L'applicazione tecnica di iniezione stereotassica per studiare gli effetti genetici sui comportamenti animali

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare come la modulazione dell'espressione di un gene in un'area bersaglio influenzi il comportamento animale. Ciò si ottiene creando prima un lentivirus per modulare l'espressione del gene bersaglio. Il secondo passo consiste nell'utilizzare l'iniezione stereotassica per iniettare il lentivirus in una specifica area cerebrale del roditore ER.

I comportamenti successivi, come l'ansia e la depressione, possono essere misurati quantitativamente utilizzando paradigmi comportamentali stabiliti. Il passo finale consiste nell'eseguire l'istologia per confermare il sito di iniezione corretto. In definitiva, l'iniezione stereotassica abbinata alla valutazione comportamentale può mostrare come un gene specifico in un'area bersaglio possa influenzare i comportamenti dei topi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che gli scienziati possono modificare l'espressione di un singolo gene in una piccola area mirata e quindi valutare i cambiamenti comportamentali nei topi. Per iniziare questa procedura, posizionare un topo anestetizzato nell'apparato stereotassico, agganciare i denti anteriori al morsetto anteriore e fissare la mascella. Quindi inserire le barre auricolari nei canali uditivi per stabilizzare completamente la testa.

Quindi, posiziona un termoforo sotto il mouse per regolarne la temperatura corporea. Durante la procedura, posizionare lacrime artificiali sugli occhi del roditore per evitare che si secchi. Successivamente, pulire accuratamente l'area chirurgica strofinando prima il 10% di iodio povidone con un batuffolo di cotone con movimenti circolari.

Successivamente strofinare allo stesso modo alcol etilico al 70% sul sito chirurgico. Ripetere questa procedura di pulizia altre due volte. Una volta che il mouse è pronto, aprire la borsa dell'attrezzatura sterile.

Cambiare i guanti prima di toccare gli strumenti. Quindi estrarre il panno sterile e posizionare gli strumenti sul panno. Ora afferra delicatamente la pelle del topo con la pinza per l'estremità del sangue e praticala con un bisturi.

Inizia l'incisione a circa 1,5 centimetri sopra le orecchie ed estendila a circa 0,5 centimetri sotto le orecchie per esporre il bgma. Una volta visualizzato il bgma, utilizzare una punta di cotone sterile per rimuovere delicatamente il sangue che copre la superficie del cranio. Quindi utilizzare due punte di cotone per spingere la pelle verso i lati della testa.

Successivamente, nella cappa aspirante, riempire una siringa con il virus da iniettare. Assicurarsi che non vi siano bolle intrappolate all'interno. Quindi posizionare una siringa nell'apparato stereotassico, assicurandosi che sia completamente fissata.

Dopodiché, abbassa lentamente la siringa fino a quando non si trova proprio sopra la superficie del cranio. Quindi spostare la punta dell'ago della siringa sterile all'intersezione tra B bgma e la linea interrurale. Impostate questo punto su zero.

Successivamente impostare le coordinate dell'area di interesse. Spostare l'ago della siringa nel sito di destinazione da perforare. Quindi posiziona la punta del trapano proprio sopra il sito di destinazione con un angolo di 45 gradi rispetto al cranio e inizia a perforare.

Fare attenzione a non perforare il cervello per prevenire danni corticali. Dopodiché, pulisci il sangue dal foro con una punta di cotone sterile. Abbassa la siringa in modo che la punta si trovi proprio sulla superficie del cervello.

Impostare la coordinata DV su zero, quindi abbassare la siringa alla profondità desiderata. Ora inizia l'iniezione a una velocità di 0,2 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, attendere circa due minuti per assicurarsi che l'eventuale residuo di virus sia stato assorbito.

Quindi sollevare lentamente una siringa. Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere eventuali liquidi dal sito di iniezione. Successivamente, sutura la pelle e rimuovi l'animale dal sistema stereotassico.

Tieni il mouse sul termoforo fino a quando non si sveglia e somministra ulteriore analgesico quando necessario. In questa procedura, ottenere un'arena quadrata di plastica. Pulisci l'arena con alcol etilico al 70% prima dell'esperimento.

Quindi posiziona l'arena sul pavimento e assicurati che l'illuminazione sia impostata per ridurre al minimo le ombre e l'abbagliamento. Quindi, regolare le impostazioni di rilevamento in modo che il mouse sia visibile sullo schermo. Successivamente, accendi la fotocamera per registrare l'attività comportamentale e posiziona il mouse verso la parte anteriore centrale dell'arena in modo che il mouse sia rivolto verso il muro.

Imposta il timer per cinque minuti e allontanati dall'arena o lascia la stanza. Dopo cinque minuti, trasferisci nuovamente il mouse nella gabbia. Usa il 70% di alcol etilico per pulire a fondo il campo prima di procedere con l'animale successivo.

Ora riempi un secchio trasparente da due litri con acqua a 22 gradi. Posiziona il secchio sul pavimento e assicurati che l'illuminazione sia impostata per ridurre al minimo le ombre e l'abbagliamento. Se si utilizza un software di tracciamento, posizionare la telecamera direttamente sopra il secchio.

Regolare le impostazioni del software in modo che il mouse sia facilmente visibile sullo schermo. Quindi accendi la fotocamera per registrare l'attività comportamentale. Posiziona delicatamente il mouse al centro del secchio d'acqua in modo che le sue zampe anteriori.

Toccare prima l'acqua ed evitare che la sua testa si immerga. Successivamente, imposta il timer per sei minuti prima di allontanarti dall'area comportamentale. Dopo sei minuti, togli il mouse dal secchio, rimuovi l'acqua in eccesso prima di rimetterlo nella gabbia.

Ecco una fetta di cervello rappresentativa, che illustra il successo dell'iniezione del virus nel giro dentato. Questa figura mostra la quantità di tempo che i topi di controllo e sperimentali hanno trascorso al centro di un nuovo campo aperto. I topi sperimentali hanno trascorso molto meno tempo al centro dell'arena, indicando un fenotipo di ansia, e questa cifra mostra la quantità di tempo in cui i topi di controllo e sperimentali sono rimasti immobili nel test di nuoto forzato.

I topi sperimentali non erano significativamente diversi dai controlli nella quantità di tempo trascorso immobile. Dopo aver visto questo video, gli spettatori dovrebbero avere una buona idea di come utilizzare le iniezioni stereotassiche per valutare i comportamenti dei roditori.