A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un'analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in Streptococcus pneumoniae

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri che si verificano in una condizione specifica. Ciò si ottiene coltivando e raccogliendo prima le cellule batteriche in una condizione specifica. Successivamente, l'RNA totale viene isolato dalle cellule raccolte e il CDNA viene prodotto dall'RNA.

Quindi i CDNA vengono etichettati e ibridati in microvetrini di analisi realizzati internamente. Infine, il vetrino viene lavato, dopodiché i vetrini vengono scansionati e analizzati. In definitiva, il microarray viene utilizzato per mostrare i cambiamenti trascrittomici nelle cellule batteriche in condizioni specifiche.

Il vantaggio principale della tecnologia dei microarray di DNA rispetto ad altri metodi esistenti per lo studio dell'espressione genica, come la QPCR o il northern blotting, è che fornisce una panoramica globale di tutti i cambiamenti trascrittomici subiti in una specifica condizione. È veloce, affidabile e relativamente economico. A dimostrare la procedura saranno Mohammed Sal e Airon Manzù, studenti PSD del mio laboratorio di genetica molecolare Dopo lo scongelamento, s pmo, pellet cellulari ED 39 e Resus sospesi in 400 microlitri di te secondo il protocollo di testo, preparare quanto segue in provette con tappo a vite prive di RNA, 0,5 grammi di perle di vetro, 50 microlitri di 10% SDS, 500 microlitri di cloroformio fenolico precedentemente preparato e i pellet cellulari risospesi.

Per rompere le cellule, posizionare le provette in un battitore a perline e omogeneizzarle due volte per 60 secondi ciascuna, mettendole in ghiaccio per un minuto tra un impulso e l'altro, quindi centrifugare i campioni a 10.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire la fase superiore in una provetta nuova, e a 500 microlitri di cloroformio i a, a e centrifugare per altri cinque minuti. Pipettare 500 microlitri dalla fase superiore a provette fresche.

Aggiungere due volumi di tampone legante la lisi e mescolare pipettando verso l'alto e verso il basso. Quindi, utilizzando un kit di isolamento dell'RNA, isolare l'RNA totale seguendo il protocollo del produttore per rimuovere il DNA contaminante dall'RNA. Aggiungere 100 microlitri di una miscela di D a e incubare a 15-25 gradi Celsius per 20-30 minuti.

Utilizzare il kit RN a per lavare l'RNA pulito ed eluire in un volume di 50 microlitri per eseguire la reazione di inginocchiamento in provette PCR da 300 microlitri. Mescolare l'RNA totale con due microlitri di monomeri casuali e utilizzare acqua priva di nucleasi, se necessario, per portare il volume fino a 18 microlitri. Incubare la miscela in ginocchio a 70 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi raffreddare le reazioni a temperatura ambiente per 10 minuti e farle girare velocemente prima di mettere le provette sul ghiaccio per almeno un minuto. Per trascrivere il CDNA, preparare la miscela di trascrizione inversa, combinare 18 microlitri di miscela con 12 microlitri di master mix e incubare la reazione a 42 gradi Celsius per due-16 ore. Degradare l'mRNA dalla reazione aggiungendo tre microlitri di 2,5 molari e un OH e posizionarlo a 37 gradi Celsius per circa 15 minuti.

Quindi aggiungere 15 microlitri di acido libero a due cumuli molari per neutralizzare il NAOH. Quindi, dopo aver utilizzato le colonne di pulizia PCR per purificare il CDNA con uno spettrofotometro, misurare la concentrazione di CDNA per etichettare il CDNA. Aggiungere cinque microlitri di un colorante reattivo medio a 20-60 nanogrammi per microlitro di CDNA.

Porre la miscela al buio e incubata a temperatura ambiente per 60-90 minuti prima di utilizzare le colonne di pulizia PR per purificare il CDNA marcato con colorante eludendo 50 microlitri di tampone di evoluzione con uno spettrofotometro, assicurarsi che la concentrazione di CDNA marcato sia di almeno 0,5 moli pico per microlitro in un volume totale di 50 microlitri. Dopo aver preparato il tampone timido, secondo il protocollo di testo, preriscaldate il tampone a 68 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Per preparare il campione, combinare quantità uguali di CDNA marcati, quindi utilizzare concentratori sottovuoto ad alta temperatura per ridurre il volume a sette microlitri o meno.

Nel frattempo, per pulire gli scivoli del sollevatore per ridurre il segnale di fondo, utilizzare sapone e abbondante acqua del rubinetto, seguiti da etanolo al 100% dopo aver asciugato i vetrini del sollevatore, posizionarne uno su uno scivolo con il rivestimento in teflon bianco rivolto verso il basso. Successivamente, sciogliere i campioni di colorante essiccati in sette microlitri di H2O e incubare a 94 gradi Celsius per due minuti. Aggiungere immediatamente 35 microlitri di tampone timido preriscaldato, mescolare delicatamente e centrifugare e velocità massima per un minuto.

Per far precipitare i pellet, preriscaldare la sonda a 68 gradi Celsius per circa cinque minuti prima di caricarla. Per assemblare la slitta e il sollevatore, posizionare il supporto della diapositiva di ibridazione su un blocco termico a 50 gradi Celsius. Posizionare i vetrini di DNA microarray con la slitta di sollevamento sul supporto riscaldato per vetrini di ibridazione e preriscaldare il vetrino con la slitta di sollevamento per un minuto.

Quindi, il più rapidamente possibile, aggiungere 40 microlitri del target del campione alla fine del vetrino. Lasciare che il fluido fluisca tra le superfici del vetro con una forza capillare. A questo punto, rimuovere la cassetta di ibridazione di preriscaldamento dal forno di ibridazione e chiudere la macchina.

Quindi posizionare la carta da filtro imbevuta di tre millilitri di due XSSC nella cassetta di ibridazione. Posizionare delicatamente il supporto del carrello di ibridazione con i vetrini nella cassetta di ibridazione. Chiudere la cassetta di ibridazione e rimetterla nel forno di ibridazione e incubare per 16-18 ore.

Per lavare i vetrini, preparare i tamponi di lavaggio freschi uno, due e tre e posizionarli a 30 gradi Celsius. Per garantire che la SDS si dissolva al termine dell'incubazione, immergere delicatamente i vetrini il più rapidamente possibile in una provetta Falcon riempita con 50 millilitri di tampone di lavaggio, uno fino a quando il vetro non si trova sul fondo della provetta. Dopo che il sollevatore scivola, affonda sul fondo del tubo senza graffiare l'array, usa una pinzetta per rimuovere il vetrino e mettilo nel cestello della stazione di lavaggio.

Utilizzare immediatamente 500 millilitri di tampone di lavaggio uno per lavare i vetrini per cinque minuti. Quindi trasferire i vetrini nel tampone di lavaggio due per 20-30 minuti prima di trasferirli in 500 millilitri di tampone di lavaggio tre per cinque minuti. Infine, asciugare i vetrini a 2000 giri/min per due minuti prima di eseguire l'analisi dei microarray.

Secondo il protocollo di testo per studiare l'impatto della L serina sull'intero trascrittoma della polmonite da S, è stata eseguita l'analisi microarray del ceppo D 39 Wildtype del ceppo D 39 coltivato in CDM con 150 micromolari di L Seine, rispetto a quello coltivato in 10 millimolari di l Seine nello stesso terreno. Questa tabella elenca le concentrazioni di RNA totale isolato da ciascuna coltura, come mostrato in questa figura. Dopo aver rimosso il DNA, è stata esaminata la qualità dell'RNA.

Queste due corsie rappresentano l'RNA di 150 micromolari di Senna e queste due corsie provengono da colture coltivate con sciabiche da 10 millimolari. La presenza di due bande chiare indica una buona qualità dell'RNA. Le concentrazioni di CDNA sintetizzate dall'RNA totale sono registrate in questa colonna e i campioni medi di coloranti reattivi AM marcati sono elencati qui.

In questa figura si vede un'analisi a dispersione del rapporto medio dei die reattivi AM e i dati sono stati ulteriormente analizzati per ridurre il rumore. Questa tabella riassume i risultati degli studi sui microarray dopo aver applicato i criteri di maggiore o uguale a una differenza doppia e un valore P inferiore a 0,001. Come si vede qui, un certo numero di geni sono stati espressi in modo differenziale in presenza di L serina minima rispetto alla massima Seguendo questa procedura.

Altri metodi come beag, saggi di elettrociti, QPCR, knockout e/o forza di espressione possono essere utilizzati per rispondere alle domande imminenti dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori VFR nel campo della biologia molecolare e cellulare di esplorare le reti e i meccanismi regolatori nella RAM positiva.