Generazione di linfocitica microparticelle e rilevamento del loro effetto pro-apoptotico su cellule delle vie aeree epiteliali

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare la produzione in vitro di microparticelle linfocitiche o LMP da una linea cellulare di linfociti T e dimostrare il loro effetto pro apoptotico sulle cellule epiteliali delle vie aeree. Ciò si ottiene producendo prima gli LMP. Successivamente, gli LMP isolati sono caratterizzati dall'analisi fax.

Quindi vengono colturati gli espianti di tessuto bronchiale. Infine, viene effettuato il trattamento LMP su espianti bronchiali. In definitiva, gli esami istopatologici come l'emato, il toino e l'eosina e il rilevamento della morte di due cellule NC vengono utilizzati per mostrare il danno allo strato epiteliale bronchiale indotto da LMP e l'apoptosi delle cellule epiteliali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'isolamento di microparticelle dal sangue periferico umano è che siamo in grado di eseguire la generazione su larga scala di microparticelle derivate da una linea cellulare in vitro. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché i passaggi critici della cultura della bronchia explan non sono facili da preparare. Per iniziare la cultura.

Le cellule CEMT in quattro fiasche T 1 75 contenenti ciascuna 150 millilitri di fresco, terreno e incubano a 37 gradi Celsius fino a una densità di 2 milioni di cellule per millilitro. Raccogliere le celle da ciascun pallone mediante centrifugazione a 200 volte G per cinque minuti e piegare nuovamente 300 volte 10 alle sei celle in un nuovo pallone T 1 75 contenente 150 millilitri di terreno fresco. Per mantenere la densità di 2 milioni di cellule per millilitro, aggiungere 37,5 microlitri di actina micina D al terreno a una concentrazione finale di 0,5 microgrammi per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore.

Trasferire tutto il terreno di coltura in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare le cellule a 750 volte G per cinque minuti. Quindi trasferire il surnatante in provette coniche da 50 millilitri e centrifugare a 1500 volte G per 15 minuti per rimuovere i frammenti cellulari di grandi dimensioni. Successivamente, trasferire il surnatante in un flacone da 250 millilitri e centrifugare a 12.000 volte G per 50 minuti.

Quindi scartare il surnatante e raccogliere i pellet. Utilizzare 40 millilitri di PBS sterile per lavare i pellet arricchiti di LMP in una provetta da 50 millilitri e centrifugare a 12.000 volte G per 50 minuti. Ripetere questo passaggio due volte.

Raccogliere il surnatante dall'ultimo lavaggio da utilizzare come controllo del veicolo con un millilitro di PBS. Sospendere i pellet e trasferirli in una microprovetta sterile da 1,5 millilitri e conservare le LMP isolate a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per caratterizzare le microparticelle mediante analisi via fax, iniziare preparando due campioni di un tampone nexina, uno con cloruro di calcio e uno senza calcio.

In una provetta per fax, diluire un microlitro di LMP in 44 microlitri di tampone nexina con cloruro di calcio. Preparare un'altra provetta utilizzando un tampone nexina senza cloruro di calcio. Quindi, aggiungere cinque microlitri di X e V sci five a ciascuna provetta e mescolare bene incubando al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, utilizzare 400 microlitri di liquido per guaine antinfluenzali fax. Per fermare le reazioni, aggiungere 10 microlitri di sospensione di microsfere di conteggio da sette micron come standard interno in ogni provetta. Per ottenere un conteggio assoluto, stabilire porte di dimensione relativa, FSCH e granularità relativa SSCH e dot plot sul citometro a flusso.

Utilizzando perle fluorescenti calibrate di dimensioni di un micrometro per il cancello uno e contando le perle a sette micrometri. Per il secondo cancello, analizzare il campione LMP su un grafico F-S-C-H-S-S-C-H utilizzando i gate stabiliti e il canale FL quattro per il dot plot dell'annessina acquisendo un segnale fino a quando non vengono raggiunte 10.000 perle di conteggio nell'andatura due, determinare il positivo negli eventi ex NV di LMP nel tampone nexina contenente cloruro di calcio e sottrarre gli eventi di LMP nel tampone nexina senza cloruro di calcio. Calcola il numero assoluto di LMP in base alla seguente equazione.

Utilizza bisturi dumont pinzette super sottili e forbici chirurgiche per sezionare in modo asettico il tessuto polmonare. Rimuovere con cura il parenchima e i vasi sanguigni. Sezionare ulteriormente il bronco immerso nel mezzo di lavaggio dei tessuti e separare il bronco con un diametro da uno a 2,5 millimetri dai tessuti polmonari periferici.

Usa un bisturi per tagliare i tessuti bronchiali in ranghi bronchiali spessi circa cinque millimetri usando un movimento di raccolta con le pinze da micro dissezione curve sterili. Raccogli i frammenti bronchiali e posizionali sulle zone graffiate dei piatti precedentemente preparati. Secondo il protocollo di testo, rimuovere il mezzo di lavaggio dei tessuti e incubare i frammenti a temperatura ambiente per circa cinque minuti per consentire loro di aderire alle stoviglie.

Aggiungere 10 millilitri di terreno curativo completo a ciascun piatto e posizionarli in una camera di incubazione modulare ad atmosfera controllata con una miscela di gas ad alto contenuto di ossigeno, lavare la camera, quindi posizionarla in un incubatore orbitale da banco e agitarla a 37 gradi Celsius per 24 ore a 10 cicli al minuto per consentire al mezzo di fluire in modo intermittente sui frammenti. Dopo l'incubazione, osservare l'esposizione del tessuto al microscopio a contrasto di fase e a luce invertita. Selezionare l'explan bronchiale con movimento completo dei peli fini e un vivace epitelio bronchiale per il successivo trattamento LMP.

Per trattare le LMP, contare l'explan bronchiale appena selezionato e contrassegnare ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Per ogni explan, trasferire 0,5 millilitri di terreno di coltura completo in una provetta einor sterile. Quindi aggiungere 25 microlitri di stock l e p per piano di trattamento o aggiungere 25 microlitri di veicolo di controllo.

Per gli espianti di controllo mescolare bene picchiettando delicatamente il tubo. Trasferire il terreno miscelato in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale contrassegnata a 12 pozzetti con pinza per micro dissezione curva. Trasferire ogni piano bronchiale x selezionato in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale.

Continuare l'incubazione in una camera di incubazione modulare ad atmosfera controllata a 37 gradi Celsius con agitazione delicata dopo 24 ore. Utilizzare PBS per lavare l'EXPLAN tre volte e procedere alla fissazione h ed e alla colorazione a tunnel Secondo il protocollo di testo come mostrato qui, le LMP sono state caratterizzate con una colorazione con nexina V mediante analisi fax e gated utilizzando perle da un micrometro dove il 97% delle mps erano in nexina V sci-fi positive.

In genere, sono stati ottenuti circa 2,5 milligrammi di LMP seguendo questo protocollo. Spiegazione del tessuto bronchiale da C 57 sei topi neri sono stati sottoposti a trattamento con veicolo e LMP. In questa figura, l'analisi istopatologica delle sezioni bronchiali rivela l'effetto delle LMP sull'integrità strutturale dell'epitelio bronchiale.

In controllo. Explan, l'epitelio bronchiale era in gran parte intatto. Tuttavia, negli espianti trattati con LMP, lo strato di cellule epiteliali superficiali è stato danneggiato o perso e si sono verificate diminuzioni significative dell'altezza e della densità delle cellule epiteliali, come si vede qui.

La colorazione tunnel positiva, un marcatore per l'apoptosi, era più pronunciata nell'epitelio bronchiale trattato con LMP rispetto al tessuto di controllo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di lavorare in condizioni sterili durante la produzione di microparticelle e l'esecuzione della coltura di explan dei tessuti.