Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare i passaggi necessari per eseguire un'analisi elettrografica su pesci zebra larvali. Questo viene realizzato innanzitutto generando micro pipette di vetro con la forma e le dimensioni adeguate. Il secondo passaggio consiste nel configurare con attenzione l'attrezzatura fondamentale per l'esperimento, come gli elettrodi di riferimento e di registrazione.

Successivamente, il pesce zebra larvale viene anestetizzato e correttamente orientato rispetto all'apparecchiatura di stimolazione e registrazione. L'ultimo passaggio consiste nel posizionamento accurato dell'elettrodo microscopico in vetro sulla cornea del pesce zebra larvale. In definitiva, pesce zebra larvale.

L'analisi ERG è utile per studiare la funzione visiva dei coni nella retina di vertebrati completamente dotati di coni, in vivo. Questo metodo è molto utile per rispondere a domande fondamentali nel campo della scienza della visione, come l'identificazione delle vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e all'adattamento alla luce nei coni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il posizionamento corretto dell'elettrodo microscopico di registrazione sul campione è difficile da apprendere a causa delle piccole dimensioni dell'occhio del pesce zebra larvale.

Per iniziare questa procedura, preparare diverse micropipette utilizzando capillari in vetro borosilicato con filamento, tirati a fiamma. Controllare ogni micropipetta al microscopio con un righello graduato appropriato per assicurarsi che il diametro della punta sia compreso tra 10 e 15 micrometri e che l'aspetto sia uniforme. Preparare una soluzione di lavoro nel giorno dell'esperimento diluendo una soluzione ringer 10x a 1x.

Con un filtro per acqua distillata deionizzata, sterilizzare la soluzione per assicurare che le particelle non ostruiscano la punta della micropipetta. Successivamente ossigenare con una miscela di 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per 10 minuti. Chiudere ermeticamente la soluzione subito dopo per garantire che rimanga ossigenata.

Ora posizionare una piattaforma mobile in plastica con un fondo in polimero di uretano viscoelastico assorbente degli urti sul tavolo antivibrazioni al di sotto della sorgente luminosa. Successivamente, posizionare la telecamera con un supporto magnetizzato e puntarla verso la piattaforma mobile in plastica. Quindi, posizionare il micromanipolatore dell'elettrodo di registrazione su un secondo supporto magnetizzato.

Assicurarsi che la telecamera e il micromanipolatore non vengano disturbati dal movimento di altri apparecchi e che non ostacolino l'illuminazione proveniente dalla sorgente luminosa. Successivamente, collegare la telecamera a un monitor video e posizionarla verso la piattaforma. Verificare che l'allestimento sia correttamente messo a terra con un filo di rame.

In questo passaggio, tagliare un piccolo rettangolo di spugna di PVA secca che si adatti perfettamente a una piastra di Petri da 35 millimetri utilizzando una lametta pulita. Effettuare un taglio aggiuntivo nella spugna per alloggiare l'elettrodo di riferimento. Quindi utilizzare un pennarello resistente ai prodotti chimici per segnare un puntino sullo spugna nel punto in cui verrà posizionata la larva.

Successivamente, immergere la spugna di PVA nella soluzione di Ringer fino a completa saturazione. Rimuoverla e asciugarla rapidamente su un tovagliolo di carta due o tre volte prima di posizionarla in una piastra di Petri pulita da 35 millimetri. Successivamente, posizionare la piastra di Petri contenente la spugna su una piattaforma di plastica in modo che il segno possa essere visualizzato dalla telecamera.

Successivamente, clorurare gli elettrodi immergendoli in una soluzione di cloruro di sodio al 6-9%. Quindi asciugarli all'aria su un fazzoletto Kim per cinque minuti. Posizionare il pellet di argento, cloruro d'argento dell'elettrodo di riferimento all'interno o sotto la spugna, a seconda dello stile dell'incisione effettuata, e collegare il cavo dell'elettrodo di riferimento al sistema di registrazione.

Successivamente, collegare circa 40 centimetri di tubo a una siringa da cinque millilitri senza blocco a baionetta e riempire la siringa con soluzione di Ringer. In seguito, riempire una siringa da un millilitro senza blocco a baionetta con soluzione di Ringer. Utilizzando un microfill, riempire con attenzione il porta microelettrodo ed evitare la formazione di bolle d'aria.

Quindi collegare la siringa da cinque millilitri al portello di pressione del supporto per microelettrodi mediante un tubicino, utilizzando il microfill e una siringa da un millilitro riempita con soluzione di Ringer. Riempire la micropipetta di vetro a partire dalla punta e assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Successivamente, collegare la micropipetta di vetro al supporto per microelettrodi avendo cura di mantenere il filo dell'elettrodo perfettamente dritto.

Dopo averlo fissato, utilizzare la siringa da cinque millilitri per spingere con attenzione la soluzione di Ringer attraverso il microelettrodo fino a quando una piccola quantità di soluzione diventa visibile sulla punta. Posizionare ora con cura il microelettrodo di registrazione nel micromanipolatore e collegare il cavo al sistema di registrazione per verificare il rumore di fondo del sistema. Posizionare l'elettrodo di riferimento e la punta del microelettrodo di registrazione in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con soluzione di Ringer.

Verificare i livelli di rumore elettrico dell'allestimento mediante un oscilloscopio o una funzione integrata dell'apparecchiatura per ERG. I livelli di rumore non devono superare più o meno 10 microvolt rispetto alla linea di base. In questo procedimento, tagliare diversi quadrati di carta da cucina di un centimetro quadrato, anestetizzare da tre a cinque larve in una piastra di Petri da 35 millimetri aggiungendo trica a una concentrazione finale dello 0,02% e attendendo da uno a due minuti.

Successivamente, trasferire con attenzione un singolo larva su un quadratino di carta da filtro sotto una stereomicroscopio con illuminazione minima. Verificare la posizione della larva scegliendone una con il lato dorsale rivolto verso l'alto e con l'occhio occluso per sessioni di registrazione che durano più di 30 minuti. Mantenere la larva umida applicando sulla superficie del corpo il 3% di metilcellulosa mediante un pennello fine in pelo di cammello.

Quindi trasferire il quadratino di carta da cucina con la larva sulla spugna in PVA umida. Successivamente, applicare un flusso continuo di acqua satura di ossigeno al 100% sulle larve facendo gorgogliare il gas attraverso un pietrisco poroso in un pallone laterale contenente acqua distillata. Posizionare l'ossigeno umidificato proveniente dal braccio laterale del pallone vicino alla testa della larva mediante un tubo, in condizioni di illuminazione minima.

Utilizzare il micromanipolatore e la telecamera per posizionare la punta del microelettrodo nel punto medio tra le estremità nasale e temporale dell'occhio e premere delicatamente sul limite dorsale della cornea. Lasciare che le larve si adattino al buio per cinque-dieci minuti. Quindi registrare le risposte allo stimolo luminoso fornito da una sorgente luminosa a LED o da un stimolatore ottico.

Questa figura mostra un tipico tracciato di ERG in un pesce zebra larvale di cinque giorni post-fecondazione. I pesci adattati al buio sono stati esposti a luce bianca LED per 20 millisecondi con intensità comprese tra 1 e 5.000 candele per metro quadrato, con l'inizio dello stimolo luminoso al secondo zero. Il potenziale negativo dell'onda a è difficile da distinguere, mentre il potenziale positivo dell'onda b rappresenta il picco dominante del tracciato.

Questo riquadro mostra le ampiezze medie della risposta dell'onda B, adattate utilizzando l'equazione di Naka-Rushton. Questa figura mostra un tipico tracciato di ERG in un pesce zebra larvale di cinque giorni post-fecondazione (DPF), adattato al buio e trattato con PB. I pesci sono esposti a luce bianca LED per 20 millisecondi con intensità comprese tra 1 e 5.000 candele per metro quadrato, e il potenziale recettoriale massimo dei coni isolati rappresenta l'elemento dominante della forma d'onda. Questo riquadro mostra le ampiezze medie della risposta di un pesce zebra larvale trattato con PB, adattate utilizzando l'equazione di Naka-Rushton.

Questa figura mostra un tipico tracciato di ERG in un pesce zebra larvale trattato con cinque D-P-F-A-P-B. Utilizzando un paradigma a doppio flash. I pesci adattati al buio sono esposti a una successione di luce bianca della durata di 20 millisecondi.

I LED lampeggiano con un'intensità di 1000 canula per metro quadrato e l'ISI tra i lampeggi è di due secondi. Qui viene indicato l'inizio di ogni stimolo luminoso. Questa figura mostra il rapporto tra la risposta massima del potenziale recettoriale del cono isolato allo stimolo secondario e quella allo stimolo iniziale, al crescere dell'ISI, il che indica il recupero progressivo della sensibilità dei fotoricettori.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la qualità delle registrazioni dipende dall'integrità della connessione tra l'elettrodo e la cornea e dallo stato di salute delle larve. Lo sviluppo di questa tecnica ha notevolmente migliorato la capacità dei ricercatori nel campo delle scienze della visione di studiare l'adattamento e il recupero dei coni nella retina dei vertebrati in vivo.