Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Lo scopo di questa procedura è studiare la proliferazione, la colonizzazione e la migrazione delle cellule del carcinoma mammario in un modello sperimentale di tessuto osseo umano. Questo viene ottenuto isolando frammenti di tessuto osseo trabecolare da campioni chirurgici della testa del femore e coltivandoli con cellule del carcinoma mammario che esprimono luciferasi e proteina fluorescente verde. L'imaging bioluminescente viene utilizzato per misurare la proliferazione cellulare e verificare la colonizzazione delle cellule del carcinoma mammario nei frammenti di tessuto osseo.

I modelli di colonizzazione delle cellule del cancro al seno vengono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Il compartimento midollare può essere lavato dai frammenti ed analizzato mediante citometria a flusso, saggi di luminescenza e colorazione. La migrazione delle cellule del cancro al seno verso colture tessutali, supernatanti e frammenti di tessuto osseo viene misurata in camere di migrazione Transwell con imaging bioluminescente. L'osso rappresenta il sito più frequente di metastasi del cancro al seno e, in definitiva, questo modello fornisce una nuova finestra per lo studio delle cellule del cancro al seno all'interno della nicchia metastatica ossea.

Un grande vantaggio di questo modello è che fornisce un accesso diretto al microambiente di frammenti di tessuto osseo umano, permettendoci di osservare e analizzare facilmente il comportamento delle cellule del cancro al seno durante esperimenti di co-coltura a breve termine. Questo metodo può essere utilizzato per studiare questioni fondamentali sui meccanismi alla base del cancro al seno e delle metastasi ossee, con l'obiettivo di identificare strategie terapeutiche efficaci per prevenire e trattare questa patologia. Sebbene questo modello possa fornire informazioni sulle metastasi del cancro al seno, può anche essere impiegato per studiare altre neoplasie con tropismo osseo, come il cancro alla prostata.

È necessario raccogliere frammenti di tessuto osseo in diversi punti durante ogni saggio. Questa procedura inizia con il prelievo e il trasporto di un campione femorale in soluzione salina e con la preparazione della postazione di lavoro all'interno di una cappa a sicurezza biologica indossando un guanto chirurgico. Afferrare la testa del femore con una mano e utilizzare uno strumento chirurgico per estrarre l'osso trabecolare.

I frammenti hanno una dimensione di circa due-cinque millimetri. Le pinzette non sono adatte per questo passaggio. È necessario un bisturi chirurgico di buona qualità.

Per questo esperimento, preparare una sospensione di cellule tumorali del seno con 100.000 cellule per 50 microlitri di DMEM aggiungendo il 10% di FBS. Inoltre, preparare tappi di cera ossea per mobilizzare i frammenti ossei utilizzando le estremità tagliate di una punta per micropipetta, conservare i tappi in una piastra di Petri. Quindi, con una pinzetta, trasferire i tappi in una piastra a sei pozzetti e, utilizzando un guanto sterile, premere i tappi nella posizione delle 12.

Successivamente, pipettare 50 microlitri della sospensione cellulare al centro di ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari per 45 minuti per favorire l'adesione cellulare; mentre la piastra è in incubazione, estrarre i frammenti ossei con le cellule aderenti alla piastra. Posizionare un frammento di tessuto osseo sulla cera per ossa in tre pozzetti e premere delicatamente ciascuno usando il GER; i tre pozzetti senza frammenti serviranno da controlli.

Successivamente, aggiungere lentamente cinque millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS alla parete di ciascun pozzetto. La cera ossea e i frammenti ossei non devono essere spostati. Quindi coltivare la cultura per 20-24 ore.

Il giorno successivo, acquisire prima di tutto le immagini delle cellule. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ogni pozzetto, quindi acquisire immediatamente le immagini della piastra mediante una piattaforma di imaging Ivis. Questo esperimento richiede una sospensione di cellule di carcinoma mammario simile a quella utilizzata in precedenza.

Dopo aver estratto i frammenti ossei, utilizzare pinzette per trasferire ciascun frammento in una pozzetta vuota di una piastra a 24 pozzetti, quindi pipettare 50 microlitri di sospensione cellulare direttamente su ciascun frammento osseo e trasferire la piastra in un incubatore per 45 minuti per favorire l'adesione cellulare. Una volta che le cellule si sono attaccate, aggiungere delicatamente da uno a due millilitri di mezzo in ciascuna pozzetta, in quantità sufficiente a immergere il frammento osseo. Successivamente, posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 20-24 ore.

In previsione dell'imaging Ivis, dell'imaging della fluorescenza o del prelievo di cellule midollari per l'analisi mediante imaging Ivis, trasferire i frammenti ossei in una piastra a 24 pozzetti con un millilitro di mezzo fresco per ogni pozzetto. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ogni pozzetto e procedere come descritto in precedenza per la microscopia a fluorescenza. Pipettare cinque microlitri di soluzione fluorescente di etichettatura con bisfosfonato in ogni pozzetto per marcare le spicole ossee del frammento osseo e incubare la piastra per ulteriori 24 ore.

24 ore dopo, utilizzare pinzette per trasferire i frammenti in piastre contenenti mezzo privo di rosso fenolo. Quindi osservare le piastre mediante un microscopio a fluorescenza impostato per l’immagine a 485 nanometri per localizzare le cellule tumorali del seno che esprimono GFP e a 680 nanometri per identificare le spicole ossee marcate con bisfosfato, quindi lavare il compartimento del midollo osseo per l’analisi del numero di cellule o delle loro proprietà.

Trasferire un frammento in un filtro da 70 micron posizionato sopra un tubo da 50 millilitri. Quindi utilizzare una siringa da 10 millilitri con un ago da 25 gauge per lavare vigorosamente il frammento con 10 millilitri di PBS. Centrifugare la sospensione a 300 ×g per tre minuti a temperatura ambiente per formare il pellet cellulare, aspirare e scartare il soprannatante.

Piegare il pellet di cellule del midollo in PBS o in altre soluzioni desiderate per analisi mediante citometria a flusso o per saggi di vitalità. Iniziare generando una rete di tessuto osseo. Posizionare i frammenti ossei nei pozzetti di una piastra a 12.

Piastra a pozzetti contenente 2,2 millilitri di DMEM con 10% FBS per pozzetto, lasciando alcuni pozzetti di controllo senza frammenti ossei. Coltivare la piastra per 24 ore. Successivamente, aspirare e sostituire il mezzo, quindi proseguire la coltura per altre 24 ore; a 48 ore dalla coltura, trasferire 0,9 millilitri di surnatante in una piastra ricevente, incubando temporaneamente la piastra ricevente.

Posizionare gli inserti transwell in una piastra a 24 pozzetti vuota. Quindi seminare 100.000 cellule di carcinoma mammario in 350 microlitri su ciascun inserto. Successivamente, coltivare le piastre per 45 minuti per favorire l'adesione cellulare. Dopo 45 minuti, utilizzare pinzette per trasferire gli inserti in una piastra ricevente.

Assicurarsi di posizionare gli inserti con un angolo rispetto al ricevitore. Supinare bene in modo da evitare la formazione di bolle. Quindi incubare la piastra con gli inserti per 20 ore a 37 gradi Celsius il giorno successivo.

Utilizzare pinzette per rimuovere gli inserti e aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ciascun pozzetto. Eseguire l'immagine di bioluminescenza sulla piastra ricevente per rilevare le cellule tumorali del seno che hanno migrato attraverso le membrane e si sono attaccate al fondo dei pozzetti della piastra ricevente. Per prima cosa, caricare una piastra ricevente con mezzo e posizionarla nell'incubatore per colture cellulari.

Per seminare gli inserti, capovolgerli in una scatola vuota per provette microfuse con coperchio. Quindi aggiungere 100.000 cellule in 50 microlitri sulla superficie esterna inferiore della membrana di ciascun inserto.

Coprire la scatola lasciando il coperchio leggermente aperto e incubare i dispositivi per 45 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Successivamente, utilizzare pinze per capovolgere e trasferire i dispositivi, posizionando le pozze di una piastra ricevente all'interno di ogni coppa del dispositivo con 0,45 millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS. Quindi aggiungere un frammento osseo di tre millimetri o una perlina di vetro in ciascun dispositivo e coltivare per 20 ore.

Il giorno successivo utilizzare pinzette per trasferire i frammenti e le perle in una piastra con pozzetti contenenti un millilitro di mezzo fresco. Aggiungere 300 microgrammi per millilitro di Lucifer in ogni pozzetto e procedere con l'acquisizione di immagini di bioluminescenza. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Cellule tumorali del seno sono state coltivate in co-coltura adiacenti a frammenti ossei immobilizzati per misurare la proliferazione delle cellule mammarie. L'immagine bioluminescente dopo 24 ore di coltura ha mostrato un aumento della proliferazione delle cellule tumorali del seno in presenza di frammenti ossei nei tre pozzetti superiori rispetto all'assenza di frammenti ossei nei tre pozzetti inferiori. I risultati degli esperimenti condotti utilizzando frammenti provenienti da tre diversi campioni chirurgici hanno evidenziato una proliferazione maggiore in presenza rispetto all'assenza di osso.

In tutti e tre i casi, è stata osservata mediante imaging bioluminescente, dopo 24 ore, la colonizzazione delle cellule MCF seven F Luke EGFP posizionate direttamente al di sotto di frammenti di tessuto osseo. Un segnale ridotto è stato associato alla diminuzione della densità di semina dopo 48 ore. Frammenti seminati direttamente e marcati con un reagente bifosfonato hanno rivelato la colonizzazione delle cellule tumorali del seno positive per GFP all'interno dei compartimenti mineralizzati e del midollo.

La migrazione delle cellule tumorali del seno attraverso la membrana porosa verso la coltura di tessuto osseo, evidenziata nei tre pozzetti superiori, è risultata robusta rispetto alla migrazione verso il controllo. Mezzo visibile nei tre pozzetti inferiori. È stata inoltre osservata la migrazione verso tre frammenti ossei provenienti da un singolo campione di THR, mentre non è stata osservata alcuna migrazione sulle perle.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre frammenti di tessuto osseo umano da un campione di testa del femore e avviare saggi di co-coltura per misurare i comportamenti delle cellule tumorali del seno, inclusi migrazione, colonizzazione e proliferazione.