Name: Lapplicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Scopri l'iniezione stereotassica di lentivirus per studiare l'ansia e la depressione nel cervello dei roditori. Questo metodo consente di modulare l'espressione genica in aree specifiche e valutare i cambiamenti comportamentali.

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Questo lavoro è supportato in parte dall'American Heart Association Scientist Development Grant e dal NARSAD Young Investigator Award a Yingwei Mao.

NOTA: Tutti i protocolli su animali sono stati rilevati in conformità con le linee guida per la cura degli animali di The Pennsylvania State University, IACUC # 44057 1. Lentivirus Produzione NOTA: Il giorno prima transfezione, LentiX-293 cellule dovrebbe essere al 80% di confluenza. <ol><li> Lavare le cellule con DMEM appena prima trasfezione e incubare in 10 ml di DMEM / 10% FBS con penicillina (100 UI / ml) e streptomicina (100 ug / ml) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire DNA e polietilenimmina (PEI) (1 mg / ml) in rapporto 1: 3 (1 mg di DNA: 3 ml di PEI) in 1 ml di DMEM e vortex per 1 min. Il volume di DNA aggiunto dipende dalla concentrazione del DNA. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. <ol><li> Ad esempio, utilizzare 20 mg di plasmide DNA, composto da 10 mg di plasmide vettore, 5 mg di psPax2 14 plasmide, 5 mg di virus della stomatite vescicolare (VSV) con 60 ml di PEI per piatto. </li></ol></li><li&gt; MiX DNA e soluzione PEI nuovamente vortex per 1 min. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Aggiungere 1 / 10th volume di mezzo di coltura DMEM totale (cioè 1 ml per 10 ml terreno di coltura in un piatto 100 mm). Aggiungere 1 ml di DNA-PEI miscela goccia a goccia nel piatto e agitare il piatto intorno fino al mezzo di coltura è ben miscelato con il DNA. </li><li> Incubare per 6 ore a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura. </li><li> 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante virale e centrifugare a 627 xg per 5 minuti a 4 ° C in un tubo da 50 ml. Filtrare 30 ml di surnatante virale attraverso un filtro siringa da 0,45 micron in una provetta ultracentrifuga. </li><li> Aggiungere acqua sterile per bilanciare i tubi, e coprire tubi con piccolo pezzo di parafilm. Tubi Spin a 11.249 g per 120 min a 4 ° C. Rimuovere il liquido con una punta del vuoto. </li><li> Aggiungere 100 ml di PBS freddo del tubo. Agitare delicatamente il tubo a 4 ° CO / N. </li><li> Per ri-sospensione del virus, pipetta tha PBS aggiunto nel passaggio 1.8 negli pellet per 10 volte, facendo attenzione a non toccare il pellet con la punta. Il pellet non sarà nuovamente sospeso fino a quando questo è completo. </li><li> Aliquota il virus a 10-20 ml per provetta, flash-congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol> 2. iniezione stereotassica 2.1) Preparazione degli strumenti <ol><li> Mettere un paio di forbici, pinze smussato-end, un porta-aghi, bisturi, tamponi di cotone, e un panno in una confezione sigillata con un indicatore della sterilizzazione, e in autoclave prima dell&#39;intervento. Inoltre, è necessario ottenere il 10% povidone iodio, il 70% di alcol etilico, suture assorbibili, una piastra elettrica, lacrime artificiali, un bicchiere tallone sterilizzatore, trapano, una punta, due siringhe monouso, una siringa per iniezione, rasoio elettrico, analgesico (ketoprofene), anestetico (avertin), guanti, e un apparato stereotassico con pompa di iniezione. </li><li> Rendere 1,25% soluzione avertin fresco quel giorno, il filtro in una cappa sterile utilizzando un 0,2 &amp;# 181; m filtro siringa sterile, e posizionare in una fiala di siero sterile. Miscelare 2,5 g di alcol 2,2,2-tribromoethyl in 5 ml di alcool terz-amile, poi sciogliere in 200 ml di acqua. Mantenere il pH inferiore a 5. 15 </li></ol> 2.2) Preparazione del mouse <ol><li> Amministrare avertin in base al peso del mouse (375 mg / kg). 15 Iniettare il mouse con la avertin tramite una iniezione intraperitoneale (IP), e quindi posizionare di nuovo nella sua gabbia fino a completo anestetizzato. </li><li> Dare un analgesico via iniezione IP (ketaprofen, 5 mg / kg), e luogo lacrime artificiali sugli occhi del mouse per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Assicurarsi che il mouse è completamente addormentato da pizzicare il piede. Se il mouse risponde al pinch piede, poi dare più anestetico (in dosi di 50 microlitri). Radere il capo del mouse utilizzando un rasoio elettrico. Radere l&#39;area da operare (tipicamente da appena dietro le orecchie, all&#39;inizio del muso), e l&#39;area circostante. </li><li> Posizionare la i del mousento l&#39;apparato stereotassico. Latch i denti anteriori sul morsetto anteriore e abbassare la fascetta e stringerlo in modo che la ganascia è completamente sicuro. </li><li> Inserire le barre auricolari nel condotto uditivo per stabilizzare completamente la testa. Fare attenzione a non inserire le barre orecchio troppo lontano, che potrebbe danneggiare l&#39;orecchio interno. Una volta terminato, il corpo del mouse dovrebbe essere in grado di essere spostati leggermente senza interrompere la posizione della testa. </li><li> Posizionare una piastra elettrica sotto il mouse in modo da regolare la temperatura corporea del topo durante tutta la procedura. </li><li> Pulire accuratamente l&#39;area chirurgica. Usando un tampone di cotone, strofinare 10% povidone iodio in un movimento circolare, partendo dal centro del sito chirurgico e procedendo verso l&#39;esterno. Quindi, utilizzare un tampone di cotone per lucidare il 70% di alcol etilico sul sito chirurgico nello stesso modo. Ripetere l&#39;operazione per due volte. </li></ol> 2.3) La prima incisione <ol><li> Una volta che il mouse è preparata, aprire il sacchetto materiale sterile. Cambiare i guanti prima Touching strumenti. Estrarre il panno sterile e posizionare gli strumenti sul panno. Se qualsiasi strumento tocca una superficie non-sterili, utilizzare il tallone sterilizzatrice vetro per 15 secondi per sterilizzarlo. </li><li> Prendere il bisturi in mano e smussato-end la pinza dominanti della mano non dominante. Utilizzare le pinze smussato-end per afferrare delicatamente la pelle del mouse, e fare un&#39;incisione con il bisturi. Iniziare l&#39;incisione circa 1,5 cm sopra le orecchie (verso il naso) e si estendono per circa 0,5 cm al di sotto le orecchie. Estendere l&#39;incisione verticalmente al centro della testa del mouse per esporre bregma (Figura 1). </li><li> Una volta bregma viene visualizzato, prendere una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente il sangue che copre la superficie del cranio. Utilizzare due punte di cotone per spingere la pelle verso il lato della testa. </li></ol> 2.4) Equipment Setup <ol><li> Dopo il sangue viene rimosso dalla superficie del cranio, e bregma è chiaramente visualizzato, preparare la siringa (concentrazione di 10 8 TU / ml, il volume di 1 ml). Nella cappa, riempire la siringa con il virus da iniettare. Assicurarsi che non bolle sono dentro. Posizionare la siringa nell&#39;apparato stereotassica, facendo in modo che sia completamente protetto. </li><li> Lentamente abbassare la siringa finché è proprio sopra la superficie del cranio, in modo che la punta dell&#39;ago della siringa sterile viene impostato l&#39;intersezione del bregma e la linea interaurale. Impostare questo punto zero, e determinare le coordinate di questo punto. </li><li> A seconda della zona del cervello di interesse, variare le coordinate stereotassica. Determinare le coordinate utilizzando un atlante del cervello 4. Una volta che le coordinate sono determinati, spostare l&#39;ago della siringa in modo che corrisponda quelle coordinate. Obiettivo giro dentato utilizzando le coordinate: M / L = +/- 1 mm, A / P = -1.82 mm. Abbassare l&#39;ago proprio sopra il cranio di visualizzare dove il foro deve essere forato. </li><li> Sollevare la siringa un po &#39;, prendere il trapano e posizionare il bi trapanot proprio sopra il sito di perforazione di destinazione a circa un angolo di 45 ° al cranio. Inizia la perforazione, e continueranno a perforare sino cranio cede. Quando il cranio cede, un calo di resistenza può essere rilevato. Fare attenzione a non forare nel cervello, in modo da evitare danni corticale. </li><li> Prendere una punta di cotone sterile e rimuovere il sangue dal foro. </li><li> Abbassare la siringa in modo che la punta si trova proprio sulla superficie del cervello (non il cranio). Impostare il D / V coordinate (profondità) 0. Lower siringa alla profondità desiderata, in base alle coordinate dell&#39;atlante cerebrali. Per raggiungere il giro dentato, impostare D / V per -1,79 mm. </li><li> Avviare l&#39;iniezione ad una velocità di 0,2 ml / min. Orologio per assicurarsi che la siringa non scivoli inferiore alla profondità desiderata. Se ciò si verifica, aumentare leggermente la siringa alla profondità desiderata di nuovo. </li><li> Dopo l&#39;iniezione è terminata, attendere circa 2 minuti per assicurare che tutti i virus residuo è stato assorbito. Lentamente alzare la siringa e utilizzare una punta di cotone per rimuovere qualsiasi liquid dal sito di iniezione. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per l&#39;altro emisfero. </li></ol> 2.5) sutura <ol><li> Rimuovere la sutura sterile e ago dalla confezione e presa l&#39;ago utilizzando i porta-aghi. Affrontare il bordo appuntita dell&#39;ago dalla porta-aghi. Tenere la pinza smussato-end della mano non dominante, e utilizzarlo per afferrare la pelle sul mouse. Inizia con la mano dominante. </li><li> Spingere delicatamente la sutura attraverso la pelle e utilizzare il forcipe smussato-end per afferrare la pelle sull&#39;altro lato dell&#39;incisione. Tirare il materiale di sutura attraverso fino a circa 0,75 pollici rimane. </li><li> Rilasciare dell&#39;ago, e utilizzare il forcipe smussato-end per avvolgere la sutura intorno al supporto dell&#39;ago una volta, quindi, afferrare la sutura rimanente 0,75 pollici con porta-aghi, e tirare la sutura attraverso, in modo che il supporto dell&#39;ago e l&#39;ago finire sul lato della testa opposta a quella che erano in origine. Ciò dovrebbe costituire un nodo. </li><li> Ripetere questa operazionealtre tre volte, alternando il lato della testa porta-aghi finisce su ogni volta. </li><li> Tagliare la sutura e ripetere i passaggi fino a quando 2.5.1-2.5.3 l&#39;incisione viene chiusa. </li></ol> 2.6) cure post-operatorie <ol><li> Rimuovere delicatamente le barre di orecchio del mouse e rimuovere la sua mascella dal morsetto anteriore. </li><li> Tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a quando non si sveglia e si muove da sola. Monitorare il mouse quotidiano, e tenere d&#39;occhio per i segni di dolore, come quella di non governare, mangiare o bere. Dare analgesico aggiuntivo quando ritenuto necessario. </li></ol> 3. Aprire Field Test 3.1) Impostazione <ol><li> Ottenere un quadrato vuoto, arena di plastica con dimensioni 50 cm x 50 cm, 50 cm di altezza muri (ma può essere leggermente più grande). Pulire campo con 70% di alcool etilico prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento. Assicurarsi che l&#39;alcol etilico è asciugato completamente prima di mettere un mouse nell&#39;arena. </li><li> Posizionare l&#39;arena sullapiano, e cercare di garantire l&#39;illuminazione è impostato per ridurre al minimo le ombre e riflessi. </li><li> Se si utilizza software di monitoraggio, posizionare la fotocamera direttamente sovraccarico di campo aperto, a circa 1,5 ft sopra il campo aperto (abbastanza lontano per intero encompass tutta l&#39;arena, ma abbastanza vicino per avere una visione chiara del mouse). </li><li> Impostare una zona nel centro area (circa una superficie di 30 cm x 30 cm). 16 Per impostare una zona, fare clic sulla scheda zona 1 nel pannello laterale. <ol><li> Selezionare un contorno forma nel pannello superiore, e delineare il perimetro della zona centrale. Selezionare aggiungere la zona, e fare clic all&#39;interno della zona centrale. Utilizzando le istruzioni del programma, il nome della zona (questo sarà indicato come &#39;centro&#39; per questa procedura). Se la prova comportamentale viene ottenuto manualmente, assicurarsi che il fondo del campo è divisa in 10 cm x 10 cm quadrati, contrassegnato con del nastro. </li></ol></li><li> Impostare il software in modo che le impostazioni siano corrette, e il mouse è facilmente visiBLE sullo schermo. Realizzare questo regolando le impostazioni di rilevamento sulla macchina per essere compatibile con l&#39;arena di test (illuminazione) e il colore del mouse. NOTA: Quando le impostazioni sono corrette, il sistema dovrebbe monitorare solo il mouse, e non tutte le ombre o urina / materia fecale. Le impostazioni del software specifici dipendono l&#39;illuminazione della scena, e il colore del mouse. </li></ol> 3.2) acclimatazione e di prova <ol><li> Spostare topi sperimentali nella comportamentale stanza 1 ora prima del test al fine di acclimatarsi al loro ambiente. Lasciare i topi nella loro gabbia per l&#39;acclimatazione. </li><li> Accendere la fotocamera su nastro il compito comportamentale e posizionare il mouse verso la parte anteriore centro dell&#39;arena in modo che il mouse si trova di fronte al muro. </li><li> Impostare il timer per 5 minuti, e allontanarsi dalla scena. Se possibile, lasciare la camera in modo da non influenzare accidentalmente il mouse. </li><li> Una volta 5 min sono, rimuovere il mouse e metterli nella loro gabbia. </li><li> Utilizzare 70% di alcol etilico per pulire a fondo il campo prima di procedere alla prossima mouse. Assicurarsi che l&#39;alcol etilico è asciugato completamente. </li></ol> 3.3) Punteggio <ol><li> Si consideri il mouse come essendo nel centro del campo quando tutti e quattro zampe sono all&#39;interno del centro 30 cm x 30 centimetri. </li><li> Quantificare la quantità di tempo il mouse passa nel centro. In alternativa, determinare questa volta usando il software di monitoraggio (come Noldus ethovison). <ol><li> Per fare questo, vai alla scheda di analisi, e cliccare su &quot;movimento&quot; sotto profili di analisi. Eliminare le categorie attualmente impostati, e poi selezionare &quot;in zona&quot; sotto la scheda posizione. Selezionare la zona centrale. Quindi, selezionare &quot;output analysis&quot; (nella scheda dei risultati) per visualizzare i risultati. Una tabella che elenca il tempo speso per immobile deve apparire ogni prova. </li></ol></li><li> In caso contrario, segnerà l&#39;OFT a mano. Il campo aperto dovrebbe avere 25 10 cm x 10 cm di lato delineati sul fondo della opecampo n (come indicato al punto 3.1.3). Quantificare la quantità di tempo il mouse passa nel centro, oltre al numero di ingressi nel centro dell&#39;arena. 16 NOTA: Il centro 30 cm x 30 cm zona è considerata il centro del campo aperto. Un mouse è considerato che abitano la regione centrale se le quattro zampe si trova all&#39;interno dell&#39;area 30 x 30 centimetri. </li></ol> 4. Costretto Swim test NOTA: Lasciare un minimo di cinque giorni tra le attività comportamentali. 4.1) Impostazione <ol><li> Ottenere un 2 L secchio chiaro, e riempire con 22 ° C acqua. Posizionare il secchio su un tavolo, e cercare di garantire l&#39;illuminazione è impostato per ridurre al minimo le ombre e riflessi. </li><li> Se si utilizza software di monitoraggio, posizionare la fotocamera direttamente dall&#39;alto della benna. </li><li> Impostare il software in modo che il mouse è facilmente visibile sullo schermo. </li></ol> 4.2) acclimatazione e di prova <ol><li> Spostare topi sperimentale nel ro comportamentaleom 1 ora prima del test si adatti i dintorni. Lasciare i topi nella loro gabbia per l&#39;acclimatazione. </li><li> Accendere la fotocamera su nastro il compito comportamentale. Delicatamente, posizionare il mouse al centro del secchio d&#39;acqua. Assicurarsi di non far cadere il mouse. Abbassare lentamente il mouse, così le sue zampe anteriori toccano l&#39;acqua prima. Fare attenzione ad evitare che la loro testa da sommergere. </li><li> Impostare il timer per 6 min, e allontanarsi dalla zona comportamentale. </li><li> Una volta 6 min sono, rimuovere il topo dal secchio, e pulire l&#39;acqua in eccesso prima di mettere di nuovo il mouse nella loro gabbia. </li></ol> 4.3) Punteggio <ol><li> Se si utilizza il software di monitoraggio, impostato per cento l&#39;immobilità al 11%, come suggerito da Noldus (questo dovrebbe essere l&#39;impostazione di default), per quantificare il tempo che galleggia contro nuoto. </li><li> Per quantificare l&#39;utilizzo del sistema di tracking, vai alla scheda di analisi, e fare clic sul movimento sotto profili di analisi. Eliminare le categorie attualmente impostate, e quindi selezionare lo stato di mobilità, suil pannello laterale sinistro (sotto comportamento individuale). Impostare l&#39;immobilità al 11%. </li><li> Selezionare la visualizzazione pista, sotto la scheda dei risultati. Selezionare uscita analisi (nella scheda dei risultati) per visualizzare i risultati. Una tabella che elenca il tempo speso per immobile deve apparire ogni prova. </li><li> Se punteggio mano, misurare il tempo con il mouse passa il nuoto o l&#39;arrampicata, e la quantità di tempo il mouse passa immobile. Inoltre, misurare la latenza del primo tempo immobile. Vedere la Figura 2 in Risultati sezione. </li></ol>

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<li>Rubinson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nature Genetics. 33, 401-406 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Iniezioni stereotassica di successo si basano su tre fattori: tenere il mouse viva, impostando il corretto punto zero per le coordinate (punta dell&#39;ago sull&#39;intersezione di bregma e la linea interaurale), e impostando la giusta profondità al punto zero (punta dell&#39;ago sfiora l&#39;esterno del tessuto cerebrale). La vitalità dei topi è importante. Sopravvivenza chirurgia può essere aiutata da fare in modo che il mouse sia correttamente anestetizzato e riceve adeguata analgesico. Il dolore è noto per essere un...

Il mouse è stato ampiamente utilizzato in neurobiologia perché è facile da manipolare geneticamente. Tecniche di Gene knockout permettono ai ricercatori di indagare come ogni fattore genetico dà forma comportamenti del mouse. Inoltre, il sistema cre-loxP fornisce uno strumento prezioso per tessutale e Cell tipo- knockout gene specifico nei topi, che consente ai ricercatori di studiare la funzione dei geni in diversi tessuti. 1 Tuttavia, in pratica, i modelli di espressione dei promotori CRE sono difficili da controllare , e finora molti driver cre stabiliti non hanno raggiunto l&#39;espressione specifica regione. 2,3 In alternativa, l&#39;iniezione stereotassica è un metodo che gli obiettivi di specifiche regioni cerebrali di topo adulto. Iniettando virus geneticamente modificati che esprimono cDNA o shRNA, regione specifica modulazione dell&#39;espressione genica può essere raggiunto. Anche se le dimensioni del cervello di ogni mouse varia, la posizione di specifiche regioni cerebrali può essere determinato mediante coordi stereotassicanates impostato da punti di riferimento sul cranio del cervello di topo. I punti di riferimento più comunemente usati sono bregma, lambda, e la linea interaurale. Usando coordinate ottenute da un atlante del cervello, 4 la posizione esatta di ogni area del cervello può essere identificato dal antero-posteriore (A / P), medio-laterale (M / L), e dorso-ventrale (D / V) assi da bregma / interaurale intersezione linea. In genere i virus iniettato nel cervello dei topi sono etichettati con entrambi proteina fluorescente rosso o verde (RFP o GFP), in modo che le iniezioni possono essere confermate mediante microscopia a fluorescenza. Sono particolarmente necessari per la ricerca di base di disturbi psichiatrici valutazioni comportamentali di topi. I sintomi di disturbi psichiatrici nei pazienti tipicamente coinvolgono comportamenti anomali. Alcuni di questi comportamenti umani sono evolutivamente conservati e possono essere imitate direttamente e osservato nel topo. Ad esempio, la depressione può essere modellato in topo misurando disperazione comportamentale. Le persone affette da depressione oftit si sentono come se nulla fanno potrà mai aiutare, un sintomo che può portare al suicidio. Nei roditori, questo può essere modellata utilizzando il nuoto forzato test (FST), che misura la quantità di tempo un mouse nuotare contro galleggiante in una vasca d&#39;acqua (vista come rinunciare). Questo paradigma è convalidato dal salvataggio fenotipo con antidepressivi. 7,8,9 topi che hanno ricevuto antidepressivi spenderà molto meno tempo immobile rispetto ai controlli non trattati. Un altro test comportamentale, il Field Test Open (OFT) è progettato per valutare locomozione nei topi, e inoltre può essere utilizzato per analizzare il fenotipo ansia nei topi. 5,6 Questo test è basato sulla premessa che i topi sentono più sicuri quando sono vicini alla parete in un campo aperto romanzo. Topi wild-type alla fine di esplorare l&#39;ambiente romanzo, in quanto sono animali curiosi. Tuttavia, spendere meno tempo nel centro del campo indica ansia nel topo, come il mouse non sarà in grado di superare la initial paura causata da un ambiente nuovo. L&#39;ansia del mouse, come quantificato dalla quantità di tempo trascorso nel centro di un campo aperto, può essere paragonato ad ansia clinica nell&#39;uomo, che è presente in molti disturbi psichiatrici. La combinazione di iniezioni stereotassica con paradigmi comportamentali è un nuovo modo per alterare l&#39;espressione di un gene specifico in una zona del cervello mirato. L&#39;effetto dell&#39;espressione genica modulata sui comportamenti del mouse può essere determinata. In contrasto intero knockout cervello, questo metodo è particolarmente utile in quanto si rivolge solo specifiche aree cerebrali. Inoltre, le iniezioni stereotassica sono tipicamente eseguiti nell&#39;adulto tipo topo selvatico, di conseguenza, l&#39;espressione del gene endogeno è stata mantenuta per tutta stadi di sviluppo. Questo metodo di evitare l&#39;effetto confound se è richiesto il gene per la sopravvivenza nella fase embrionale o postnatale dello sviluppo. Una limitazione importante è che i topi sperimentali hanno bisogno di andare through un intervento chirurgico invasivo, in cui i crani di topi hanno da aprire. Inoltre, il grado di modulazione gene è determinata dal titolo e l&#39;efficienza del virus. Il virus deve essere iniettato nella regione corretta usando coordinate stereotassica, che richiede strumenti speciali. La verifica del sito di iniezione corretta può essere completato solo post mortem. Questo metodo è stato precedentemente utilizzato per testare il coinvolgimento di un gene specifico in varie malattie neurologiche. Ad esempio, virale mediata RNAi mira il gene Th (che permette di sintetizzare la dopamina) è stato iniettato nel compacta sostanza nera, e l&#39;analisi del comportamento motorio è stata condotta. 10 Un altro studio ha utilizzato l&#39;iniezione stereotassica di un silenziamento DISC1 lentivirus per valutare il comportamento del mouse in relazione alla schizofrenia. Knockdown di DISC1 ha portato ad un aumento della locomozione in risposta alle novità (paralleli sintomi positivi nella schizofrenia), e una maggiore immobilità nellaFST. 11 Allo stesso modo, un ulteriore studio ha scoperto che 5-HT 1B sovraespressione ha portato ad un aumento comportamento esplorativo nella OFT, coerente con un fenotipo anti-ansia utilizzando questo metodo. 12 iniezioni stereotassica in grado di fornire il virus cre indurre ricombinazione in cre-loxP topi . Questo metodo è stato utilizzato per eliminare selettivamente il recettore Y2 nell&#39;amigdala e il nucleo della stria terminale. Dopo l&#39;analisi comportamentale, questi topi sono stati trovati a un fenotipo antidepressivo quando il gene è stato eliminato nell&#39;amigdala centrale, ma non fenotipo quando il gene è stato eliminato nell&#39;amigdala basolaterale o il letto nucleo della stria terminale. 13 Così, questa tecnica fornisce uno strumento unico per studiare l&#39;effetto genetico sui comportamenti animali.

<table><tbody><tr><td>Apparecchio stereotassico articolo 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Pompa stereotassica per eccellenza&nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&nbsp;</td><td>Poliscienze Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumenti chirurgici fini</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinze con estremità smussate</td><td>Strumenti chirurgici fini</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi&nbsp;</td><td>Strumenti chirurgici fini</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Scatola di controllo Microtorque, manipolo Tech2000</td><td>con pedale</td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perle di vetro Inotech</td><td>&nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Suture riassorbibili&nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Assorbente, taglio inverso</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Lacrime artificiali</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Siringa monouso</td><td>309623</td><td></td><td>Siringa BD</td></tr> Guanti di <tr><td>stoffa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin o altro anestetico</td><td>vedi ricetta citazione</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofene o altro analgesico</td><td>vedi veterinario</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di tracciamento</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera di tracciamento</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Iniezione stereotassica è una tecnica utile per fornire lentivirus ad alto titolo di aree cerebrali mirati nei topi. Lentivirus possono sia iperespressione o espressione genica atterramento in una regione relativamente concentrato, senza danni significativi al tessuto cerebrale. Dopo il recupero, il mouse iniettato può essere testato su vari compiti comportamentali come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST). L&#39;OFT è progettato per valutare locomozione e il fenotipo ansia nei topi misurando la quantità di tempo che trascorre un topo nel centro di un campo aperto romanzo. Un topo più ansioso spenderà molto meno tempo nel centro del campo romanzo rispetto ai controlli. La FST valuta il fenotipo antidepressivo quantificando la quantità di tempo che i topi trascorrono immobile, quando sono immessi in un secchio d&#39;acqua. Un mouse con un fenotipo antidepressivo spenderà molto meno tempo rispetto immobile agli animali di controllo. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la STERiniezione eotactic di un lentivirus, in combinato disposto con test comportamentali per valutare come i fattori genetici modulare comportamenti animali.

<html> Iniezione stereotassica accurata si basa molto su come impostare le coordinate corrette. La punta dell&#39;ago utilizzato per iniettare il virus dovrebbe essere impostato direttamente sull&#39;intersezione di bregma e la linea intraurale (Figura 1). È utile utilizzare uno stereomicroscopio di accertare se l&#39;ago è posizionato correttamente. Quando guardando attraverso il microscopio, l&#39;ago deve essere posizionato in modo che se il virus è stato iniettato, sarebbe atterrare direttamente sull...

Iniezione stereotassica di lentivirus esprimere cDNA o shRNAs possono modulare l&#39;espressione genica in specifiche aree cerebrali di topi. Qui, vi presentiamo un protocollo per combinare iniezioni stereotassiche con compiti comportamentali, come il Field Test Open (OFT) e la nuotata di prova forzato (FST).

L&#39;applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare in che modo la modulazione dell'espressione di un gene in un'area bersaglio influisce sul comportamento dell'animale. Questo viene ottenuto innanzitutto creando un lentivirus per modulare l'espressione del gene bersaglio. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare un'iniezione stereotassica per iniettare il lentivirus in un'area cerebrale specifica di un roditore ER.Comportamenti successivi come ansia e depressione possono essere misurati quantitativamente utilizzando paradigmi comportamentali consolidati. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire un'analisi istologica per confermare il sito corretto di iniezione. In definitiva, l'iniezione stereotassica abbinata alla valutazione comportamentale può mostrare come un gene specifico in un'area bersaglio possa influenzare i comportamenti del topo.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che gli scienziati possono modificare l'espressione di un singolo gene in una piccola area mirata e successivamente valutare i cambiamenti comportamentali nei topi. Per iniziare questa procedura, posizionare un topo anestetizzato nell'apparato stereotassico, aggancia

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JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Fonte: Porlan, E., et al. Modificazione genetica stabile ed efficiente delle cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la modificazione genetica stabile delle cellule staminali neurali (NSC) nella zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) attraverso l'iniezione stereotassica di un gene terapeutico portatore di virus in un modello murino. Il virus entra nelle NSC, subisce la...

Iniezione stereotassica di virus per la modificazione genetica stabile in un modello murino

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i...

Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

Questo articolo viene descritto come microinject vettori virali nel cervello di topo e poi prova in un luogo climatizzato preferenza paradigma che comprende una fase di acquisizione, l'estinzione e la reintegrazione.

Microiniezione stereotassica di vettori virali che esprimono Cre ricombinasi per studiare il ruolo di geni bersaglio in cocaina condizionata place preference

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Questo articolo viene descritto come iniettare vettori virali nel mouse corteccia frontale per testare test comportamentali che richiedono la formazione eteromerico GPCR.

HSV-mediata Transgene Espressione di chimerici costrutti di studio comportamentale funzione di GPCR Heteromers nei topi

Descriviamo un protocollo di chirurgia stereotassica con un dispositivo fisso testa fatti in casa per microinjecting reagenti nello striato del cervello neonatale del mouse. Questa tecnica permette la manipolazione genetica in cellule neuronali di specifiche regioni del cervello di topo neonatale.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Il ruolo dei geni associati alle malattie recentemente scoperti nella patogenesi dei disturbi neuropsichiatrici rimane oscuro. Un bilaterale modificato nella tecnica di elettroporazione utero consente il trasferimento genico in grandi popolazioni di neuroni e l'esame degli effetti causali dei cambiamenti di espressione genica sul comportamento sociale.

Una pipeline che utilizza l'elettroporazione bilaterale in utero per interrogare le influenze genetiche sul comportamento dei roditori

Il presente protocollo descrive una strategia pratica per accelerare la fase di verifica delle coordinate di iniezione stereotassiche prima di eseguire il tracciamento virale utilizzando coloranti e sezioni congelate.

Validazione preliminare delle coordinate di iniezione stereotassiche tramite criosezione

I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare...

Iniezione stereotassica di microRNA-esprimono lentivirus al mouse Hippocampus CA1 regione e valutazione dei risultati Behavioral

Scopri l'iniezione stereotassica di lentivirus per studiare l'ansia e la depressione nel cervello dei roditori. Questo metodo consente di modulare l'espressione genica in aree specifiche e valutare i cambiamenti comportamentali.

L'applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

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