Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la strategia di incorporazione dei cappucci antigenici per lo sviluppo di approcci vaccinali a vettore del sierotipo cinque dell'adenovirus utilizzando un vettore adenovirale bivalente ricombinante come prova di principio utilizzando la strategia di incorporazione del capside dell'antigene, vengono utilizzate più fasi di clonazione per costruire il plasmide modificato, A D cinque R uno K-W-S-H-V-R cinque sibili. Successivamente, il vettore virale bivalente dell'adenila. R uno K era HVR cinque.

Hiss viene salvato, propagato e purificato. Successivamente vengono caratterizzati i titoli virali e la visualizzazione antigenica degli antigeni incorporati sul capside virale. Infine, il potenziale del vettore virale Aden bivalente di eludere la neutralizzazione da parte di un siero D cinque positivo è valutato utilizzando la strategia di incorporazione del capside dell'antigene.

Vengono utilizzate più fasi di clonazione per costruire il plasmide modificato, A D cinque R uno K-W-A-S-H-V-R cinque sibilo. Oggi dimostreremo la strategia di incorporazione del capside dell'antigene. Questa strategia è vantaggiosa rispetto ad altre strategie, come il metodo di espressione del transgene, perché non solo mostra l'antigene di interesse sull'adenovirus in cattività come una proteina, ma consente una robusta risposta umorale contro quell'antigene.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi relativi alla generazione dell'adenovirus che modifica il cappuccio sono difficili da apprendere perché molte variabili contribuiscono allo sviluppo dei vettori virali raccomandati, come la selezione degli enzimi di restrizione, la lente dell'energia di interesse in altri Dimostrazione delle procedure. Oggi saranno i miei due postdoc, il dottor Lin Lin Gu e la dottoressa Nitra Farrow. Anche Alexandre Kren, il ricercatore associato nel laboratorio Per costruire il plasmide shuttle, aggiungere sei unità ciascuna di uno GE e uno CCC a sei microgrammi dell'HVR un frammento KWA.

Incubare la reazione di digestione a 37 gradi Celsius per tre ore. Risolvere il frammento digestivo in un gel al 2% di agros mediante elettroforesi e utilizzare un kit di estrazione del gel di DNA secondo il protocollo del produttore per purificare il frammento. Successivamente, legare 12 nanogrammi del frammento purificato nei siti a G e ACC dei 100 nanogrammi del plasmide navetta precedentemente costruito.

HVR cinque sibili, sei pH, cinque s e un volume di reazione di 10 microlitri a temperatura ambiente per due ore. Quindi aggiungere un microlitro della reazione di legatura a 50 microlitri di cinque cellule alfa DH elettrocompetenti, un elettro otto prima di aggiungere 950 microlitri di terreno SOC. Incubare le cellule trasformate a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per un'ora prima di distribuire da 100 a 200 microlitri di coltura su una piastra LB CNY.

Incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Utilizzare sei unità ciascuna di Echo R one e PME one per digerire sei microgrammi del plasmide shuttle purificato a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver purificato il frammento contenente i bracci di ricombinazione omologa e il gene del doppio esone cinque modificato, utilizzare SUA uno per linearizzare il plasmide della spina dorsale, PAD cinque, delta H cinque per eseguire la ricombinazione omologa.

Utilizzare l'elettroporazione per cotrasformare 100 nanogrammi ciascuno del frammento di navetta purificato e del plasmide della spina dorsale in 50 microlitri di celle elettrocompetenti BJ 5 180 3. Come dimostrato in precedenza in questo video il giorno seguente, raccogli circa 10 colonie in tre millilitri di LB liquido contenente micina can e cresci durante la notte prima dello screening secondo il protocollo di testo. Quindi trasformare 100 nanogrammi di plasmide purificato in cellule DH cinque alfa come precedentemente dimostrato per salvare il vettore virale aggiunto.

Iniziare utilizzando PAC one per linearizzare 15 microlitri del vettore in un volume di 100 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore dopo la digestione. Estrarre il plasmide linearizzato sotto una cappa aspirante.

Aggiungere un volume uguale di cloroformio fenolico, alcol isoamilico alla centrifuga di reazione a 10.000 g per un minuto e raccogliere il surnatante prima di ripetere l'estrazione e centrifugare al volume estratto. Aggiungere 300 microlitri di etanolo al 100% e 10 microlitri di acetato centrifugare a 10.000 g per 10 minuti. Quindi, dopo aver scartato il surnatante, aggiungere 700 microlitri di etanolo al 70% prima di girare di nuovo.

Una volta che il pellet è stato risospeso e il DNA è stato quantificato, trasfettare tre microgrammi del plasmide linearizzato insieme al reagente di trasfezione liposomiale commerciale in un pallone T 25 precedentemente preparato di cellule HEK 2 93 confluenti all'80% secondo le istruzioni del produttore. Dopo l'incubazione per sei ore, sostituire il terreno di trasfezione con un terreno completo prima di rimettere il pallone nell'incubatore. Quando le placche sviluppano un effetto citopatico completo o CPE sotto una cappa sterile, raschiare le cellule rimanenti dal pallone e centrifugare la coltura a 300 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi utilizzare un millilitro di terreno contenente il 2% di FBS per risospendere il pellet della cella. Successivamente, rompere le celle eseguendo quattro cicli di scongelamento a freddo, quindi centrifugare il lisato a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere il surnatante S contenente il virus salvato per propagare il vettore virale su una coltura su larga scala.

Un terzo di tutto il lisato virale proveniente dal pallone T 25 in un pallone T 75 contenente 2 93 cellule. Dopo aver permesso lo sviluppo del CPE completo e aver raccolto il supinato come precedentemente dimostrato, propagare metà di tutto il virus in uno o più. T 1 75 flaconi di cellule HK 2 93 propagano quindi il virus isolato dai flaconi T 1 75 in una dozzina o più.

T 1 75 fiasche di cellule dopo aver preparato un punto 33 grammi per millilitro e 1,45 grammi per millilitro. Le soluzioni di cloruro di cesio aggiungono quattro millilitri, 1,33 grammi per millilitro, di cloruro di cesio a una provetta per ultracentrifuga e aggiungono quattro millilitri, 1,45 grammi per millilitro, di cloruro di cesio contro il fondo della stessa provetta . Aggiungere quattro millilitri di lisato virale supinato sulla parte superiore della stessa provetta, quindi centrifugare la provetta a 110.000 G e quattro gradi Celsius per tre ore.

Questo separerà la banda virale inferiore matura dalla banda virale superiore difettosa sotto il cofano. Utilizzare un ago calibro 33 collegato a una siringa da tre millilitri per raccogliere la fascia inferiore. Quindi usa cinque hippie per portare la soluzione fino a quattro millilitri.

Quindi, dopo aver preparato altri due gradienti di cloruro di cesio, caricare il virus diluito sopra e centrifugare i gradienti a 110.000 G e quattro gradi Celsius durante la notte. Sotto il cofano. Raccogli la banda virale come appena dimostrato.

Quindi utilizzare un ago calibro 33 e una siringa da tre millilitri per iniettare la soluzione virale in una cassetta per dialisi. Inserito una cassetta in 700 millilitri di un tampone per dialisi preparato secondo il protocollo di testo, sostituendo il tampone quattro volte ogni tre ore. Quindi utilizzando un ago e una siringa.

Raccogliere la soluzione virale dalla cassetta per determinare il titolo fisico virale. Utilizzare il tampone di lisi virale per diluire sia il virus che il tampone di dialisi utilizzati come controllo di fondo da uno a 10 e da uno a 20 e incubare tutte le provette a 56 gradi Celsius per 10 minuti. Accendere un biofotometro e impostare la modalità di assorbanza su una densità ottica di 260 nanometri.

Utilizzare il tampone per dialisi diluito da uno a 10 per bilanciare il segnale di fondo facendo clic sul pulsante vuoto. Digitare 10 più 90 sullo schermo del biofotometro. Sostituire la provetta con una provetta di virus diluita a 1 a 10 e leggere il segnale del virus diluito a 1 a 10.

Per misurare la diluizione da uno a 20, utilizzare il tampone per dialisi diluito a uno a 20 per bilanciare lo sfondo digitando cinque più 95 sullo schermo prima di sostituire la provetta tampone con una provetta virale diluita da uno a 20 e leggere il segnale. Moltiplicare i due numeri di lettura del virus per 1,1 volte 10 per 12 e calcolare il titolo medio con unità di VP per millilitro in base ai due titoli individuali dei due dilu. Valutare il virus nei topi secondo il protocollo di testo per dimostrare se il virus salvato mostra l'antigene antigene antigenico HIV e l'etichetta hist sulla superficie del capside virale.

Proteina principale Heon cinque. Eliza è stato effettuato rispettivamente con l'anticorpo monoclonale umano due F cinque e l'anticorpo monoclonale anti-sibilo di topo, come mostrato qui, sia l'anticorpo umano due F 5 che l'anticorpo anti-sibilo di topo legati alla particella virale bivalente add five, mentre non c'era alcun legame con il controllo negativo. Un'analisi del sangue occidentale a cinque vettori è stata utilizzata per confermare i dati di Eiza, poiché sia l'anticorpo umano a due F cinque che l'anticorpo anti-sibilo di topo hanno rilevato bande specifiche solo intorno a 117 kilodalton.

Nel DIVALENT aggiungere cinque virus, che corrisponde alla dimensione della proteina Heon cinque. Per valutare il potenziale del virus add five costruito per eludere la neutralizzazione aggiungendo cinque positivi, è stato effettuato un test di neutralizzazione. I risultati mostrano che le unità luminescenti relative o rlu erano 12 volte superiori quando il vettore di controllo add five è stato trattato senza aggiungere cinque siemi positivi rispetto a quando è stato trattato con siero, suggerendo che il virus è stato neutralizzato.

Al contrario, c'era poca differenza nell'uso di R per il virus AD 5 bivalente costruito tra campioni trattati e non trattati, suggerendo che il virus costruito è sfuggito alla neutralizzazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una maggiore comprensione dell'approccio di incorporazione del capside dell'antigene per lo sviluppo di vaccini a cinque vettori. Attualmente, stiamo utilizzando questa strategia in combinazione con rari vettori di sierotipi.

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