Utilizzando la strategia di Antigen Capside-Incorporation per lo sviluppo di approcci Adenovirus sierotipo 5 Vectored vaccino

L'obiettivo generale di questa procedura è sfruttare la strategia di incorporazione dei capside antigenici per lo sviluppo di approcci vaccinali basati su vettori virali del sierotipo cinque dell'adenovirus, utilizzando un vettore adenovirale ricombinante divalente come prova di principio. Mediante l'uso della strategia di incorporazione del capside antigenico, vengono effettuati diversi passaggi di clonaggio per costruire il plasmide modificato, A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss. Successivamente, il vettore adenovirale divalente. R one K era HVR five.

Hiss viene recuperato, propagato e purificato. Successivamente, vengono caratterizzati i titoli virali e la presentazione antigenica degli antigeni incorporati nel capside virale. Infine, viene valutata l'efficacia del vettore adenovirale bivalente nel circumnavigare la neutralizzazione da parte di sieri positivi per il sierotipo 5 mediante l'utilizzo della strategia di incorporamento dell'antigene nel capside.

Vengono utilizzati diversi passaggi di clonazione per costruire il plasmide modificato, A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss. Oggi illustreremo la strategia di incorporazione dell'antigene nel capside. Questa strategia è vantaggiosa rispetto ad altre, come il metodo di espressione del transgene, poiché non solo espone l'antigene di interesse sul capside dell'adenovirus sotto forma di proteina, ma consente anche una risposta umorale robusta contro tale antigene.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi relativi alla generazione del virus adenovirale modificatore del cap sono difficili da apprendere, dato che molte variabili influiscono nello sviluppo dei vettori virali raccomandati, come la scelta degli enzimi di restrizione e la lente dell'energia di interesse in altri procedimenti dimostrativi. Oggi saranno presenti i miei due postdoc, la dottoressa Lin Lin Gu e il dottor Nitra Farrow, oltre ad Alexandre Kren, l'associato di ricerca del laboratorio. Per costruire il plasmide shuttle, aggiungere sei unità ciascuna di GE uno e CCC uno a sei microgrammi del frammento HVR uno KWA.

Incubare la reazione di digestione a 37 gradi Celsius per tre ore. Risolvere il frammento digerito in un gel di agarosio al 2% mediante elettroforesi e utilizzare un kit di estrazione del DNA da gel secondo il protocollo del produttore per purificare il frammento. Successivamente, legare 12 nanogrammi del frammento purificato nei siti G uno e ACC uno di 100 nanogrammi del plasmide vettore precedentemente costruito.

HVR cinque hiss sei pH cinque s e un volume di reazione di 10 microlitri a temperatura ambiente per due ore. Quindi aggiungere un microlitro della reazione di ligazione a 50 microlitri di cellule DH cinque alpha elettrocompetenti, un elettro otto prima di aggiungere 950 microlitri di mezzo SOC. Incubare le cellule trasformate a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per un'ora prima di distribuire da 100 a 200 microlitri della coltura su una piastra LB CANY.

Incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius. Utilizzare sei unità ciascuna di Echo R uno e PME uno per digerire sei microgrammi del plasmide shuttle purificato a 37 gradi Celsius per tre ore. Dopo aver purificato il frammento contenente le braccia di ricombinazione omologa e il gene esone cinque doppio modificato, utilizzare SUA uno per linearizzare il plasmide del backbone, PAD cinque, delta H cinque, al fine di eseguire la ricombinazione omologa.

Utilizzare l'elettroporazione per co-trasformare 100 nanogrammi di ciascuno dei frammento vettore purificato e del plasmide impalcatura in 50 microlitri di cellule elettrocompetenti BJ 5 180 3. Come dimostrato precedentemente in questo video, il giorno seguente selezionare circa 10 colonie in tre millilitri di terreno LB liquido contenente canamicina e coltivare in agitazione durante la notte prima della selezione, secondo il protocollo descritto nel testo. Successivamente, trasformare 100 nanogrammi di plasmide purificato in cellule DH cinque alfa come illustrato in precedenza, al fine di recuperare il vettore virale add.

Iniziare utilizzando PAC uno per linearizzare 15 microlitri del vettore in un volume di 100 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per tre ore dopo la digestione. Per estrarre il plasmide linearizzato sotto cappa chimica.

Aggiungere un volume uguale di fenolo cloroformio, alcol isoamilico alla reazione, centrifugare a 10.000 G per un minuto e raccogliere il soprannatante prima di ripetere l'estrazione e la centrifugazione fino al volume estratto. Aggiungere 300 microlitri di etanolo al 100% e 10 microlitri di acetato, quindi centrifugare a 10.000 G per 10 minuti. Successivamente, dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere 700 microlitri di etanolo al 70% prima di centrifugare nuovamente.

Una volta risospeso il pellet e quantificato il DNA, trasfettare tre microgrammi del plasmide linearizzato insieme a un reagente commerciale di trasfezione liposomale in un flacone T25 precedentemente preparato contenente cellule HEK 293 al 80% di confluenza, seguendo le istruzioni del produttore. Dopo un'incubazione di sei ore, sostituire il mezzo di trasfezione con mezzo completo prima di reinserire il flacone nell'incubatore. Quando le placche mostrano un effetto citopatico completo o CPE sotto cappa sterile, raschiare le cellule rimanenti dal flacone e centrifugare la coltura a 300 ×g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi utilizzare un millilitro di mezzo contenente il 2% di FBS per risospendere il pellet cellulare. Successivamente, rompere le cellule eseguendo quattro cicli di congelamento-scongelamento, quindi centrifugare il lisato a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere il soprannatante S contenente il virus recuperato per propagare il vettore virale in una coltura su larga scala.

Un terzo fino all'intero lisato virale proveniente dalla fiasca T 25 in una fiasca T 75 contenente cellule HEK 2 93. Dopo aver permesso lo sviluppo completo del CPE e aver raccolto il soprannatante come precedentemente dimostrato, propagare metà di tutto il virus in una o più fiasche T 1 75 di cellule HK 2 93, quindi propagare il virus isolato dalle fiasche T 1 75 in una dozzina o più di fiasche.

Flaconi T 1 75 di cellule dopo aver preparato una soluzione di 1,33 grammi per millilitro e 1,45 grammi per millilitro. Aggiungere alle soluzioni di cloruro di cesio quattro millilitri di cloruro di cesio 1,33 grammi per millilitro in un tubo per ultracentrifuga e aggiungere quattro millilitri di cloruro di cesio 1,45 grammi per millilitro contro il fondo dello stesso tubo. Aggiungere quattro millilitri di lisato virale sopranatante sulla parte superiore dello stesso tubo, quindi centrifugare il tubo a 110.000 ×g e 4 gradi Celsius per tre ore.

Questo permetterà di separare la banda virale inferiore matura da quella virale superiore difettiva sotto la cappa. Utilizzare un ago da 33 gauge collegato a una siringa da tre millilitri per raccogliere la banda inferiore. Successivamente, utilizzare cinque hippies per portare la soluzione fino a quattro millilitri.

Quindi, dopo aver preparato altre due gradienti di cloruro di cesio, caricare il virus diluito in cima e centrifugare le gradienti a 110.000 G e quattro gradi Celsius per tutta la notte. Sotto cappa. Raccogliere la banda virale come appena dimostrato.

Quindi utilizzare un ago da 33 gauge e una siringa da tre millilitri per iniettare la soluzione virale in una cassetta per dialisi. Posizionare una cassetta in 700 millilitri di buffer per dialisi 1x preparato secondo il protocollo descritto nel testo, sostituendo il buffer quattro volte ogni tre ore. Quindi utilizzare un ago e una siringa.

Raccogliere la soluzione virale dalla cassetta per determinare il titolo fisico virale. Utilizzare il tampone di lisi virale per diluire sia il virus che il tampone di dialisi, usato come controllo di fondo, uno a 10 e uno a 20, e incubare tutti i tubi a 56 gradi Celsius per 10 minuti. Accendere un biotofotometro e impostare la modalità di assorbanza su una densità ottica di 260 nanometri.

Utilizzare il buffer di dialisi diluito 1:10 per bilanciare il segnale di fondo cliccando sul pulsante bianco. Digitare 10 più 90 sullo schermo del biofotometro. Sostituire il tubo con un tubo del virus diluito 1:10 e leggere il segnale del virus diluito 1:10.

Per misurare la diluizione uno a 20, utilizzare il buffer di dialisi diluito uno a 20 per bilanciare la tipizzazione di fondo 5 + 95 sullo schermo prima di sostituire il tubo del buffer con un tubo contenente il virus diluito uno a 20 e leggere il segnale. Moltiplicare i due valori di lettura del virus per 1,1 × 10¹² e calcolare la titolazione media in unità di VP per millilitro sulla base delle due titolazioni individuali ottenute dalle due diluizioni. Valutare il virus nei topi secondo il protocollo descritto nel testo per verificare se il virus recuperato esprime l'antigene HIV antigenico e il marcatore istidinico (hist tag) sulla superficie del capside virale.

La principale proteina Heon cinque. L'Elisa è stata eseguita con l'anticorpo monoclonale umano due F cinque e con l'anticorpo monoclonale murino anti-tag hiss, rispettivamente, come mostrato qui. Sia l'anticorpo umano due F cinque che l'anticorpo murino anti-hiss si sono legati alla particella virale bivalente add cinque, mentre non si è osservato alcun legame nel controllo negativo. Un'analisi Western blot con vettore A cinque è stata utilizzata per confermare i dati dell'Elisa, poiché entrambi gli anticorpi, umano due F cinque e murino anti-hiss, hanno rilevato bande specifiche intorno ai 117 chilodalton soltanto.

Nel DIVALENT aggiungere cinque virus, che corrisponde alle dimensioni della proteina Heon cinque. Per valutare il potenziale del virus add cinque costruito di eludere la neutralizzazione da parte di sieri add cinque positivi, è stato eseguito un saggio di neutralizzazione. I risultati mostrano che le unità luminose relative (rlu) erano 12 volte più elevate quando il vettore add cinque di controllo era stato trattato senza siero add cinque positivo rispetto al trattamento con siero, suggerendo che il virus era stato neutralizzato.

Al contrario, non si è osservata alcuna differenza significativa nell'utilizzo di R per il virus AD5 divalente costruito tra i campioni trattati e non trattati, suggerendo che il virus costruito sia sfuggito alla neutralizzazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione più approfondita dell'approccio di incorporamento del capside antigenico per lo sviluppo di vettori vaccinali di tipo AD5. Attualmente, stiamo utilizzando questa strategia in combinazione con vettori di sierotipi rari.

Puoi fare anche questo.