Name: Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Impara a produrre microparticelle linfocitarie da linee cellulari T e a rilevarne gli effetti pro-apoptotici sulle cellule epiteliali delle vie aeree. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di danno bronchiale in vitro.

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Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research (178.918), Fonds de recherche en santé du Québec - Vision Health Network Research.

NOTA: Maschio C57BL / 6 topi (5-7 settimane) sono da Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Quebec, Canada.) E manipolati secondo protocolli approvati dalla Sainte-Justine Comitato Animal Care CHU. Espianti di tessuto bronchiale mouse forniscono una buona fonte di cellule epiteliali bronchiali primarie per lo studio degli effetti proapoptotici di LMPS sulle cellule epiteliali. Questo protocollo descrive la generazione in vitro di LMPS, nonché un metodo per la rilevazione di cellule epiteliali apoptotiche su espianti tissutali bronchiali LMPS trattati. Questo protocollo è costituito da 3 sezioni. 1. LMPS produzione e caratterizzazione NOTA: Per prevenire la contaminazione, in modo che tutti i materiali usati in questo esperimento sono sterili o in autoclave. Eseguire tutti i passaggi a RT in una cappa di sicurezza biologica in condizioni sterili, se non diversamente indicato. 1.1) La stimolazione e Collezione dei deputati9 <ol><li> Scongelare una aliquota di 10 milioni di cellule T CEM in un bagno di 37 ° C dell&#39;acqua. Diluire in 10 ml preriscaldata medio ematopoietiche come X-VIVO, in 15 ml provetta sterile e centrifugare a 200 gx 5 min senza siero. Aspirare le cellule surnatante e risospendere in 5 ml di media pre-riscaldato. </li><li> Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissutale T75 (per cellule in sospensione) con 15 ml di media ematopoietiche pre-riscaldato come X-VIVO e incubare per 4 giorni in un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Dopo 4 giorni, trasferire tutto il terreno di coltura e le cellule in un pallone di coltura tissutale T175 contenente 100 ml di mezzo fresco. Continuare incubando le cellule per circa 72 ore nelle stesse condizioni sono cresciuti fino ad una densità di 2 milioni di cellule / ml. </li><li> Uniformemente dividere le celle tra quattro beute T175 ciascuna contenente 150 ml di mezzo fresco e continuano coltura cellulare fino cellule sono cresciute (circa 48 ore di incubazione) ad una densità di 2 milioni / ml. </li><li&gt; Raccogliere cellule da ciascuna beuta per centrifugazione a 200 xg per 5 min e risospendere 300 x 10 6 cellule in un pallone nuovo T175 contenente 150 ml di mezzo fresco, per mantenere il 2 milioni / ml densità cellulare. </li><li> Aggiungere actinomicina D (disciolto in DMSO a 2 mg / ml) al mezzo ad una concentrazione finale di 0,5 mg / ml e incubare per 24 ore. </li><li> Trasferire tutto il terreno di coltura in 50 ml provette coniche e centrifugare le cellule a 750 xg per 5 min. Trasferire il surnatante in 50 ml provette coniche e centrifugare a 1500 xg per 15 minuti per rimuovere frammenti di cellule di grandi dimensioni. </li><li> Trasferire il surnatante in una bottiglia da 250 ml e ultracentrifuga a 12.000 g per 50 min. Eliminare il surnatante e raccogliere pellet. </li><li> Pellets Wash LMPS-arricchito con 40 ml di PBS sterile in un tubo da 50 ml per centrifugazione a 12.000 xg per 50 min. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Raccogliere l&#39;ultima surnatante lavaggio; sarà usato come controllo del veicolo. Sospendere il pellet LMPS a 1ml di PBS e trasferire in un 1,5 ml provetta sterile. Aliquota e conservare isolati LMPS a -80 ° C (per evitare più cicli senza disgelo). </li></ol> 1.2) Caratterizzazione dei parlamentari su Analisi FACS 4 <ol><li> Preparare 2 campioni di tampone annexin, 1 con e altre senza CaCl 2: Hepes 10 mM, NaCl 140 mm, più o meno 5 mM CaCl 2. </li><li> Filtro tampone annessina e FACS liquido guaina flusso utilizzando un filtro 0,22 micron per rimuovere le particelle. </li><li> Diluire 1 ml di LMPS in 44 ml di tampone annexin con 5 mM CaCl 2 in un tubo FACS. Preparare un altro tubo di 1 ml di LMPS in 44 ml di tampone annexin senza CaCl 2 (controllo negativo). </li><li> Aggiungere 5 ml di annexinV-Cy5 in ciascuna provetta e mescolare bene. Incubare per 15 minuti a RT al buio. Arrestare la reazione diluendo la miscela con 400 ml di FACS liquido guaina flusso in ciascun tubo. </li><li> Aggiungere 10 ml (200.000 perle) di bea conteggio 7 micronsospensione ds come standard interno in ciascuna provetta per ottenere un conteggio assoluto. </li><li> Stabilire porte di dimensioni relative (FSC-H, PMT E00, log di scala) e relativo granularità (SSC-H, PMT 325, scala logaritmica) trama puntino sul citofluorimetro utilizzando perline fluorescenti dimensioni-calibrato di 1 micron (gate 1) e contando perline cancello 7 micron (gate 2). </li><li> Analizzare il campione LMPS on FSC-H / SSC-H plot utilizzando le porte consolidate e FL-4 canali per annexin (PMT 765, scala logaritmica) diagramma bidimensionale, con l&#39;acquisizione di un segnale fino a 20.000 conteggio sfere sono raggiungibili in porta 2. </li><li> Determinare gli eventi annexinV positivi di LMPS in tampone annexin contenente CaCl 2, e quindi sottrarre gli eventi di LMPS nel buffer annexin senza CaCl 2 (controllo negativo). </li><li> Calcolare il numero assoluto di MP basati sulla seguente equazione: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> 1.3) Determinazione della MP Protein Concentrazione (Bradford Assay) <ol><li> Preparare 5 diluizioni seriali di standard proteine ​​1,25-20 ug / ml. Pipettare 800 ml di ogni soluzione standard e campione in una provetta pulita in duplice copia. Aggiungere 200 ml di Bradford reagente colorante per ogni provetta. Mescolare bene, poi incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 595 nm. Determinare la concentrazione di proteine ​​della LMPS utilizzando la regressione lineare della curva standard. </li></ol> 2. espianti tessuto bronchiale e LMPS Trattamento NOTA: Prestare particolare attenzione all&#39;ambiente di lavoro sterile e asettico preparare le soluzioni ei media utilizzati in seguito esperimenti. Per preparare la completa guarigione medio, aggiungere 1 ml di tessuto di guarigione medio Supplementi con siero (scongelati su ghiaccio) a 100 ml Tissue guarigione medio e mescolare bene. 2.1) Preparazione di bronchiali espianti di tessuto <ol><li> Prima di coltura, graffiare 6 aree di 1 cm 2ciascuno al bordo della superficie di ogni piatto di coltura tissutale 100 mm con una lama di bisturi. Cappotto ogni graffiato 100 millimetri di tessuto piatto cultura con 2 ml di soluzione di rivestimento piatto cultura, e incubare il piatto in un umidificata CO 2 incubatore O / N a 37 ° C. Vacuum aspirare la soluzione surplus e riempire il piatto con 15 ml di tessuto di lavaggio medio. </li><li> Euthanize C57BL / 6 topi (5-7 settimane) da CO 2 inalazione secondo protocolli approvati dal comitato etico per la cura degli animali. </li><li> Asetticamente sezionare tessuto polmonare con bisturi, Dumont super fine pinzetta, e forbici chirurgiche. Rimuovere con attenzione i vasi sanguigni e parenchima. Mettere tessuto polmonare in ghiaccio-freddo di lavaggio del tessuto medio per il trasporto al laboratorio, se applicabile. </li><li> Ulteriori sezionare bronchi sommerso nel lavaggio dei tessuti Medium e separare bronco con un diametro di 1 a 2,5 mm dal tessuto polmonare periferici. Slice tessuti bronchiali in anelli bronchiali ~ 5 millimetri di spessore con un bisturi. </li&gt; <li> Utilizzare un movimento scavare con le pinze sterili microdissecting curve per raccogliere i frammenti bronchiali e metterli sulle zone graffiate dei piatti. </li><li> Rimuovere il tessuto lavaggio medio, e incubare i frammenti a temperatura ambiente per ~ 5 minuti per consentire loro di aderire ai piatti. </li><li> Aggiungere 10 ml di completa guarigione medio per ogni piatto e metterli in atmosfera controllata camera dell&#39;incubatore modulare. Lavare la camera ad alta O 2 miscela di gas (70% O 2, 25% N 2 e 5% CO 2,). Posizionare la camera in un incubatore orbitale da banco e scuoterla a 37 ° C. Agitare la camera per 24 ore a 10 cicli al minuto per consentire al mezzo di fluire intermittente per i frammenti. </li><li> Dopo 24 ore di incubazione, osservare le espianti di tessuto al microscopio ottico a contrasto di fase invertita. Selezionare espianti bronchiali con assoluta, il movimento capelli fini e vivace dell&#39;epitelio bronchiale per il successivo trattamento LMPS. </li></ol>2.2) LMPS Trattamento <ol><li> Preparare il terreno di coltura completo come segue: media integratori crescita disgelo con siero e fibroblasti inibitore sul ghiaccio. Aggiungere 1 ml di supplementi di media crescita con siero e 200 inibitore fibroblasti ml a 100 ml di terreno di coltura; mescolare accuratamente. Riscaldare il terreno di coltura completo a 37 ° C per 10 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Diluire LMPS isolato in una nuova provetta eppendorf sterile con PBS per preparare uno stock LMPS ad una concentrazione di 800 ug / ml. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di mezzo completo Growth a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale 12 pozzetti. </li><li> Trasferire gli espianti bronchiali selezionati con le pinze microdissecting curve dal protocollo precedente (punto 2.1) in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale. </li><li> Etichettare la piastra di coltura appropriato per identificare LMPS pozzi di trattamento e pozzetti di controllo. Aggiungere 25 ml LMPS magazzino in ogni trattamento LMPS bene (per una concentrazione finale di 40 mg / ml) e 25 veicoli di controllo microlitri (vedi LMP<html> produzione s) per i pozzetti di controllo. </li><li> Continuare l&#39;incubazione in atmosfera controllata modulare camera di incubazione a 37 ° C agitando delicatamente. </li><li> Dopo 24 ore, lavare espianti 3 volte con PBS e procedere al (fissaggio 4% paraformaldeide [PFA]) passo successivo. </li></ol> 3. Esame istopatologico 3.1) Preparare i Solutions segue prima di procedere alle prossime tappe <ol><li> Preparare tampone PBS 1x miscelando 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.76 mM KH 2 PO 4, pH 7.4. </li><li> Per preparare 4% PFA, sciogliere 20 g di PFA in 400 ml di acqua, riscaldata a 60 ° C sotto agitazione; aggiungere qualche goccia di 10 M NaOH per cancellare la soluzione. Successivamente aggiungere PBS 1x e regolare il volume a 500 ml e il pH a 7,4. Filtro e un&#39;aliquota; conservare a -20 ° C. </li><li> Preparare i seguenti reagenti di disidratazione o di reidratazione; 100%, 90%, 70%, 50% etanolo e xilene. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) Espianto Fixation e Sezioni di Tessuto Deparaffinizzazione <ol><li> Mettete ogni espianto in una provetta etichettata con 1,5 ml di 4% PFA e incubare O / N a 4 ° C. Sciacquare gli espianti due volte con 1x PBS. </li><li> Disidratare espianti attraverso una serie di alcool (etanolo al 70%: 3 volte 30 minuti ciascuno; il 90% di etanolo: 2 volte 30 minuti ciascuno; 100% di etanolo: 3 volte 30 minuti ciascuno, quindi xilene: 3 volte 20 minuti ciascuno). Eseguire tutti i passaggi a RT in una cappa aspirante. </li><li> Imbed espianti tissutali in paraffina a 58 ° C in un forno. Preparare 5 micron sezioni di tessuto di spessore con un microtomo rotativo. </li><li> Galleggiante sezioni in un bagno di 56 ° C dell&#39;acqua, e poi montare le sezioni su vetrini istologici etichettati. Porre i vetrini in rack di colorazione manuale e secca a 65 ° C per 1 ora. Lasciare raffreddare i vetrini a temperatura ambiente. </li><li> Immergere le rastrelliere in 4 piatti macchia consecutivi contenenti xilene per 10 minuti ciascuno per rimuovere la paraffina. Immergere le rastrelliere in una serie di etanolo per rimuovere xilene: 100%, quindi il 95%, then 80%, poi 70%, poi 50% di etanolo (5 min per ogni passo). Sciacquare le rastrelliere con acqua di rubinetto per 5 minuti per eliminare l&#39;etanolo. </li></ol> 3.3) ematossilina e eosina (H &amp; E) di colorazione <ol><li> Continuare a lavorare con le sezioni di tessuto fissate; la cremagliera in un piatto di colorazione riempito con ematossilina di Mayer per 15 min. Sciacquare il rack con acqua di rubinetto per rimuovere Hematoxylin per 20 min. </li><li> Mettere in acqua distillata per 30 sec.Place in etanolo al 95% per 30 sec. Mettere in Eosina Y piatto soluzione colorante per 1 min. Disidratare attraverso 2 cambi di etanolo al 95%, 100% etanolo e xilene per 2 minuti ciascuna. </li><li> Eseguire un rapido controllo al microscopio per assicurare che l&#39;eccesso eosina viene rimosso. Mettere 2 o 3 gocce di mezzo di montaggio (Fisher SP15-100) su ogni vetrino, quindi coprire con un vetro di copertura. </li></ol> 3.4) In Situ cella della morte di rilevazione: TUNEL Assay <ol><li> Prima di iniziare, preparare proteinasi soluzione di lavoro K: 20 mg / ml aTris 10 mM / HCl, pH 7.4. </li><li> Ripetere i passaggi da 1 a 5 della Sezione 3.2 (fissazione Espianto e tessuti sezione deparaffinizzazione). Sciacquare i vetrini con deionizzata H 2 O. </li><li> Immergere i vetrini con 1x PBS per 10 min. Scolare l&#39;eccesso di PBS. Incubare sezioni di tessuto per 30 minuti a RT con soluzione di lavoro proteinasi K. Sciacquare scivola due volte con 1x PBS. </li><li> Eseguire il saggio TUNEL come descritto nel manuale di istruzioni del kit di rilevamento morte cellulare. Montare con mezzo di montaggio, e applicare il coprioggetto manualmente con vetrino. </li><li> Analizzare i campioni al microscopio ottico. Utilizzare Image Pro 4.5 per analizzare le cellule apoptotiche in colore marrone. </li></ol>

<ol><li>Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+microparticles+in+the+pathogenesis+of+cardiovascular+disease%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).</li>
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<li>Maeno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+Cells+are+required+for+inflammation+and+destruction+in+cigarette+smoke-induced+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice.</a> J Immunol. 178 (12), 8090-8096 (2007).</li>
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<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shed+membrane+particles+from+T+lymphocytes+impair+endothelial+function+and+regulate+endothelial+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Shed membrane particles from T lymphocytes impair endothelial function and regulate endothelial protein expression.</a> Circulation. 109 (13), 1653-1659 (2004).</li>
<li>Shet, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li>
<li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles%3A+protagonists+of+a+novel+communication+network+for+intercellular+information+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Microparticles: protagonists of a novel communication network for intercellular information exchange.</a> Circ Res. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li>
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<li>Soleti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticles+harboring+Sonic+Hedgehog+promote+angiogenesis+through+the+upregulation+of+adhesion+proteins+and+proangiogenic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Microparticles harboring Sonic Hedgehog promote angiogenesis through the upregulation of adhesion proteins and proangiogenic factors.</a> Carcinogenesis. 30 (4), 580-588 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Parlamentari sono mediatori attivi intercellulare diafonia e il loro studio è promettente in molte aree della scienza. 11 Lo studio ha presentato un protocollo dettagliato per la generazione in vitro su larga scala di LMPS derivato da una linea di cellule T apoptotico. Questi parlamentari esprimono un vasto repertorio di molecole di linfociti e sono biologicamente implicati nella regolazione dell&#39;omeostasi cellulare e tissutale. Tuttavia, LMPS provenienti da fonti diverse può essere biologicament...

Le microparticelle (MP) sono vescicole di membrana submicroniche biologicamente attive rilasciate in seguito all'attivazione cellulare o all'apoptosi. Le MP derivano sia da cellule sane che danneggiate e sono implicate in molti processi fisiologici e patologici. 1 MP sono stati rilevati non solo nel plasma umano, ma anche nel tessuto infiammatorio e apoptotico. L'utilità biologica delle MP derivate dalla membrana cellulare è stata dimostrata in vari contesti, inclusi modelli di segnalazione cellulare e come strumenti farmacologici. 2,3 Abbiamo precedentemente dimostrato che le LMP derivate dai linfociti T in seguito alla stimolazione con actinomicina D (per indurre l'apoptosi) sopprimono l'angiogenesi e inibiscono la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule endoteliali. 4,5 Gli effetti antiangiogenici delle LMP possono variare significativamente a seconda degli stimoli utilizzati per attivare i linfociti T in vitro. 6
L'epitelio delle vie aeree funziona come una barriera fisica e funzionale protettiva. L'aumento del numero di linfociti T nelle vie aeree può contribuire al danno cellulare e all'infiammazione delle vie aeree. 7 Abbiamo dimostrato che le LMP inducono l'apoptosi delle cellule epiteliali bronchiali umane,8 il che indica che le LMP possono modificare la funzione di barriera dell'epitelio bronchiale in vivo. Le cellule apoptotiche possono essere identificate utilizzando il metodo TUNEL, che rileva la frammentazione del DNA in situ. 
L'obiettivo generale di questo protocollo è illustrare la produzione in vitro di LMP da una linea cellulare di linfociti T e dimostrare il loro effetto proapoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree. Il rilevamento della morte cellulare in situ ha dimostrato che le LMP inducono fortemente la morte delle cellule epiteliali bronchiali delle vie aeree, suggerendo che la lesione mediata dalle LMP all'epitelio delle vie aeree può influire sulla funzione di barriera dell'epitelio danneggiato.

<table><tbody><tr><td>Produzione e caratterizzazione</td><td></td><td></td><td></td>di LMP</tr><tr><td>Cellule T CEM&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 medio&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina&nbsp; D&nbsp;</td><td>Sigma Chemical Co.</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &; m filtro</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td>559933</tr><tr><td>Soluzione di flusso FACS</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti (1 &micro; m)</td><td>Sonde molecolari&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>Perle di conteggio in polisterene (7 &micro; m)</td><td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>Provette FACS</td><td>in polipropilene Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 1 ml</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 5 ml</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>pipetta da 25 ml</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>microprovetta conica in polipropilene da 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica in polipropilene da 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polipropilene copolimero ad alta velocità da 50 ml</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>Flacone in polipropilene ad alta velocità da 250 ml</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Protein assay (Bradford assay)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Standard per il dosaggio delle proteine II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>Provetta 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>Provetta 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore cellulare&nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a bassa velocità</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad alta velocità per flacone da 250 ml</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad alta velocità per provetta da 50 ml</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Citometria di Fow</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Beckman</td><td>Series 600</td><td></td></tr><tr><td>Espianti e sezioni di tessuto bronchiale&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi (5-7 settimane)&nbsp; &nbsp;</td><td>Laboratori Charles River, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vie aeree di topo PrimaCell&trade; Sistema:</td><td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Rib-Back Lame per bisturi in acciaio al carbonio</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td> <td># 10</td></tr><tr><td>Manico per bisturi</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>microscopio invertito a contrasto di fase</td><td>Olympus Optical CO., LTD. &nbsp; &nbsp;</td>Miscela di gas <td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>ad alto O2</td><td>VitalAire Canada Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>camera per incubatore modulare</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 agitatore orbitale incubato</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale in plastica (100 mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14060-09</td><td>Dritto, affilato, 9 cm di lunghezza</td></tr><tr><td>Half-curved Graefe pinze</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>incubatore a CO2 umidificato</td><td>Mandel Scientific Company Inc.</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Esame istopatologico&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>formalina formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>paraffina</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internazionale, Inc.</td>Alcool etilico <td>T555</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Merck KGaA, Darmstadt</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; glutaraldeide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>vetrini per microscopio</td><td>VWR Scientific Inc.</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher scientific&nbsp; Internazionale, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina di Mayer</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>MHS16</td><td>Imbuto con carta da filtro &nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Fisher scientifico&nbsp; Internazionale, Inc. &nbsp;</td><td>A144s-500</td><td></td></tr><tr><td>eosin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>HT110116</td><td>Imbuto con carta da filtro&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&commercio; Mezzo di montaggio</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>vetrino coprioggetti</td><td>surgipath medical industries, Inc.</td><td>84503</td><td>24& volte; 24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento TUNEL Rilevamento della</td><td>morte cellulare in situ, forno POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>Despatch</td><td>Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>microtomo rotativo</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>carta da filtro</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Imaging Giappone Inc.</td>Piatto di colorazione <td>E800</td><td></td></tr><tr><td>completo</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>incluso piatto, griglia, coperchio</td></tr><tr><td>1,5 ml tubo eppendorf</td><td>Sarstedt Inc.</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua orbitale e alternativo</td> 39x10 mm <td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>cappa</td><td>aspirante Nicram RD Service</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

L&#39;interesse per i ruoli biologici delle cellule vescicole membrana derivata nella comunicazione cellula-cellula è aumentato negli ultimi anni. Microparticelle (MPS) sono un tale tipo di vescicole, che vanno a diametro da 0,1 micron a 1 micron, e tipicamente capannone dalla membrana plasmatica delle cellule eucariotiche in fase di attivazione o apoptosi. Qui si descrive la generazione di linfociti T di derivazione microparticelle (LMPS) da apoptosi delle cellule T CEM stimolate con actinomicina D. LMPS sono isolati attraverso un processo di centrifugazione differenziale più gradi e caratterizzate con citometria a flusso. Questo protocollo presenta anche un metodo di rilevamento morte cellulare in situ per dimostrare l&#39;effetto della proapoptotico LMPS sulle cellule epiteliali bronchiali derivate da topi primari espianti tissutali bronchiali respiratorie. Metodi qui descritti forniscono una procedura riproducibile per isolare quantità abbondanti di LMPS da linfociti apoptotici in vitro. LMPS derivatoin questo modo può essere utilizzato per valutare le caratteristiche dei vari modelli di malattia, e farmacologia e test tossicologici. Dato che l&#39;epitelio delle vie aeree offre una barriera fisica e funzionale protettivo tra l&#39;ambiente esterno e del tessuto sottostante, uso di espianti tissutali bronchiali piuttosto che linee cellulari epiteliali immortalizzate fornisce un modello efficace per le indagini richiedono tessuti delle vie aeree.

LMPS sono stati caratterizzati con annessina V colorazione 10 da cellule fluorescenza attivate (FACS) analisi e recintato con 1 micron perle in cui il 97% dei parlamentari (≤1 micron) erano annessina-V-Cy5 positivi (Figura 1A e 1B). In genere, circa 2,5 mg di LMPS stati ottenuti seguendo questo protocollo. Espianti tessuto bronchiale da topi C57BL / 6 sono stati sottoposti a trattamento veicolo e LMPS. Analisi istopatologica delle sezioni bronchiali rivelato l&#39;effetto LMPS sulla integrità...

Microparticelle di membrana-capannone cellule (MPS) sono vescicole biologici attivi che possono essere isolate e loro effetti fisiopatologici esaminato in vari modelli. Qui si descrive un metodo per la generazione di parlamentari provenienti dai linfociti T (LMPS) e per dimostrare il loro effetto pro-apoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree.

Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è illustrare la produzione in vitro di microparticelle linfocitiche o LMP da una linea cellulare di linfociti T e dimostrarne l'effetto pro-apoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree. Questo viene ottenuto innanzitutto producendo le LMP. Successivamente, le LMP isolate vengono caratterizzate mediante analisi fax.Successivamente, gli espianti di tessuto bronchiale vengono coltivati. Infine, viene effettuato il trattamento con LMP sugli espianti bronchiali. In ultima analisi, esami istopatologici come ematossilina, eosina e la rilevazione della morte cellulare mediante NC due vengono utilizzati per dimostrare il danno al livello epiteliale bronchiale indotto da LMP e l'apoptosi delle cellule epiteliali.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'isolamento di microparticelle dal sangue periferico umano, è che siamo in grado di eseguire una generazione su larga scala di microparticelle derivate da una linea cellulare mediante azione in vitro. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà poiché i passaggi critici della coltura di espianto bronchiale

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Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo i protocolli per la raccolta murini macrofagi alveolari, che risiedono le cellule immunitarie innate nei polmoni, e di esaminare la loro attivazione in risposta a co-coltura con nanoparticelle polianidride.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Questo video dimostra la generazione e l'isolamento di microparticelle derivate dai linfociti T, LMP, dai linfociti T dopo il trattamento con actinomicina-D.

Isolamento di microparticelle derivate da linfociti T apoptotici in vitro

Si descrive un metodo per la generazione di precisione intercettato Lung fette (PCLS) e immunocolorazione loro di visualizzare la localizzazione dei vari tipi di cellule immunitarie nel polmone. Il nostro protocollo può essere esteso per visualizzare la posizione e la funzione dei diversi tipi di cellule in una varietà di condizioni.

Taglio di precisione polmone mouse Fette per la visualizzazione in diretta cellule dendritiche polmonare

Nuovi protocolli sono descritti qui per isolare e caratterizzare microparticelle derivate dall'essere umano e del mouse neutrofili. Questi protocolli utilizzano ultracentrifugazione, citometria a flusso e tecniche di immunoblotting per analizzare il contenuto di microparticelle, e sono utilizzabili per studiare il ruolo delle microparticelle derivate da vari tipi di cellule nella funzione cellulare.

Isolamento e caratterizzazione delle microparticelle neutrofilo per studi funzionali

Descriviamo la rilevazione di NLRP3 inflammasome attivazione su base cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza e la macchiatura per active caspasi-1 e l'adattatore, ASC. Un test di rilascio di lattato deidrogenasi è presentato per rilevare pyroptotic lisi su base di popolazione. Queste tecniche possono essere adattate per studiare molti aspetti della biologia inflammasome.

Rilevamento di attivazione Inflammasome e morte delle cellule Pyroptotic in macrofagi murini derivate da midollo osseo

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l'esposizione all'ozono, un criterio di inquinante dell'aria, imponga l'efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull'efferocitosi del macrofagio alveolar.

Valutazione In Vivo dell'efferocitosi del macrofago alveo dopo l'esposizione all'ozono

Descriviamo un protocollo per un modello di co-coltura tridimensionale di vie aeree infette, utilizzando CFBE41o- cellule, macrofagi THP-1 e Pseudomonas aeruginosa, stabilito presso l'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce una nuova piattaforma per testare simultaneamente l'efficacia antibiotica, la funzione della barriera epiteliale e i marcatori infiammatori.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Presentato qui è un metodo riproducibile, economico e robusto per l'isolamento e l'espansione delle cellule epiteliali bronchiali primarie per il biobanking a lungo termine e la generazione di cellule epiteliali differenziate mediante coltura all'interfaccia aria-liquido.

Isolare le cellule epiteliali bronchiali dal tessuto polmonare resecato per il biobanking e stabilire colture di interfaccia aria-liquido ben differenziate

Impara a produrre microparticelle linfocitarie da linee cellulari T e a rilevarne gli effetti pro-apoptotici sulle cellule epiteliali delle vie aeree. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di danno bronchiale in vitro.

Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

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