 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Per preparare il campione, unire quantità uguali di cDNA marcati, quindi utilizzare concentratori sotto vuoto ad alta temperatura per ridurre il volume a sette microlitri o meno.
Nel frattempo, per pulire le pellicole portacampioni e ridurre il segnale di fondo, utilizzare sapone e abbondante acqua corrente, seguiti da etanolo al 100% dopo aver asciugato le pellicole con aria. Posizionarne quindi una su un vetrino con la guarnizione bianca in teflon rivolta verso il basso. Successivamente, sciogliere i campioni di colorante essiccati in sette microlitri di H2O e incubare a 94 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere immediatamente 35 microlitri di tampone shy preriscaldato, mescolare delicatamente e centrifugare alla velocità massima per un minuto.
Per pellettizzare i precipitati, preriscaldare la sonda a 68 gradi Celsius per circa cinque minuti prima del caricamento. Per assemblare il vetrino e la lamella distanziatrice, posizionare il supporto per vetrini da ibridazione su un blocco termocontrollato a 50 gradi Celsius. Posizionare i vetrini per microarray di DNA con la lamella distanziatrice sul supporto riscaldato e preriscaldare il vetrino con la lamella distanziatrice per un minuto.
Quindi, aggiungere il più rapidamente possibile 40 microlitri del campione bersaglio all'estremità del vetrino. Lasciare che il liquido scorra tra le superfici di vetro per forza capillare. Ora rimuovere la cassetta di ibridazione preriscaldata dal forno di ibridazione e chiudere l'apparecchio.
Quindi posizionare una carta da filtro imbevuta di tre millilitri di 2 XSSC nella cassetta per ibridazione. Posizionare delicatamente il portavetrini per ibridazione con i vetrini all'interno della cassetta per ibridazione. Chiudere la cassetta per ibridazione e riposizionarla nel forno per ibridazione, quindi incubare per 16-18 ore.
Per lavare i vetrini, preparare freschi i tamponi di lavaggio uno, due e tre, e portarli a 30 gradi Celsius. Per assicurare che l'SDS si sciolga al termine dell'incubazione, immergere delicatamente i vetrini nel più breve tempo possibile in una provetta Falcon riempita con 50 millilitri di tampone di lavaggio uno, fino a quando il vetro si appoggia sul fondo della provetta. Dopo che il supporto scivola e affonda sul fondo della provetta senza graffiare l'array, utilizzare pinzette per rimuovere il vetrino e posizionarlo nel portavetrini della stazione di lavaggio.
Utilizzare immediatamente 500 millilitri di tampone di lavaggio uno per lavare i vetrini per cinque minuti. Successivamente, trasferire i vetrini nel tampone di lavaggio due per 20-30 minuti prima di trasferirli in 500 millilitri di tampone di lavaggio tre per cinque minuti. Infine, asciugare i vetrini a 2000 giri al minuto per due minuti prima di eseguire l'analisi con microarray.
Secondo il protocollo descritto, per studiare l'impatto dell'L-serina sul trascrittoma completo di S. pneumoniae, ceppo D39 Wildtype, è stata effettuata un'analisi con microarray del ceppo D39 coltivato in CDM con 150 micromolar di L-serina, rispetto a quello coltivato in 10 millimolar di L-serina nello stesso mezzo. Questa tabella elenca le concentrazioni di RNA totale isolato da ciascuna coltura, come mostrato in questa figura. Dopo l'eliminazione del DNA, è stata esaminata la qualità dell'RNA.
Queste due corsie rappresentano RNA da 150 micromolar di Seine e queste due corsie provengono da colture cresciute con 10 millimolar di seine. La presenza di due bande nitide indica un RNA di buona qualità. Le concentrazioni di cDNA sintetizzato da RNA totale sono registrate in questa colonna e quelle dei campioni marcati con il colorante reattivo AM sono elencate qui.
Un'analisi a dispersione del rapporto medio dei coloranti reattivi AM è mostrata in questa figura, e i dati sono stati ulteriormente analizzati per ridurre il rumore. Questa tabella riassume i risultati degli studi con microarray dopo aver applicato i criteri di una differenza maggiore o uguale a due volte e un valore P inferiore a 0,001. Come si può osservare, un certo numero di geni è stato espresso in modo differenziale in presenza di L-serina minima rispetto alla massima, seguendo questa procedura.
Altri metodi come beag, saggi su elettrociti, QPCR, knockout e/o valutazione dell'intensità di espressione possono essere utilizzati per rispondere alle domande successive dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha fornito ai ricercatori VFR nel campo della biologia molecolare e cellulare gli strumenti per esplorare le reti e i meccanismi regolatori nel RAM positivo.
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Panoramica
Questo manoscritto descrive l'uso di tecnologie all'avanguardia basate su microarray di DNA per analizzare le variazioni trascrittomiche nei batteri. Il processo prevede la coltivazione di cellule batteriche in condizioni specifiche, l'isolamento dell'RNA totale e l'utilizzo di un software sviluppato in sede per l'analisi dei dati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Genomica
- Bioinformatica
Sfondo
- I microarray di DNA sono strumenti potenti per lo studio dell'espressione genica.
- L'analisi trascrittomica aiuta a comprendere le risposte batteriche ai cambiamenti ambientali.
- Un software interno può facilitare l'analisi di grandi set di dati.
- Questo studio si concentra su una condizione specifica che influenza le cellule batteriche.
Scopo dello studio
- Fornire una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri.
- Dimostrare l'efficacia dei microarray di DNA nell'analizzare l'espressione genica.
- Evidenziare la facilità di analisi dei dati mediante software personalizzati.
Metodi Utilizzati
- Coltivazione e raccolta di cellule batteriche in condizioni specifiche.
- Isolamento dell'RNA totale dalle cellule raccolte.
- Conversione dell'RNA in cDNA.
- Etichettatura ed ibridazione dei cDNA su vetrini per microarray.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di RNA e conversione in cDNA.
- Ibridazione efficace dei cDNA su vetrini per microarray.
- L'analisi ha rivelato cambiamenti trascrittomici significativi.
- L'analisi dei dati è stata ottimizzata mediante l'uso di software interno.
Conclusioni
- I microarray di DNA sono efficaci per lo studio della trascrittomica batterica.
- Un software personalizzato migliora le capacità di analisi dei dati.
- Questa metodologia può essere applicata a diversi studi batterici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La tecnologia dei microarray di DNA consente un profilo trascrittomico globale rapido ed economico nei sistemi batterici, supportando la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di agenti antimicrobici. Catturando le risposte trascrizionali a livello del genoma a stimoli ambientali come la disponibilità di nutrienti, questo metodo fornisce una previsione affidabile sulla modulazione dei percorsi metabolici e sulle reti di regolazione genica. Ciò facilita la selezione precoce delle ipotesi e la priorizzazione del portafoglio nelle fasi iniziali dei processi di ricerca e sviluppo di agenti antibatterici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi delle risposte trascrizionali alla disponibilità di serina, chiarificando le reti di regolazione genica in S. pneumoniae.
- Valore operativo: Fornisce un flusso di lavoro standardizzato dalla raccolta delle cellule all'analisi dei dati, mediante protocolli ottimizzati di isolamento ed etichettatura dell'RNA.
- Valore predittivo: Identifica geni differenzialmente espressi con variazione ≥2 volte e p<0,001, supportando la fiducia nella modulazione degli obiettivi in condizioni definite.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera profili quantitativi di espressione su scala genomica, consentendo il confronto degli stati trascrizionali in diverse condizioni di crescita.
- Valore operativo: Utilizza vetrini microarray prodotti in laboratorio e tamponi standardizzati per ibridazione e lavaggio, garantendo riproducibilità e segnale di fondo ridotto.
- Scalabilità: Consente l'elaborazione in parallelo di più campioni mediante concentrazione sotto vuoto e scansione automatizzata per l'analisi successiva.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega le risposte trascrizionali in vitro a una potenziale rilevanza in vivo modellando condizioni di stress nutrizionale riscontrate durante l'infezione.
- De-risking Meccanicistico: Chiarisce la regolazione genica dipendente dalla serina, riducendo l'incertezza riguardo all'essenzialità del bersaglio e alle strategie di inibizione del percorso.
- Allineamento Preclinico: Permette l'identificazione di cluster genici co-regolati che potrebbero rappresentare percorsi farmacologicamente sfruttabili o modulatori della virulenza.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la generazione di ipotesi nella validazione del bersaglio e guidando l'identificazione di composti promettenti attraverso approfondite conoscenze meccanistiche dell'adattamento batterico.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi e la validazione funzionale dei bersagli rivelando il riprogrammamento trascrizionale specifico per condizione.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi adatti alla prontezza del saggio e al confronto tra diverse condizioni nelle campagne di screening antimicrobico.
- Analisi: Utilizza Microprep per la pre-elaborazione e Cyber-T per l'analisi statistica, consentendo l'identificazione robusta di cambiamenti significativi nell'espressione.
- Ricerca traslazionale: Collega le osservazioni di laboratorio alla rilevanza patogena modellando le pressioni metaboliche associate all'ospite.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per il profilo del trascrittoma in diverse ceppi batterici e condizioni di crescita.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla regolazione genica mediante un profilo di espressione globale e privo di pregiudizi.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità grazie a controlli standardizzati sulla qualità dell'RNA, soglie di marcatura con coloranti e protocolli di lavaggio delle lamelle.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze precoci dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Impatto sul portafoglio: Permette un avanzamento proporzionato al rischio evidenziando geni essenziali specifici delle condizioni e centri regolatori.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura batterica, nella manipolazione dell'RNA e nelle tecniche di ibridazione con microarray.
- Dipende dall'accesso a strumentazione per la scansione di microarray e a strumenti di quantificazione spettrofotometrica.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi di lavoro per quanto riguarda l'isolamento dell'RNA, l'efficienza di marcatura e i flussi operativi di preelaborazione dei dati.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a modelli batterici Gram-negativi o fastidiosi.
- È limitato dalla necessità di conoscere in anticipo la sequenza per progettare sonde per microarray fatte in casa.
