Name: Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Scopri metodi di coltura di espianti di tessuto osseo umano per studiare la colonizzazione cellulare del carcinoma mammario nella nicchia metastatica. Questo modello consente analisi dettagliate di proliferazione, migrazione e comportamento cellulare.

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Questi studi sono stati finanziati, in parte, da finanziamenti della ricerca e sviluppo della Fondazione alternativa (107.588), l&#39;Istituto Nazionale della Salute (1U54CA136465-04S1), e la California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Ringraziamo Drs. Andrew Wilber e R. Scott McIvor per la generosa donazione di loro <pkt2 lubig=""> transponson e PK / hUbiC-SB11 plasmidi trasposasi. Noi riconosciamo con gratitudine John Tamaresis, Ph.D. per consigli su metodi statistici, Timothy Brown per l&#39;esecuzione di citometria a flusso, Georgette Henrich per consigli su migrazioni saggi, e Nancy Bellagamba per facilitare la raccolta di campioni THR. </pkt2>

Teste femorali sono stati prelevati da pazienti sottoposti a chirurgia elettiva THR presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Stanford. Tutti i tessuti sono stati raccolti come campioni de-identificati conformemente ai regolamenti della ricerca dell&#39;Ufficio Compliance Stanford University. 1. Selezione di un cancro al seno linea cellulare (s) <ol><li> Ottenere o trasfettare linea di cellule di cancro al seno desiderata (s) con una luciferasi-GFP giornalista costrutto. I seguenti esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il MCF-7 di cancro al seno linee cellulari progettati per l&#39;espressione stabile di luciferasi lucciola (Fluc) e la proteina fluorescente verde (EGFP) MDA-MB-231 e dalla trasfezione con la Bella Addormentata transposon plasmide pKT2 / Lubig e il pK trasposasi plasmide / hUbiC-SB11 45,46. NOTA: Le linee cellulari transfettate sono indicati come MDA-MB-231-Fluc-EGFP e MCF-7-Fluc-EGFP. </li></ol> 2. Isolare Tissue Fragments da femorali Heads <ol><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico THR, raccogliere la testa femorale scartato in un contenitore sterile riempito con soluzione salina fisiologica. Trasferire il campione al laboratorio ed elaborare entro 1-3 ore di intervento chirurgico. Nota: se c&#39;è un ritardo nella lavorazione, posizionare il campione a 4 ° C. </li><li> Preparare una zona di lavoro inserendo le seguenti voci su un tappetino assorbente in una cappa coltura tissutale flusso laminare: guanti sterili, rongeur chirurgica, pinze, bicchiere con il 70% di isopropanolo per lavare gli strumenti e recipienti di coltura dei tessuti, come previsto per ogni tipo di esperimento . </li><li> Indossare un guanto chirurgico sterile per tenere la testa del femore rotonda in una mano, utilizzare la rongeur nell&#39;altra mano per estrarre frammenti ossei trabecolari di dimensioni desiderate (~ 2-5 mm) dal albero superiore esposta del femore. Trasferire frammenti ossei nel recipiente di coltura (ad esempio, 6, 12, o 24 pozzetti coltura tissutale o camera di migrazione), a seconda del tipo della proliferazione, colesperimento onization o la migrazione, come descritto nei passaggi da 3, 4 o 5. NOTA: frammenti di tessuto osseo deve essere raccolto come descritto sopra dopo aver completato i passaggi iniziali per ogni saggio specifico di proliferazione, colonizzazione o migrazione. Frammenti varieranno in dimensioni come mostrato in Figura 2. I frammenti possono essere pesati prima o dopo esperimenti allo scopo di normalizzazione. </li></ol> 3. Co-coltura di cellule tumorali del seno Adiacente a frammenti ossei di Misura seno Cell Proliferation Uso BLI <ol><li> Prima dell&#39;esperimento, preparare una sospensione contenente 2 x 10 5 cellule del cancro al seno / 50 microlitri, e preparare i tappi di cera osso per immobilizzare frammenti ossei nella cultura. Tagliare una punta P200 micropipetta in 3 pezzi e utilizzare l&#39;estremità più stretta il più grande pezzo in modo &quot;cookie cutter&quot; per tagliare piccoli (~ 35 mg) pezzi di cera osso. Utilizzare l&#39;estremità larga del pezzo più piccolo per espellere i tappi di cera osso in una capsula di Petriper lo stoccaggio. </li><li> Posizionare un pezzo di cera osso nella posizione delle 12 di ogni bene e premere delicatamente con un indice sterile guantata. </li><li> Pipettare 50 ml di sospensione cellulare contenente 1 x 10 5 cellule di carcinoma mammario in DMEM-10% FBS + Pen-Strep nel centro di ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. (In alternativa, le cellule di semi in un modello di dispersione, se lo si desidera). Posizionare la piastra a 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 45 min a promuovere l&#39;adesione delle cellule. </li><li> Mettere frammento osseo 1 su 1 pezzo di cera dell&#39;osso per ogni pozzetto sperimentale e applicare una leggera pressione con il rongeur per fissarlo. Effettuare esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti ossei di un dato campione THR vengono inseriti nei primi tre pozzi, mentre la parte inferiore tre pozzi contengono cera osso solo come controlli. </li><li> Usando una pipetta da 5 ml, delicatamente e lentamente fornire 5 ml di DMEM-10% FBS al lato di ogni pozzetto per evitare di spostare le cellule del seno o frammenti ossei. Posizionare la piastra a 3776; C tessuto cultura incubatore per 20-24 ore. </li><li> Per eseguire l&#39;imaging bioluminescenza (BLI) rimuovere la piastra dall&#39;incubatore e aggiungere substrato luciferina (per ottenere una concentrazione di 300 mg / ml) per ciascun bene. Immagine del piatto immediatamente su una piattaforma di imaging IVIS utilizzando i seguenti parametri: f-stop di 1, piccolo di categorizzazione, tempo di esposizione di 1 sec, livello D. Misurare l&#39;intensità del segnale di ogni e radianza media (fotoni / secondo / centimetro quadrato / steradiante). </li><li> Utilizzare il software di imaging per definire regioni di interesse (ROI) per quantificare la radianza media per tutti i pozzetti sperimentale e di controllo. Esportare i valori medi di radianza a un foglio Excel per effettuare statistiche e generare grafici. </li></ol> 4. Co-coltura di cellule tumorali del seno seminati direttamente su frammenti ossei allo Studio Colonizzazione e numero di cellulare <ol><li> Utilizzare pinze per inserire frammenti ossei direttamente nei pozzetti vuoti di una piastra di coltura tissutale 24 pozzetti (1 frammento / pozzetto). </li><li> Semeette 50 microlitri sospensione cellulare gocciolina di DMEM-10% FBS contenente 1 x 03-06 Ottobre cellule di carcinoma mammario direttamente sulla parte superiore di ciascun frammento osseo. Posizionare la piastra a 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 45 min a promuovere l&#39;adesione delle cellule. Aggiungere delicatamente 1-2 ml DMEM-10% FBS nel lato di ciascun pozzetto tale che il frammento è interamente sommerso in terreno. Incubare la piastra a 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 20-24 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, utilizzare pinze per trasferire ciascun frammento tessuto osseo ad una piastra da 24 pozzetti fresco contenente 1 ml DMEM-10% FBS in ciascun pozzetto. Per eseguire BLI, seguire i passaggi 3,6-3,7 sopra. Inoltre, i frammenti possono essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza, o scaricate per ottenere la popolazione osseo per le analisi di numero di cellule di cancro al seno e le proprietà come descritto al punto 6. </li><li> Per preparare i frammenti intatti per la valutazione qualitativa al microscopio a fluorescenza seguente BLI, pipetta 5 ml di soluzione di etichettatura bifosfonati fluorescente (preconfrontato secondo le istruzioni del produttore) in ogni pozzetto per etichettare spicole mineralizzati dei frammenti ossei. Incubare la piastra nel tessuto culturale incubatore per un altro 24 hr. </li><li> Dopo 24 ore di cultura in soluzione di etichettatura bifosfonati fluorescente, utilizzare pinze per trasferire i frammenti di piastre di coltura dei tessuti contenenti fenolo mezzo privo di rosso e vista utilizzando un microscopio a fluorescenza configurato per GFP immagine (485 nm) e l&#39;etichetta bifosfonati (680 nm). </li></ol> 5. Misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno a frammenti ossei dei tessuti e colto Bone Fragment surnatante <ol><li> La migrazione verso il tessuto osseo cultura surnatante. NOTA: eseguire esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti di un dato campione THR sono usati per generare 3 surnatanti. Per ogni esperimento, la migrazione è confrontata su tre pozzetti contenenti surnatanti ossee vs tre pozzetti contenenti mezzo di controllo solo. <ol><li> Genera tis ossocitare supernatanti inserendo frammenti ossei nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenenti 2.2 ml DMEM-10% FBS per pozzetto. Cultura in un 37 ° C di tessuto cultura incubatore per 24 ore. Estrarre il supporto a 24 ore e sostituirlo con 2,2 ml di fresca DMEM-10% FBS. Pozzetti di controllo Trattare contenenti DMEM-10% FBS allo stesso modo. NOTA: Il terreno è cambiata in 24 ore per rimuovere i fattori secreti in risposta al trauma dei tessuti derivanti da un intervento chirurgico. Perché supernatanti tessuto osseo sono generati in FBS contenenti medie, pozzetti contenenti FBS contenente medio solo sono inclusi per il controllo per i contributi di FBS alla migrazione delle cellule del cancro al seno. </li><li> A 48 ore, raccogliere 0,9 ml di ogni surnatante / mezzo di controllo e pipetta nei pozzetti di una piastra ricevente. Gli inserti saranno poi inseriti in questi pozzi. Incubare la piastra ricevente nel tessuto cultura incubatore mentre semina gli inserti. Nota: Il surnatante rimanente (~ 1 ml dopo evaporazione) possono essere raccolti per l&#39;analisi di secretome factors se desiderato 44. </li><li> Per seminare gli inserti Transwell, metterli in uno standard, di 24 e piastra di coltura tissutale vuoto. Pipettare sospensione cellulare 350 microlitri contenente 1 x 10 5 cellule di carcinoma mammario in DMEM-10% FBS sulla superficie della membrana interna superiore di ciascun inserto come illustrato nella Figura 1A. Posizionare la piastra da 24 pozzetti contenenti gli inserti testa di serie nel 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 45 minuti per promuovere l&#39;attaccamento. </li><li> Una volta che le cellule hanno attribuito agli inserti, utilizzare pinze per trasferire gli inserti alla piastra ricevitore secondo le istruzioni del produttore. Angolo ogni inserto quando collocandola nel ricevitore bene per evitare la formazione di bolle tra la membrana di inserimento e il ricevitore ben surnatante. Incubare la piastra ricevitore con inserti per 20 ore a 37 ° C di tessuto cultura incubatore. NOTA: Controllare il lato inferiore della piastra ricevente per bolle tra la membrana inserto e il ricevitore ben supernatant. Se le bolle sono visibili, rimuovere gli inserti specifici e riposizionarli nel ricevitore bene fino a quando non bolle sono presenti. </li><li> Dopo 20 ore di uso pinze per rimuovere gli inserti dalla piastra ricevente. Utilizzando le procedure nei passaggi 3,6-3,7 eseguire BLI all&#39;immagine le cellule che hanno migrato in e allegate al fondo dei pozzetti della piastra del ricevitore. </li></ol></li><li> Migrazione verso frammenti di tessuto osseo. NOTA: eseguire esperimenti in triplice copia in modo che 3 frammenti di un dato campione THR sono posti in 3 inserti separati, e 3 perle di vetro sono posti in 3 inserti indipendenti come controlli. <ol><li> Preparare la piastra ricevente pipettando 0,9 ml DMEM-10% FBS in ogni pozzetto. Inserirlo nel tessuto cultura incubatore durante la preparazione gli inserti. </li><li> Per seminare gli inserti, li invertire sulla superficie di una scatola di provetta per microcentrifuga di plastica che ha un coperchio. Pipettare 50 microlitri sospensione cellulare goccia di DMEM-10% FBS contenente 1 x 10 5 cellule del cancro al seno directly esterna sulla superficie inferiore di ciascuna membrana inserto (che è rivolto verso l&#39;alto sugli inserti invertiti). Coprire la scatola tubo microcentrifuga con il coperchio rotto aperto e le trasferisce al 37 ° C incubatore tessuto per 45 min a promuovere l&#39;adesione delle cellule. </li><li> Trasferire la casella tubo microcentrifuga alla cappa coltura tissutale, e utilizzare pinze per girare le teste di serie inserti lato destro e trasferirli nei pozzetti della piastra ricevente. Pipettare 0.450 ml DMEM-10% FBS in ogni tazza di inserimento. Utilizzando pinze, trasferire un frammento di tessuto osseo (~ 3 mm) in ogni tazza inserto preparato. Facoltativamente, utilizzare perle di vetro come controlli negativi in ​​altri pozzi. Porre la piastra in un tessuto cultura incubatore per 20 ore. </li><li> Per misurare la migrazione, preparare un 24-pozzetti di coltura tissutale standard contenente 1 ml di DMEM-10% FBS per pozzetto. Rimuovere la piastra ricevente dall&#39;incubatore e utilizzare pinze per trasferire i frammenti e le perle di osso da ciascun inserto in pozzetti separati della piastra standard. Aggiungi luciferinasubstrato (per ottenere una concentrazione finale di 300 mg / ml) ad ogni pozzetto ed eseguire BLI utilizzando le procedure descritte in passaggi 3.6-3.7. </li></ol></li></ol> 6. Ulteriori analisi pre e post-sperimentali <ol><li> Analisi di midollo arrossato. <ol><li> Trasferire un frammento osseo in una cella di filtro 70 micron posto alla sommità di una provetta conica da 50 ml. Utilizzare una siringa da 10 ml con un ago 25 G per irrigare energicamente il frammento con 10 ml di PBS per ottenere una sospensione di cellule di midollo nel tubo conico. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 300 xg e 21 ° C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule pellet in PBS o altra soluzione desiderata per citometria a flusso. NOTA: volumi di risospensione variano a seconda delle dimensioni del pellet cellulare dopo centrifugazione, e l&#39;applicazione. </li><li> Per i saggi di vitalità ~ 75-300 volumi microlitri di PBS sono appropriate, e queste sospensioni possono essere analizzati utilizzando disponibili in commercio fluorescence saggi di vitalità basate secondo le istruzioni del fabbricante, pipettati in un emocitometro convenzionali, e contate con un microscopio a fluorescenza invertito. </li><li> Per l&#39;analisi citometrica di flusso o ordinamento base al rilevamento di cellule di carcinoma mammario GFP-positive, risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS contenente 2% FBS, 2 mM EDTA e 10 mM HEPES tale che la concentrazione è di 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol></li><li> H &amp; E colorazione ed immunoistochimica. <ol><li> Per elaborare i frammenti di ematossilina e eosina (H &amp; E) colorazione e / o immunoistochimica, posizionare i frammenti in cassette di plastica etichettati con una matita numero 2, e immergere in un contenitore riempito con il 10% formalina per 24 ore. </li><li> Tessuti di processo per paraffina, sezionamento e colorazione utilizzando protocolli di routine che includono una fase di decalcificazione per spiegare le spicole mineralizzate all&#39;interno di ogni frammento. </li></ol></li></ol>

Nessuna divulgazione da segnalare.

Mehra et al. Hanno descritto in precedenza la raccolta e l&#39;analisi di campioni ossei postmortem di pazienti affetti da carcinoma prostatico metastatico raccolte al momento dell&#39;autopsia, rivelando i tessuti di alta qualità e per validare l&#39;uso di campioni di ossa umane per studiare il processo metastatico 47. Qui abbiamo descritto i protocolli per la raccolta, l&#39;elaborazione e l&#39;utilizzo di frammenti di tessuto osseo umano ottenuti da teste femorali scartati dopo l&#39;intervento ...

Il microambiente tumorale è ampiamente riconosciuto come un fattore determinante del comportamento delle cellule di cancro durante la progressione del cancro al seno e metastasi diffuse 1-3. L&#39;obiettivo del metodo presentato qui è quello di facilitare lo studio delle cellule del cancro al seno nel microambiente del tessuto osseo umano, la sede più frequente di cancro al seno metastasi 4-6. Bone comprende mineralizzati e midollo compartimenti 7-9, entrambe ospitano cellule e fattori secreti implicati nella progressione metastatica 10,11. Benché ampiamente utilizzato in modelli di topo vivo facilitare studi sistemici del processo metastatico 12-15, interazioni delle cellule all&#39;interno dello scheletro non sono facilmente accessibili per l&#39;osservazione e la perturbazione diretta. Sistemi modello per lo studio e la coltura dei tessuti osseo di topo e cellule del mouse midollo forniscono un migliore accesso e hanno prodotto molte intuizioni per quanto riguarda le interferenze ei meccanismi alla base delle cellule del cancro al seno metastasis dello scheletro murino 16-22. Tuttavia, gli studi hanno suggerito che ci possono essere specie-specifiche modelli di osteotropism per il tessuto osseo 23,24. Questi modelli potrebbero riflettere specie-specifiche intrinseche differenze nelle proprietà del tessuto osseo, differenze derivanti dalla alterati popolazioni di midollo osseo in topi con deficit immunitario 11, e / o la relativamente giovane età di topi utilizzati in esperimenti, che sono tutti probabili determinanti dell&#39;osso microambiente. In vitro approcci per studiare le cellule del cancro al seno in co-colture di ossa umane sono in genere concentrati su specifici tipi di cellule di osso, come osteoblasti derivate dal midollo o cellule stromali in coltura come monostrato oa ingegnerizzati sistemi modello 3-dimensionale 25-35. Sebbene i modelli di coltura cellulare a 2 dimensioni hanno costituito la colonna portante di in vitro approcci per la ricerca sul cancro, si è da tempo riconosciuto che il comportamento delle cellule è fondamentalmente alterata in monolayer sistemi di coltura 18,36,37. Questo ha portato allo sviluppo di microambienti ingegnerizzati che imitano la complessità dei tessuti viventi 3-dimensionali, compresi da matrice e modelli basati scaffold composti di materiali naturali quali collagene, polimeri sintetici o seminate con specifici tipi cellulari per creare microambienti tessuto-like 36-41. Approcci di ingegneria hanno incluso anche l&#39;uso di piattaforme bioreattore per controllare e studiare il milieu ormonale del microambiente 18,19,41-43. Sebbene i modelli biomimetici e bioreattori forniscono molti elementi di un microambiente tissutale complesso in un ambiente controllato, e sono state applicate con successo per promuovere lo studio delle metastasi del cancro al seno alle ossa 18,19,35,42,43, sistemi modello ingegnerizzati genere non incorporano l&#39;intera gamma di tipi di cellule e componenti della matrice extracellulare presenti all&#39;interno dell&#39;ambiente osso nativo. Fino a poco tempo, il cancro al senocellule non sono stati studiati nel nativa, intatta, microambiente 3-dimensionale del tessuto osseo umano. Recentemente abbiamo segnalato lo sviluppo di un modello di co-coltura con frammenti di tessuto osseo umano isolato da protesi totale d&#39;anca (THR) Chirurgia campioni 44. Questi esemplari porto sia i comparti mineralizzate e midollo necessarie per studiare i meccanismi alla base di micro-metastasi in coltura breve termine. In lavori precedenti abbiamo stabilito prova di principio per l&#39;utilizzo di bioluminescenza (BLI) per monitorare la proliferazione delle cellule del cancro al seno-luciferasi che esprimono (MDA-MB-231-Fluc) co-coltura con frammenti di ossa 44. Qui vi presentiamo dettagliate protocolli sperimentali per lo studio la proliferazione delle cellule del cancro al seno, la colonizzazione, e la migrazione nel contesto del microambiente nativo utilizzando espianti di tessuto osseo umano. Innanzitutto vi presentiamo un protocollo per la co-coltura di cellule di cancro al seno adiacenti frammenti ossei per misurare senoproliferazione cellulare utilizzando BLI. In questa sezione, sospensioni di cellule vengono seminate al seno come macchie di cellule in piastre da 6 pozzetti adiacenti frammenti ossei, che sono immobilizzati da pezzi di cera ossea. Pozzetti di controllo contengono cera ossea, ma nessun frammento osseo. Una volta che i punti di cellule attaccano, si aggiunge medio e il piatto è in coltura per 24 ore, dopo di che l&#39;intensità del segnale bioluminescente (associato al numero di cellulare) viene misurata con BLI. Nella fase successiva vi presentiamo i metodi per le cellule del cancro al seno co-coltura seminati direttamente su frammenti di ossa di studiare la colonizzazione e la proliferazione. Qui le sospensioni cellulari seno sono pipettati direttamente sui frammenti di tessuto osseo, che sono monitorati nella cultura da BLI e microscopia a fluorescenza nel tempo per monitorare la colonizzazione e il numero di cellulare. In questo metodo, il vano osseo può essere lavato dai frammenti ossei in qualsiasi punto di tempo per l&#39;analisi di cellule di carcinoma mammario colonizzati mediante citometria di flusso, o saggi di vitalità osseo. Inoltre, Describa due diversi approcci per misurare la migrazione delle cellule del cancro al seno. Nel primo metodo passaggi vengono descritti per misurare la migrazione verso tessuto osseo supernatanti di coltura. In questo protocollo le cellule tumorali del seno vengono seminate sulle interni, superfici superiori di Transwell inseriscono membrane con un 8 micron dimensione dei pori (come mostrato nella Figura 1A). Gli inserti vengono poi poste in un piatto ricevitore con pozzetti contenenti surnatante tessuto osseo o mezzo di controllo. Nel corso di un periodo di incubazione di 20 ore, un piccolo numero di cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane inserto giù nei pozzetti inferiori tessuto coltura dove attaccano alla rivelazione per BLI. Nel secondo metodo di migrazione delle cellule tumorali del seno vengono seminate sulle superfici esterne inferiori delle membrane inserti Transwell. Frammenti di tessuto osseo vengono inseriti nelle tazze di inserimento e le cellule di carcinoma mammario migrano attraverso le membrane a colonizzare i frammenti ossei (come mostrato nella Figura 1B), chevengono poi ripreso con BLI.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>Integrare tutto il DMEM con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>Integrare tutti i McCoy's con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di Pen/Strep</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidina (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Terreni supplementari utilizzati per linee cellulari trasfettate.</td></tr><tr><td>Falco Inserti per colture cellulari per piastre a 24 pozzetti con membrana in PET trasparente (8.0 &mu; Inserto</td> per <td></td><td></td> colture cellulari in polistirene trattato con TC a 24 pozzetti Corning Incorporated Corning Incorporated 353097 353504 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di vitalità/citotossicità LIVE/DEAD *per cellule di mammifero*</td><td>Tecnologie di rilevamento di invitrogeni</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina lucciola, sale di potassio 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare sterile 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Cluster di colture cellulari trattate con TC a 6 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cluster di colture cellulari trattate con TC a 12 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Cluster di colture cellulari trattate con TC a 24 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Cera ossea</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Piattaforma di imaging</td><td>Calibro Life Sciences/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software Program&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Imaging System</td><td>Life Technologies</td><td>Versione 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 cellule di cancro al seno</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 cellule di cancro al seno</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Citocheratina monoclonale di topo anti-umana anticorpo</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Bone è la sede più comune di metastasi del cancro al seno. Anche se è ampiamente accettato che il comportamento delle cellule di cancro influenze microambiente, poco si sa circa le proprietà delle cellule del cancro al seno e comportamenti all&#39;interno del microambiente nativo del tessuto osseo umano. Abbiamo sviluppato approcci per monitorare, quantificare e modulare le cellule del cancro al seno umano nel microambiente di frammenti umani in coltura di tessuto osseo isolati da teste femorali scartati seguenti totali interventi chirurgici di sostituzione dell&#39;anca. Usando le cellule del cancro al seno ingegnerizzate per luciferasi e migliorate proteina fluorescente verde (EGFP) espressione, siamo in grado di quantificare in modo riproducibile di migrazione e proliferazione modelli che utilizzano l&#39;imaging bioluminescenza (BLI), interazioni cellulari pista entro i frammenti ossei mediante microscopia a fluorescenza, e valutare le cellule del seno dopo colonizzazione con citometria a flusso. I vantaggi principali di questo modello sono: 1) un nativo, MicroE tessuto architettonico intattonvironment che include importanti tipi di cellule umane, e 2) l&#39;accesso diretto al microambiente, che facilita la rapida quantitativa e monitoraggio qualitativo e perturbazione del seno e delle cellule delle ossa proprietà, comportamenti e interazioni. Una limitazione primaria, attualmente, è finita la vitalità dei frammenti di tessuto, che delimita la finestra di studio per coltura breve termine. Applicazioni del sistema modello comprendono lo studio della biologia di base di cancro al seno e di altri tumori maligni ossa cerca all&#39;interno della nicchia metastatica, e lo sviluppo di strategie terapeutiche per indirizzare in modo efficace le cellule del cancro al seno nei tessuti ossei.

Isolare frammenti di tessuto da femorali Heads Teste femorali sono stati raccolti da un numero uguale di pazienti di sesso femminile (44-90 anni di età) sottoposti a chirurgia elettiva di sostituzione totale dell&#39;anca presso il Dipartimento di Chirurgia Ortopedica presso la Facoltà di Medicina dell&#39;Università di Stanford maschile e. Ogni testa femorale scartato contiene una piccola porzione del femore, che porti tessuto osseo trabecolare composto spicole mineralizzati e osseo. Questo...

I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Lo scopo di questa procedura è studiare la proliferazione, la colonizzazione e la migrazione delle cellule del carcinoma mammario in un modello sperimentale di tessuto osseo umano. Questo viene ottenuto isolando frammenti di tessuto osseo trabecolare da campioni chirurgici della testa del femore e coltivandoli con cellule del carcinoma mammario che esprimono luciferasi e proteina fluorescente verde. L'imaging bioluminescente viene utilizzato per misurare la proliferazione cellulare e verificare la colonizzazione delle cellule del carcinoma mammario nei frammenti di tessuto osseo.I modelli di colonizzazione delle cellule del cancro al seno vengono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Il compartimento midollare può essere lavato dai frammenti ed analizzato mediante citometria a flusso, saggi di luminescenza e colorazione. La migrazione delle cellule del cancro al seno verso colture tessutali, supernatanti e frammenti di tessuto osseo viene misurata in camere di migrazione Transwell con imaging bioluminescente. L'osso rappresenta il sito più frequente di metastasi del cancro al seno e, in definitiva, questo modello fornisce una nuova finestra per lo studio delle cellule del cancro al seno all'interno della nicchia metastatica ossea.Un grande vantaggio di questo modello è che fornisce un accesso diretto al microambiente di frammenti di tessuto osseo umano, permettendoci di osservare e analizzare facilmente il comportamento delle cellule del cancro al seno durante esperimenti di co-coltura a breve termine. Questo metodo può essere utilizzato per studiare questioni fondamentali sui meccanismi alla base del cancro al seno e delle metastasi ossee, con l'obiettivo di identificare strategie terapeutiche efficaci per prevenire e trattare questa patologia. Sebbene questo modello possa fornire informazioni sulle metastasi del cancro al seno, può anche essere impiegato per studiare altre neoplasie con tropismo osseo, come il cancro alla prostata.È necessario raccogliere frammenti di tessuto osseo in diversi punti durante ogni saggio. Questa procedura inizia con il prelievo e il trasporto di un campione femorale in soluzione salina e con la preparazione della postazione di lavoro all'interno di una cappa a sicurezza biologica indossando un guanto chirurgico. Afferrare la testa del femore con una mano e utilizzare uno strumento chirurgico per estrarre l'osso trabecolare.I frammenti hanno una dimensione di circa due-cinque millimetri. Le pinzette non sono adatte per questo passaggio. È necessario un bisturi chirurgico di buona qualità.Per questo esperimento, preparare una sospensione di cellule tumorali del seno con 100.000 cellule per 50 microlitri di DMEM aggiungendo il 10% di FBS. Inoltre, preparare tappi di cera ossea per mobilizzare i frammenti ossei utilizzando le estremità tagliate di una punta per micropipetta, conservare i tappi in una piastra di Petri. Quindi, con una pinzetta, trasferire i tappi in una piastra a sei pozzetti e, utilizzando un guanto sterile, premere i tappi nella posizione delle 12.Successivamente, pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare al centro di ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 45 minuti per favorire l'adesione cellulare; mentre la piastra è in incubazione, estrarre i frammenti ossei con le cellule aderenti alla piastra. Posizionare un frammento di tessuto osseo sulla cera per ossa in tre pozzetti e premere delicatamente ciascuno usando il GER; i tre pozzetti senza frammenti serviranno da controlli.Successivamente, aggiungere lentamente cinque millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS alla parete di ciascun pozzetto. La cera ossea e i frammenti ossei non devono essere spostati. Quindi coltivare la cultura per 20-24 ore.Il giorno successivo, acquisire prima di tutto le immagini delle cellule. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ogni pozzetto, quindi acquisire immediatamente le immagini della piastra mediante una piattaforma di imaging Ivis. Questo esperimento richiede una sospensione di cellule di carcinoma mammario simile a quella utilizzata in precedenza.Dopo aver estratto i frammenti ossei, utilizzare pinzette per trasferire ciascun frammento in una pozzetta vuota di una piastra a 24 pozzetti, quindi pipettare 50 microlitri di sospensione cellulare direttamente su ciascun frammento osseo e trasferire la piastra in un incubatore per 45 minuti per favorire l'adesione cellulare. Una volta che le cellule si sono attaccate, aggiungere delicatamente da uno a due millilitri di mezzo in ciascuna pozzetta, in quantità sufficiente a immergere il frammento osseo. Successivamente, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 20-24 ore.In previsione dell'imaging Ivis, dell'imaging della fluorescenza o del prelievo di cellule midollari per l'analisi mediante imaging Ivis, trasferire i frammenti ossei in una piastra a 24 pozzetti con un millilitro di mezzo fresco per ogni pozzetto. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ogni pozzetto e procedere come descritto in precedenza per la microscopia a fluorescenza. Pipettare cinque microlitri di soluzione fluorescente di etichettatura con bisfosfonato in ogni pozzetto per marcare le spicole ossee del frammento osseo e incubare la piastra per ulteriori 24 ore.24 ore dopo, utilizzare pinzette per trasferire i frammenti in piastre contenenti mezzo privo di rosso fenolo. Quindi osservare le piastre mediante un microscopio a fluorescenza impostato per l’immagine a 485 nanometri per localizzare le cellule tumorali del seno che esprimono GFP e a 680 nanometri per identificare le spicole ossee marcate con bisfosfato, quindi lavare il compartimento del midollo osseo per l’analisi del numero di cellule o delle loro proprietà.Trasferire un frammento in un filtro da 70 micron posizionato sopra un tubo da 50 millilitri. Quindi utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago da 25 gauge per lavare vigorosamente il frammento con 10 millilitri di PBS. Centrifugare la sospensione a 300 ×g per tre minuti a temperatura ambiente per formare il pellet cellulare, aspirare e scartare il soprannatante.Piegare il pellet di cellule del midollo in PBS o in altre soluzioni desiderate per analisi mediante citometria a flusso o per saggi di vitalità. Iniziare generando una rete di tessuto osseo. Posizionare i frammenti ossei nei pozzetti di una piastra a 12. Piastra a pozzetti contenente 2,2 millilitri di DMEM con 10% FBS per pozzetto, lasciando alcuni pozzetti di controllo senza frammenti ossei. Coltivare la piastra per 24 ore. Successivamente, aspirare e sostituire il mezzo, quindi proseguire la coltura per altre 24 ore; a 48 ore dalla coltura, trasferire 0,9 millilitri di surnatante in una piastra ricevente, incubando temporaneamente la piastra ricevente.Posizionare gli inserti transwell in una piastra a 24 pozzetti vuota. Quindi seminare 100.000 cellule di carcinoma mammario in 350 microlitri su ciascun inserto. Successivamente, coltivare le piastre per 45 minuti per favorire l'adesione cellulare. Dopo 45 minuti, utilizzare pinzette per trasferire gli inserti in una piastra ricevente.Assicurarsi di posizionare gli inserti con un angolo rispetto al ricevitore. Supinare bene in modo da evitare la formazione di bolle. Quindi incubare la piastra con gli inserti per 20 ore a 37 gradi Celsius il giorno successivo.Utilizzare pinzette per rimuovere gli inserti e aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ciascun pozzetto. Eseguire l'immagine di bioluminescenza sulla piastra ricevente per rilevare le cellule tumorali del seno che hanno migrato attraverso le membrane e si sono attaccate al fondo dei pozzetti della piastra ricevente. Per prima cosa, caricare una piastra ricevente con mezzo e posizionarla nell'incubatore per colture cellulari.Per seminare gli inserti, capovolgerli in una scatola vuota per provette microfuse con coperchio. Quindi aggiungere 100.000 cellule in 50 microlitri sulla superficie esterna inferiore della membrana di ciascun inserto.Coprire la scatola lasciando il coperchio leggermente aperto e incubare i dispositivi per 45 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Successivamente, utilizzare pinze per capovolgere e trasferire i dispositivi, posizionando le pozze di una piastra ricevente all'interno di ogni coppa del dispositivo con 0,45 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS. Quindi aggiungere un frammento osseo di tre millimetri o una perlina di vetro in ciascun dispositivo e coltivare per 20 ore.Il giorno successivo utilizzare pinzette per trasferire i frammenti e le perle in una piastra con pozzetti contenenti un millilitro di mezzo fresco. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ogni pozzetto e procedere con l'acquisizione di immagini di bioluminescenza. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.Cellule tumorali del seno sono state coltivate in co-coltura adiacenti a frammenti ossei immobilizzati per misurare la proliferazione delle cellule mammarie. L'immagine bioluminescente dopo 24 ore di coltura ha mostrato un aumento della proliferazione delle cellule tumorali del seno in presenza di frammenti ossei nei tre pozzetti superiori rispetto all'assenza di frammenti ossei nei tre pozzetti inferiori. I risultati degli esperimenti condotti utilizzando frammenti provenienti da tre diversi campioni chirurgici hanno evidenziato una proliferazione maggiore in presenza rispetto all'assenza di osso.In tutti e tre i casi, è stata osservata mediante imaging bioluminescente, dopo 24 ore, la colonizzazione delle cellule MCF seven F Luke EGFP posizionate direttamente al di sotto di frammenti di tessuto osseo. Un segnale ridotto è stato associato alla diminuzione della densità di semina dopo 48 ore. Frammenti seminati direttamente e marcati con un reagente bifosfonato hanno rivelato la colonizzazione delle cellule tumorali del seno positive per GFP all'interno dei compartimenti mineralizzati e del midollo.La migrazione delle cellule tumorali del seno attraverso la membrana porosa verso la coltura di tessuto osseo, evidenziata nei tre pozzetti superiori, è risultata robusta rispetto alla migrazione verso il controllo. Mezzo visibile nei tre pozzetti inferiori. È stata inoltre osservata la migrazione verso tre frammenti ossei provenienti da un singolo campione di THR, mentre non è stata osservata alcuna migrazione sulle perle.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre frammenti di tessuto osseo umano da un campione di testa del femore e avviare saggi di co-coltura per misurare i comportamenti delle cellule tumorali del seno, inclusi migrazione, colonizzazione e proliferazione.

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A lungo termine Cultura di campioni umani cancro al seno e la loro analisi utilizzando la tomografia ottica di proiezione

Questo video descrive la coltura di cellule di cancro al seno adiacenti agli espianti ossei del femore per misurare la proliferazione e la colonizzazione delle cellule tumorali in un sistema modello di espianto di tessuto osseo umano.

Co-coltura di cellule BC: coltura di cellule di cancro al seno con frammenti ossei per studiare la proliferazione delle cellule tumorali

Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Coltura cellulare primaria utilizzando organoidi tessuto intatto fornisce un sistema modello che simula il microambiente multi-cellulare in vivo. Abbiamo sviluppato un primo modello di coltura di tessuti epitelio mammario senza siero che perpetua linee di colture cellulari miste e mostre differenziati morfologia, senza interruzione del tessuto enzimatico. Organoidi seno rimangono vitali per&gt; 6 mesi.

Non enzimatica, siero-libero Tissue Culture delle lesioni mammarie pre-invasive per la generazione spontanea di mammospheres

Qui presentiamo un protocollo per la co-coltura in tre dimensioni, che è utile per studiare le interazioni multicellulari e la modulazione dipendente dalla matrice extracellulare del comportamento delle cellule tumorali. In questo modello sperimentale, le cellule tumorali vengono coltivate su gel di collagene incorporati con fibroblasti umani associati al cancro.

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Questo manoscritto descrive un sistema modello ex vivo composto da terreni condizionati da organi derivati dal linfonodo, dalle ossa, dai polmoni e dal cervello dei topi. Questo sistema modello può essere utilizzato per identificare e studiare fattori solubili derivati da organi e i loro effetti sul tropismo degli organi e sul comportamento metastatico delle cellule tumorali.

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Le cellule tumorali vengono incorporate in un gel di collagene e poi inserite in un gel di fibrina acellulare per generare un sistema di coltura 3D in cui l'invasività e la formazione di tumori satelliti possono essere monitorate.

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Questo protocollo sperimentale descrive l'isolamento dei BCSC da campioni di cellule e tessuti di cancro al seno, nonché i saggi in vitro e in vivo che possono essere utilizzati per valutare il fenotipo e la funzione del BCSC.

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C'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D che catturino il crosstalk eterocellulare per studiare le metastasi del cancro. Il nostro studio presenta la generazione di epiteliali stromali eteromulticellulari in un ambiente privo di scaffold e scaffold che può essere utilizzato per studiare l'invasione e le distribuzioni spaziali cellulari.

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Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico (Video) | JoVE Journal

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

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