Name: Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara la tecnica di patch-clamp perforato per registrare le proprietà membranali dei neuroni sensoriali olfattivi in topi geneticamente modificati. Questo metodo consente di analizzare le risposte a specifici odoranti.

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Gli autori desiderano ringraziare Peter Mombaerts per il generoso dono dei topi OR-GFP; Anne Lefranc e la struttura per animali CSGA per un'eccellente cura degli animali. Il finanziamento è stato fornito dal CNRS attraverso sovvenzioni ATIP e ATIP Plus, dal Conseil Régional de Bourgogne (sovvenzioni FABER e PARI), dall'Université de Bourgogne (programma BQR).

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della Université de Bourgogne ed è stato approvato dal comitato etico Université de Bourgogne. 1. Gli animali <ol><li> Utilizzare tecniche di ingegneria genetica topi OR-IRES-tauGFP disponibili presso il laboratorio di Jackson. Questi topi sono stati sviluppati in laboratorio Dr. Peter Mombaerts &#39;al fine di analizzare il targeting degli assoni e lo sviluppo del sistema olfattivo 19. Ad esempio, la linea di MOR23-IRES-tauGFP, fotografia numero 006.643, porta il nome della razza ufficiale B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; allo stesso modo, la linea SR1-IRES-tauGFP, fotografia numero 6717 porta il nome di B6 ufficiale; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li> Per quanto riguarda l&#39;età degli animali: per un migliore risultato del protocollo, utilizzare animali tra 2 e 4 settimane di età. In questa fascia di età, la dissezione è più facile (ossa più morbide, più solida epitelio olfattivo) e le manopole dendritiche sono bigger confrontare animali più vecchi. </li></ol> 2. Preparazione di elettrodi e soluzioni <ol><li> Per le pipette stimolanti: acquisto prepulled stimolante pipette. In caso contrario, li prepara manualmente. <ol><li> Utilizzando una fiamma, piegare sei pipette di vetro di 1 mm circa 1 cm dalla punta. Inserire queste sei pipette più un diritto 7 ° in 1,5 centimetri termoretraibile tubi rafforzare da un occhiello. </li><li> Termoretraibile il tubo per mantenere i barili legati insieme. Collegare un guaina termoretraibile supplementare agli altri estremità delle canne. Tirare la pipetta stimolante con un estrattore multi-barile. </li><li> Aggiungete un po &#39;di liquido colla bianca intorno l&#39;occhiello di rafforzare le punte piegate. Lasciate asciugare O / N. </li></ol></li><li> Preparare 1 o 2 L di soluzione extracellulare normale di Ringer (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl 2 2, NaHCO3 26, NaH 2 PO 4 1.25, glucosio 15; pH 7,6 e 305 mOsm). Conservare a 4 ° Cfino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare soluzione madre intracellulare (in mm): KCl 70, KOH 53, acido metansolfonico 30, EGTA 5, HEPES 10, di saccarosio 70; pH 7.2 (KOH) e 310 mOsm. Conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Buon per diverse settimane. </li><li> Preparare la soluzione intracellulare di registrazione con nistatina estemporanea (all&#39;ultimo minuto) prima dell&#39;esperimento. <ol><li> Pesare 3 mg di nistatina, aggiungere 50 ml di DMSO; vortex 20 sec poi sonicare 2-3 minuti fino a quando tutto diluito. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di DMSO-nystatin in 5 ml di soluzione madre intracellulare. Vortex 20 sec, poi sonicare 3 min. Conservare questa soluzione a 4 ° C e proteggere dalla luce diretta, nistatina è sensibile alla luce. Questa soluzione può essere utilizzata per alcune ore. Sostituire ogni giorno. </li><li> Una volta che la preparazione epitelio olfattivo è sotto il microscopio, prendere alcuni di questa soluzione in una siringa da 1 ml con una punta gialla allungata fiamma per riempire gli elettrodi; proteggere dalla luce diretta. Una volta a RT, la soluzione nistatinanon è stabile; sostituire la soluzione nella siringa da 1 ml ogni ora o tenerlo in ghiaccio. </li></ol></li><li> Tirare elettrodi di registrazione con un estrattore per ottenere il collo lungo e piccola mancia (~ 2 micron) con una resistenza di 15-20 MW con la soluzione nistatina interna. </li><li> Preparare la soluzione odorizzante a 0,5 M in DMSO sotto cappa; Un&#39;aliquota e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Diluire odorizzante in soluzione di Ringer fino alla concentrazione desiderata. Riempire la pipetta stimolante. </li></ol> 3. Preparazione di epitelio olfattivo Nota: i topi OR-IRES-tauGFP esprimono il tauGFP sotto il controllo del promotore OR. In questi topi, tutti i neuroni che esprimono l&#39;OR di interesse sono etichettati con GFP. Questo protocollo è adattato per RUP espressi in tutte le zone. Tuttavia, dissezioni e registrazioni sono più facili per RUP espresse nella zona dorsale. <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale iniettando una miscela di ketamina e xilazina (150 mg / kg e 10 mg / kg bodPeso y, rispettivamente). Decapitazione può essere effettuata con forbici affilate per i topi giovani o con ghigliottina roditore corretta manutenzione per i topi più anziani. <ol><li> Utilizzando anelli forbici dissezione fare una incisione longitudinale mediale attraverso la pelle dorsale. Togliere la pelle tirandolo a parte. Utilizzando le forbici, tagliare le ganasce inferiori alla mandibola. Rimuovere i denti anteriori superiori da un taglio coronale parallelo ai denti. </li><li> Fare un taglio coronale della testa dietro gli occhi e mantenere solo la parte anteriore della testa. Immergerlo in soluzione di Ringer ghiacciata per la dissezione nell&#39;ambito di applicazione. </li></ol></li><li> Sezionare nell&#39;ambito di applicazione: nel lato ventrale, un taglio longitudinale lungo la mascella superiore / i denti. Tagliare le ossa dorsali longitudinalmente, seguendo il lato dorso-laterale della cavità nasale. Rimuovere la maggior parte delle ossa e del palato; trasferire il setto e l&#39;epitelio collegato ad esso in ossigenato Ringer a RT. </li><li> Per la dissezione finale: Poco prima di iniziare la registrazionesessione, staccarsi l&#39;epitelio dal setto sottostante con una pinza. Staccare l&#39;epitelio con una pinza e con due tagli 4-5 mm forbice (uso microvannas forbici) alla parte anteriore del setto, dove l&#39;adesione è più forte. <ol><li> Rimuovere con cautela l&#39;organo vomeronasale, tagliando fuori lungo il suo collegamento dorsale all&#39;epitelio settale. Trasferire l&#39;epitelio ad una camera di registrazione con lo strato di muco rivolto verso l&#39;alto; tenere piatta nella camera con l&#39;arpa. </li></ol></li><li> Installare camera sotto un microscopio verticale dotato di ottica di fluorescenza e una macchina fotografica sensibile. Visualizzare la preparazione sullo schermo del computer ad alto ingrandimento attraverso un obiettivo 40X acqua-immersion (apertura numerica 0,8) e un 2X o 4X supplementare ottenuto da una lente di ingrandimento. Profumato continuamente con ossigenato Ringer a RT (1-2 ml / min). </li></ol> 4. sessione di registrazione <ol><li> Cerca cell fluorescente: eccitare la preparazione a 480nm per EGFP, che emette luce nel range 530-550 nm; indirizzare una manopola dendritiche, che è affidabile visibile in fluorescenza e in campo luminoso. </li><li> Riempire l&#39;elettrodo con la soluzione intracellulare con nystatin; rimuovere le bolle picchiettando delicatamente sul dell&#39;elettrodo. </li><li> Inserire elettrodo sul portaelettrodo, applicare una pressione positiva nella pipetta; La resistenza dovrebbe essere 15-20 MW. </li><li> Portare l&#39;elettrodo vicino alla cella; una volta che la resistenza raggiunge ~ 40 MW, scaricare la pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per raggiungere un gigaseal. </li><li> Raggiunta sigillo, impostare il potenziale di membrana a circa -75 mV; </li><li> Una volta che la cellula si apre, procedere con protocolli di stimolazione, trattamenti farmacologici. Per misurare la risposta ad una singola stimolazione odorizzante, annotazione 200-500 msec di attività spontanea, stimolare per 500 msec e misurare la risposta della cella fino a 10 sec 13. Per i trattamenti farmacologici, profumato gli agenti farmacologici inla concentrazione desiderata 20. </li></ol> Analisi 5. I dati <ol><li> Analizzare correnti indotte da stimolazione odorizzante come seguito: l&#39;ampiezza massima, il tempo di salita (tempo necessario per raggiungere il 90% della massima ampiezza, in msec), la corrente totale (area sotto la curva in PAS), il tempo al 50% (tempo tra l&#39;inizio e l&#39;offset della risposta al 50% della massima ampiezza, in msec). <ol><li> Utilizzando le correnti di picco di trasduzione (ampiezza massima raggiunta) a diverse concentrazioni, disegnare e montare una curva dose-risposta con la seguente equazione Hill: I = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / C) n), dove I rappresenta la corrente di picco , Imax la massima risposta a concentrazioni saturazione, K1 / 2 la concentrazione alla quale è stato raggiunto metà della risposta massima, C la concentrazione di odorizzante ed n il coefficiente di Hill. </li></ol></li><li> Analizzare registrazioni di potenziale di membrana a pinza per la massima depolarizzazione, la totapotenziale l suscitato (area sotto la curva in mVsec); registrazione spontanea attività spiking oltre 30 sec a 1 min registrazioni; record di eccitabilità attraverso picchi indotte da iniezione di correnti (5-10 Pa). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

La capacità di questo protocollo per monitorare correttamente le proprietà di OSNs sani dipende fortemente dalla qualità della preparazione. Pertanto, la procedura di dissezione sono fondamentali. Innanzitutto è fondamentale prestare attenzione alla qualità (pH, osmolarità), l&#39;ossigenazione e temperatura (ghiacciata ma non congelato) del mezzo dissezione. In secondo luogo, la manipolazione dell&#39;epitelio con strumenti di dissezione deve essere limitata come possibile per evitare danni. Infine, è fondamentale per ...

Neuroni sensoriali olfattivi (OSN) rappresentano il primo passo della percezione olfattiva. Situato nell&#39;epitelio olfattivo rivestimento della cavità nasale nei roditori, trasformano l&#39;informazione chimica di odori in potenziali d&#39;azione inviati attraverso il loro assone al cervello. Per meglio comprendere i meccanismi di codifica olfattive, è necessario caratterizzare le proprietà di trasduzione e membrana di OSNs. Fino a poco tempo fa, la maggior parte delle tecniche utilizzate per caratterizzare le proprietà di OSNs mammiferi sono stati effettuati su dissociato OSNs 1-4. Il processo di dissociazione utilizza diversi (ad esempio, enzimi) processi meccanici e chimici per liberare i OSNs dal loro ambiente. Questi processi inducono un basso numero di cellule disponibili per le registrazioni. Questo numero basso può essere ancora più critico nel caso di cellule GFP etichettati. Dissociazione rimuove anche le interazioni locali cellula-cellula tra OSNs e altre cellule dell&#39;epitelio olfattivo che possono aumentare survivabilityAl e modulazione delle proprietà OSN. Al fine di bypassare la procedura di dissociazione, una preparazione intatto è stato sviluppato 5. Ogni OSN esprime un recettore olfattivo (OR) selezionati da una famiglia numerosa multigene 6. Ci sono ~ 1000 RUP espresse nella principale epitelio olfattivo nel topo. A causa del gran numero di OR in tipo animali selvatici, le possibilità di registrare OSNs esprimono la stessa OR sono molto basse. Per superare queste limitazioni, gene targeting topi sono disponibili in cui tutti OSNs esprimono un identificato o sono etichettati con una proteina fluorescente 7-9. Questi OSNs etichettati sono stati usati per fare l&#39;analisi funzionale in preparazioni dissociate 7,10,11 con gli inconvenienti citati in precedenza. Un intatto preparazione epitelio 5 da topi geneticamente etichettati elude quindi questi problemi. Esso consente il monitoraggio dell&#39;attività di OSNs esprimenti RUP precisamente definite in un ambiente il più vicino in vivo possibile. Inoltre, patch-clamp di OSNs consentono anche l&#39;analisi precisa di proprietà di membrana, via di trasduzione del farmacologia, ligando / o interazioni. Tutti questi argomenti difficilmente possono essere analizzati utilizzando registrazioni extracellulari. Abbiamo usato questa tecnica per monitorare le risposte dei OSNs che esprimono i recettori olfattivi SR1 e MOR23 12,13. La fattibilità della tecnica è stata confermata da altri gruppi su MOR23 esprimenti OSNs 14 nonché su altri RUP esprimenti neuroni 15,16. Il monitoraggio di una popolazione definita di OSNs può portare alla analisi delle loro proprietà in diversi contesti quali lo sviluppo 14, invecchiamento 17, odorizzante indotta plasticità 18, e il ruolo delle variazioni di sequenza del recettore odorizzante in odore codifica 15. Questo protocollo prevede quindi un potente strumento per monitorare le proprietà funzionali di OSNs definiti a livello della membrana.

<table><tbody><tr>tavolo <td>vibrante con gabbia di Faraday</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIES</td><td>richiesto: isola il sistema di registrazione dalle vibrazioni indotte dall'ambiente (movimenti dello sperimentatore, vibrazioni di apparecchiature come ventole per il raffreddamento dei computer, ecc.); può essere acquistato anche con una gabbia di Faraday, oppure equipaggiato con una gabbia di Faraday su misura; questa gabbia è consigliata per evitare il rumore elettrico dell'ottica ambientale</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>microcope verticale dotato di epifluorescenza; tavolino fisso o mobile a seconda delle preferenze dell'utente</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>LUMPLFL40XW</td><td>almeno 2 obiettivi richiesti: uno 4X o 10X per l'avvicinamento grossolano alla cella; e un esempio 40X a immersione a lunga distanza Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3,3 MM</td></tr><tr><td>lente d'ingrandimento</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>ASSOLUTAMENTE RICHIESTO: posizionato nel percorso luminoso tra l'obiettivo e la fotocamera; permette di ingrandire l'immagine sullo schermo in modo da raggiungere con precisione la manopola con l'elettrodo di registrazione</td></tr><tr><td>della fotocamera</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td>è necessaria una buona fotocamera per vedere i neuroni sia in fluorescenza che in campo chiaro; il software di controllo è semplice e permette di scattare foto e fare immagini dal vivo della fotocamera per monitorare l'avvicinamento dell'elettrodo alla cella. Una fotocamera ultrasensibile non è necessaria</td></tr><tr><td>per filtrare</td><td>Olympus/Chroma</td><td></td><td>a seconda della proteina fluorescente utilizzata nei topi; esempio per GFP: eccitazione: BP460-490: emissione: amplificatore HQ530/50m</td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>EPC10 USB</td><td>monitora le correnti che fluiscono attraverso l'elettrodo di registrazione e controlla anche il soffio inviando un segnale TTL allo spritzer; la configurazione EPC10 è controllata dal</td></tr><tr><td>software</td> <td>del computerHEKA</td><td>Patchmaster</td><td>controlla l'amplificatore durante l'esperimento</td></tr><tr><td>micromanipolatore</td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>micromanipolatore di precisione, consente movimenti precisi fino a 1/10 di micrometro; questo modello è molto stabile; evitare manipolatori idraulici che potrebbero derivare</td></tr><tr><td>estrattore di elettrodi</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>con un filamento a canale largo FT345-B; &nbsp; per preparare pipette di registrazione di circa 2&micro; m di diametro con una punta lunga per raggiungere le celle; la resistenza dovrebbe essere compresa tra 15 e 20 Mohm con il vetro perforato della soluzione del morsetto patch</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td>nelle nostre condizioni di registrazione, questo vetro è ideale per la registrazione di pipette</td></tr><tr><td>camera di registrazione</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td>è necessaria una camera per impostare la preparazione al microscopio. Per mantenere la preparazione al centro della camera, è necessario utilizzare una rete/ancora.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>vetro <td>di stimolazione</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>attaccato in gruppi di 7, queste pipette vengono utilizzate per preparare pipette stimolanti preestrate</td></tr><tr><td>estrattore multibarrel</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td><td>per associazione di trazione e torsione, questo estrattore ci permette di preparare elettrodi di sbuffo con iniettore</td></tr> di pressione di precisione a 7 barili<tr><td>&nbsp;</td><td>Azienda Toohey</td><td>P/N T25-1-900 Canale singolo&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>questo iniettore di pressione di precisione controlla la pressione espulsa nell'estrattore multibarile; è controllato manualmente o dall'amplificatore tramite un 5V&nbsp; Il</td></tr><tr><td>micromanipolatore</td> TTL <td>Narishige</td><td>YOU-1</td>, <td>un manipolatore grossolano, è sufficiente per avvicinare l'elettrodo di soffiaggio ai tubi del sito di registrazione</td></tr><tr><td>,</td> tubo di tygon <td>N/A</td><td></td><td>per portare la pressione dal puffer alla pipetta di soffiaggio</td></tr><tr><td>, pompe per vuoto di soluzioni/perfusione/prodotti chimici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gardner Denver</td><td>serie</td> <td>300una pompa a membrana vibrante è più silenziosa ed efficiente di altri tipi di pompe Sistema di</td></tr><tr><td>perfusione</td><td>N/A</td><td>N/A Sistema</td> di <td>perfusione a gravità N/A con tubo in polietilene per far entrare e uscire la soluzione esterna dalla camera di registrazione</td></tr><tr><td>nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td><td>obbligatorio per la soluzione interna per il morsetto patch perforato</td></tr><tr><td>DIMETHYL SULFOXIDE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>utilizzato per sciogliere la nistatina per la soluzione interna per il cerotto perforato&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>soluzione intracellulare/extracellulare</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>soluzione extracellulare</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4 7H2O)</td>Soluzione <td>extracellulare</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td></tr><tr><td>Glucosio</td> Soluzione <td>extracellulare</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td> Soluzione <td>extracellulare</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sigma-Aldrich S6297EGTA (Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&primo;-acido tetraacetico)</td><td>Soluzione interna Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Idrossiide di potassio</td> Soluzione <td>interna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td></tr><tr><td>Metil solfossido</td> Soluzione intracellulare <td>Sigma-Aldrich</td><td>W387509</td><td>Soluzione</td></tr><tr><td>intracellulare</td> <td>Hepes-Na</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td></tr><tr>Soluzione <td>intracellulare</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td> in <td>saccarosio</td></tr></tbody></table>

perforato patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi in neuroepithelium intatto: analisi funzionale di neuroni esprimendo un identificato odorizzante receptor

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analizzando le risposte fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) quando stimolato con specifici ligandi è fondamentale per comprendere la base dei comportamenti olfattive-driven e la loro modulazione. Queste proprietà di codifica dipendono fortemente dalla interazione iniziale tra molecole di odore e il recettore olfattivo (OR) espresse nei OSNs. L&#39;identità, specificità e ligando spettro della espressa o sono critici. La probabilità di trovare il ligando della OR esprime in OSN scelto casualmente all&#39;interno dell&#39;epitelio è molto bassa. Per affrontare questa sfida, questo protocollo utilizza geneticamente i topi con tag che esprimono la proteina fluorescente GFP sotto il controllo del promotore di RUP definiti. OSNs sono situati in un epitelio stretto e organizzato che riveste la cavità nasale, con le cellule vicine che influenzano la loro maturazione e funzione. Qui si descrive un metodo per isolare un epitelio olfattivo intatto e registrare tramite patch-clamp le proprietà di OSNs expressing recettori olfattivi definiti. Il protocollo consente di caratterizzare le proprietà della membrana OSN mantenendo l&#39;influenza del tessuto adiacente. Analisi dei risultati di patch-clamp produce una precisa quantificazione del ligando / o interazioni, vie di trasduzione e farmacologia, codifica le proprietà OSN e la loro modulazione a livello della membrana.

Il risultato di questo protocollo dipende dalla qualità della dissezione. Questa procedura dissezione deve essere breve (meno di 10 a 15 minuti) e preciso (ad esempio, per evitare danni del epitelio). La figura 1 illustra come una preparazione ideale assomiglia a diversi livelli di ingrandimento. Ad un basso ingrandimento in campo luminoso i diversi tipi di cellule (ad esempio le manopole di OSNs, sostenendo le cellule) sono distinguibili (Figura 1A). Al livello più alto ingran...

L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare le variazioni nelle proprietà della membrana dei neuroni sensoriali olfattivi in risposta a stimolanti odorosi. Questo viene realizzato innanzitutto dissezionando l'epitelio olfattivo e trasferendolo in una camera perfusa. Il secondo passaggio consiste nel localizzare e selezionare un OSN di interesse al microscopio.Il bulbo dendritico del OSN scelto viene quindi sottoposto a patch clamping e analizzato mentre viene stimolato con odoranti. In definitiva, il patch clamping perforato dei bulbi dendritici dei OSN caratterizza le proprietà funzionali dei OSN a livello della membrana. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'olfatto, come la registrazione di neuroni sensoriali olfattivi che esprimono recettori per specifici odoranti, e anche le registrazioni mediante patch clamp.Fornire informazioni sulle proprietà della membrana di questi neuroni. Preparare le pipette di stimolazione partendo da vetro da un millimetro oppure acquistarle già tirate utilizzando una fiamma. Curvare sei pipette a circa un centimetro dalla punta formando un angolo di 45 gradi.Quindi disponi le sei pipette con punta piegata attorno a una settima pipetta dritta, utilizzando un occhiello come guida, e avvolgile con un tubo termoretraibile. Riscalda il rivestimento termoretraibile all'altro capo delle pipette. Applica ulteriore rivestimento termoretraibile.Questo permette di ottenere una pipetta stimolante a sette canali. Ora, utilizzando un tiratore polare multicanale, tirare la pipetta stimolante a sette canali. Una volta tirata, rinforzare l'assemblaggio con della colla bianca intorno all'occhiello.Quindi lasciare asciugare la colla durante la notte con le soluzioni richieste. La soluzione di Nistatina deve essere preparata fresca immediatamente prima dell'uso. Quando necessario, pesare tre milligrammi di Nistatina e aggiungerli a 50 microlitri di DMSO.Quindi vortexare la miscela per 20 secondi. Successivamente, sottoporre la miscela a sonificazione per due o tre minuti per garantire una diluizione completa. Aggiungere ora 20 microlitri della miscela a cinque millilitri di soluzione intracellulare stock.Vortexare la miscela per 20 secondi, seguiti da due o tre minuti di sonificazione. Successivamente, raffreddare la soluzione di lavoro su ghiaccio e mantenerla al riparo dalla luce durante la preparazione. In questo modo, la soluzione di lavoro rimane stabile per alcune ore.Caricare una siringa dotata di microfilm con la soluzione di lavoro. La soluzione sarà utilizzabile per un'ora a partire dal suo utilizzo. Tuttavia, conservare la siringa caricata mantenendola sul ghiaccio.Ora preparare alcune elettrodi di registrazione con colli lunghi e aperture di due micron. L'obiettivo è ottenere una resistenza compresa tra 15 e 20 megaohm una volta caricati con soluzione di nistatina. Infine, caricare la pipetta stimolante con l'odorante diluito nella soluzione di ringer.Per questo protocollo, avere a disposizione topi di età compresa tra due e quattro settimane. In questa presentazione, vengono utilizzati topi che esprimono o IRES tau GFP mediante l'uso di topi or IS tau GFP. Tutti i neuroni che esprimono l'or di interesse saranno marcati con GFP.Questo metodo può essere utilizzato per o espresso in tutte le zone. Tuttavia, le dissezioni e le registrazioni saranno più semplici per i recettori olfattivi espressi nella zona dorsale. Iniziare anestetizzando e quindi decapitando un topo.Il risultato di questo protocollo dipende dalla qualità della dissezione. Questi passaggi di dissezione devono essere il più brevi possibile e precisi. Per iniziare l'intervento chirurgico, utilizzare forbici da dissezione per effettuare un taglio longitudinale lungo il dorso.Tirare la pelle per rimuoverla. Quindi effettuare un taglio lungo la mascella inferiore e un taglio coronale parallelo ai denti. In questo modo, rimuovere i denti incisivi superiori.Ora effettuare un taglio coronale intorno alla testa, dietro gli occhi, scartare la parte posteriore della testa e trasferire la porzione anteriore in ringer freddo con ghiaccio. Ora, sotto un microscopio per dissezione, isolare il setto entro cinque-dieci minuti. Iniziare con un taglio longitudinale lungo il lato ventrale.Quindi tagliare longitudinalmente le ossa dorsali lungo il lato dorsolaterale della cavità nasale. Successivamente, rimuovere la maggior parte delle ossa e il palato. Trasferire il setto isolato con l'epitelio adiacente in un contenitore di soluzione fisiologica ossigenata a temperatura ambiente.Entro cinque minuti, effettuare i preparativi finali prima della registrazione. La soluzione non deve essere troppo calda, altrimenti il preparato apparirà danneggiato. Per accedere all'epitelio neuroectodermico ai fini della registrazione.Prima, staccare l'epitelio dal setto sottostante con una pinzetta. Quindi, utilizzando forbici micro Vanna, tagliare l'estremità anteriore del setto per liberare l'epitelio. Ora rimuovere con attenzione l'organo nasale del vomere.Tagliare nel punto in cui è attaccato dorsalmente. L'epitelio isolato può ora essere trasferito nella camera di registrazione con il lato del muco rivolto verso l'alto. Una volta posizionato, utilizzare un arco per appiattire il tessuto.Quindi trasferire la camera su un microscopio verticale. Visualizzare l'epitelio neuroepiteliale con un obiettivo ad immersione in acqua 40x, perfondendo continuamente con ringer fresco a temperatura ambiente. Per iniziare la ricerca delle cellule di interesse, che in questo caso esprimono EGFP, si utilizza luce a 480 nanometri per individuare cellule che emettono luce nell'intervallo da 530 a 550 nanometri.I noduli dendritici mirati e l'osn, quando osservati a un ingrandimento compreso tra 80 e 160 volte in campo chiaro, devono essere chiaramente distinguibili dalle cellule di sostegno. Caricare ora l'elettrodo con una soluzione di S-statina. Rimuovere eventuali bolle d'aria formatesi e fissare l'elettrodo al supporto.Ora applicare una certa pressione positiva. La resistenza prevista è compresa tra 15 e 20 megaohm. Successivamente portare l'elettrodo sulla cellula mantenendo la pressione positiva.Quando la resistenza aumenta a circa 40 megaohm, rilasciare la pressione ed applicare una leggera pressione negativa. Se viene formato un gigaohm, il potenziale della membrana dovrebbe essere bloccato a circa -75 millivolt. Ora che la cellula è aperta, procedere con l'esperimento.Applicare stimolazioni e protocolli, e perfondere con trattamenti farmacologici secondo necessità per eseguire il test con un singolo odorante. Registrare da 200 a 500 millisecondi di attività spontanea. Applicare l'odorante per 500 millisecondi, quindi misurare le risposte fino a 10 secondi utilizzando il protocollo descritto.I neuroni che esprimono MOR 23, etichettati con EGFP, sono stati perforati e stimolati con diverse concentrazioni di al. In modalità clamp di corrente, lyal è un ligando per MOR 23. In alternativa, le cellule sono state simulate in modalità clamp di tensione.Nelle registrazioni in modalità voltage clamp, sono state monitorate diverse caratteristiche. Per quantificare la risposta, come tradizionalmente effettuato in elettrofisiologia utilizzando l'ampiezza massima della risposta, la curva concentrazione-risposta è stata riportata utilizzando l'equazione di Hill. Questi risultati forniscono informazioni sulle proprietà di codifica di ciascun OSN, che comprendono la soglia di rilevamento, la risposta temporale, la gamma dinamica e il livello di saturazione.Una volta acquisita padronanza, la parte di dissezione di questa tecnica può essere eseguita in 10-15 minuti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come esplorare le proprietà funzionali dei neuroni sensoriali olfattivi che esprimono recettori per odori definiti nei topi.

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L'(EOG) è una registrazione electroolfactogram informativo, facile da condurre, e affidabile di valutazione della funzione olfattiva a livello dell'epitelio olfattivo. Questo protocollo descrive una configurazione di registrazione, di preparazione dei tessuti del mouse, raccolta dati e analisi dei dati di base.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Neuroni recettori olfattivi (ORNs) convertire i segnali olfattivi prima in un recettore corrente che a sua volta attiva i potenziali d'azione che vengono trasmessi ai neuroni di secondo ordine nel bulbo olfattivo. Qui si descrive la tecnica pipetta di aspirazione di registrare simultaneamente l'odorizzante indotta recettore correnti e potenziali d'azione da ORNs mouse.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Il video del protocollo descrive la creazione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali dell'organo vomeronasale (VNO) nei topi. Una fetta di VNO coronale con neuroni sensoriali marcati in fluorescenza viene collocata in una configurazione di registrazione. Un neurone marcato viene patchato con una pipetta di registrazione in una configurazione di cellula intera per la registrazione elettrofisiologica in risposta a stimoli chimici.

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali vomeronasali

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Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor (Video) | JoVE Journal

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

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