Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i cambiamenti nelle proprietà di membrana dei neuroni sensoriali olfattivi in risposta agli stimolanti degli odori. Ciò si ottiene sezionando prima l'epitelio olfattivo e trasferendolo in una camera perfusa. Il secondo passo consiste nell'individuare e scegliere un OSN di interesse al microscopio.

La manopola dendritica dell'OSN scelto viene quindi bloccata e analizzata mentre viene stimolata con odoranti. In definitiva, il patch clampaggio perforato delle manopole dendritiche OSN caratterizza le proprietà funzionali OSN a livello di membrana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'olfatto, come la registrazione olfattiva e sensoriale, l'espressione di recettori olfattivi definiti e anche le registrazioni di patch clamp.

Fornire informazioni sulle proprietà di membrana di questi neuroni. Preparare le pipette stimolanti da un millimetro di vetro o acquistarle pre tirate utilizzando una fiamma. Piegare sei pipette a circa un centimetro dalla punta a un angolo di 45 gradi.

Quindi disporre le sei pipette con punta piegata attorno a una settima pipetta diritta, utilizzando un occhiello come guida, e avvolgerle in un tubo termorestringente. Riscaldare la pellicola termoretraibile all'altra estremità delle pipette. Applicare più pellicola termoretraibile.

Questo rende una pipetta stimolante prepo a sette barili. Ora, utilizzando una pistola polare multi barrel, la pipetta stimolante a sette cilindri. Una volta tirato, rinforzare l'assemblaggio con un po' di colla bianca attorno all'occhiello.

Quindi lasciare asciugare la colla per una notte delle soluzioni richieste. La soluzione di nistatina deve essere preparata fresca appena prima di essere utilizzata. Quando necessario, pesare tre milligrammi di nistatina e aggiungerli a 50 microlitri di DMSO.

Quindi frullare a vortice per 20 secondi. Quindi, sonicare la miscela per due o tre minuti per garantire una diluizione completa. Ora aggiungi 20 microlitri della miscela a cinque millilitri di soluzione madre intracellulare.

Il mix di Vortex dura 20 secondi, seguito da due o tre minuti di sonicazione. Quindi raffreddare la soluzione di lavoro sul ghiaccio e tenerla al riparo dalla luce preparata. In questo modo la soluzione di lavoro è buona per alcune ore.

Caricare una siringa dotata di microfilm con la soluzione di lavoro. Andrà bene per un'ora di utilizzo fino a quando non verrà utilizzato. Tuttavia, conservare la siringa carica tenendola in ghiaccio.

Ora estrai alcuni elettrodi di registrazione con colli lunghi e aperture di due micron. L'obiettivo è quello di ottenere una resistenza da 15 a 20 mega ohm una volta caricata con la soluzione di nistatina. Infine, caricare la pipetta stimolante con l'odorizzante diluito in ringer. Soluzione.

Per questo protocollo, avere a disposizione topi di età compresa tra due e quattro settimane. In questa presentazione, i topi che esprimono o IRES tau GFP vengono utilizzati utilizzando o IS tau GFP topi. Tutti i neuroni che esprimono l'o di interesse saranno marcati con GFP.

Questo metodo può essere utilizzato o espresso in tutte le zone. Tuttavia, le dissezioni e le registrazioni saranno più facili per le OR espresse nella zona dorsale. Inizia anestetizzando e poi decapitando un topo.

L'esito di questo protocollo dipende dalla qualità della dissezione. Queste fasi di dissezione devono essere il più brevi possibile ed essere precise. Per iniziare l'intervento, utilizzare le forbici da dissezione per eseguire un taglio longitudinale lungo il dorso.

Separare la pelle per rimuoverla. Quindi taglia lungo la mascella inferiore e fai un taglio coronale parallelo ai denti. Pertanto, rimuovere i denti incisivi superiori.

Ora fai un taglio coronale intorno alla testa, dietro gli occhi, scarta la testa posteriore e trasferisci la parte anteriore su suonerie ghiacciate. Ora sotto un microscopio da dissezione, isolare il setto entro 5-10 minuti. Inizia con un taglio longitudinale lungo il lato ventrale.

Quindi tagliare le ossa dorsali longitudinalmente lungo il lato laterale dorsale della cavità nasale. Quindi, rimuovere la maggior parte delle ossa e del palato. Trasferire il setto isolato e attaccare l'epitelio a un contenitore di suonerie ossigenate a temperatura ambiente.

Entro cinque minuti, fare gli ultimi preparativi prima di registrare. La soluzione non deve essere troppo calda, altrimenti la preparazione sembrerà danneggiata. Per accedere al neuroepitelio per la registrazione.

Innanzitutto, sbucciare l'epitelio dal setto sottostante con una pinza. Quindi, utilizzando le micro forbici Vanna, tagliare l'estremità anteriore del setto per rilasciare l'epitelio. Ora rimuovi con cura l'organo nasale del vomer.

Taglialo dove è attaccato dorsalmente. L'epitelio isolato può ora essere spostato nella camera di registrazione con il lato del muco rivolto verso l'alto. Una volta in posizione, usa un'arpa per appiattire il tessuto.

Quindi trasferire la camera su un microscopio verticale. Visualizza il neuroepitelio sotto un obiettivo a immersione in acqua 40 x mentre lo perfondi continuamente con suonerie fresche a temperatura ambiente. Per iniziare la ricerca delle cellule di interesse, che in questo caso esprimono EGFP, viene utilizzata una luce a 480 nanometri per scansionare le cellule che emettono luce nell'intervallo da 530 a 550 nanometri.

Le protuberanze dendritiche mirate e l'osn, quando esaminati a 80-160 x in campo chiaro, dovrebbero essere chiaramente distinguibili dalle celle di supporto. Ora caricare l'elettrodo con una soluzione di statina S. Battere le bolle che si formano e collegare l'elettrodo al supporto.

Ora applica una certa pressione positiva. La resistenza prevista è compresa tra 15 e 20 mega ohm. Quindi portare l'elettrodo alla cella mantenendo la pressione positiva.

Quando la resistenza aumenta a circa 40 mega ohm, rilasciare la pressione e applicare una leggera pressione negativa. Se viene realizzata una tenuta giga, il potenziale della membrana deve essere bloccato a circa 75 millivolt negativi. Ora che la cella è aperta, procedi con l'esperimento.

Applicare stimolazioni, protocolli e perfondere con trattamenti farmacologici secondo necessità per testare con un singolo odorante. Registra da 200 a 500 millisecondi di attività spontanea. Applicare l'odorizzante per 500 millisecondi e quindi misurare le risposte per un massimo di 10 secondi utilizzando il protocollo descritto.

MOR 23, che esprimono neuroni marcati con EGFP, sono stati patchati e stimolati con diverse concentrazioni di al. In modalità current clamp, lyal è un ligando per MOR 23. In alternativa, le celle sono state simulate in modalità voltage clamp.

Nelle registrazioni in modalità morsetto di tensione, sono state monitorate diverse caratteristiche. Per quantificare la risposta eseguita classicamente in elettrofisiologia utilizzando la risposta di massima ampiezza, la risposta alla dose è stata tracciata utilizzando l'equazione di hill. Questi risultati forniscono informazioni sulle proprietà di codifica di ciascun OSN, che includono la soglia di rilevamento, il temporale, il dinamico, l'intervallo dinamico e il livello di saturazione.

Una volta padroneggiata, la parte di dissezione di questa tecnica può essere eseguita entro 10-15 minuti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esplorare le proprietà funzionali dei neuroni sensoriali olfattivi che esprimono recettori olfattivi definiti nei topi.