Name: Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Scopri l'analisi elettroretinografica della funzione visiva in larve di zebrafish con tecniche di micromanipolazione. Questo metodo permette di studiare la risposta dei coni in vivo.

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Ringraziamo i membri dell'impianto di acquacoltura UNC Zebrafish per la manutenzione del pesce zebra. Vorremmo anche ringraziare Diagnosys, LLC per l'assistenza con la configurazione dell'apparato ERG. Ulteriori ringraziamenti vanno alla dottoressa Portia McCoy e al laboratorio del dottor Ben Philpot per l'assistenza con i metodi elettrofisiologici. Desideriamo anche ringraziare Lizzy Griffiths per la sua illustrazione di una larva di pesce zebra. Questo lavoro è stato sostenuto dai premi F32 EY022279 del National Institutes of Health (a J.D.C) e R21 EY019758 (a E.R.W).

Mantenimento degli animali e protocolli sperimentali sono stati approvati dalla cura e utilizzo dei Comitati animali istituzionale della University of North Carolina a Chapel Hill, e soddisfano tutte le esigenze dell&#39;Ufficio NIH di laboratorio Animal Welfare e l&#39;Associazione per la valutazione e l&#39;accreditamento del laboratorio Animal Care International. NOTA: Per ottenere le larve di analisi ERG, pubblicato protocolli per la zootecnia zebrafish norma e manutenzione sono stati impiegati 18. Le larve sono ottenuti attraverso l&#39;allevamento naturale e ospitato sotto una luce 14 ore / 10 ore ciclo scuro. Questo protocollo è stato ottimizzato per le larve in 5-7 giorni dopo la fecondazione (DPF), ma potrebbe essere idealmente eseguite sul pesce più vecchio con piccole modifiche alla procedura. Qui, utilizzare il ceppo TL di wild-type larve di zebrafish a 5 dpf. 1. Micropipetta Produzione <ol><li> Tirare diversi micropipette con 1,5 x 0,86 millimetri (diametro esterno da diametro interno) capillari in vetro borosilicato fuoco lucido confilamento (temperatura di fusione, 821 ° C) e un P-97 Flaming / Brown Micropipetta Estrattore dotato di filamento calore scatola. Utilizzare il programma per modellare micropipette descritti nella tabella 1. </li><li> Controllare ogni micropipetta al microscopio con un appropriato righello reticolo per garantire che suggerimenti sono di 10-15 micron di diametro ed ha un&#39;apertura punta liscia (cioè, senza bordi frastagliati). </li><li> Conservare con cura micropipette per evitare danni punta e l&#39;esposizione alla polvere. Le opzioni di memorizzazione includono piastre di Petri con del nastro di laboratorio, scatole di schiuma rivestita, o contenitori micropipetta disponibili in commercio. NOTA: Altri estrattori micropipetta di vetro e capillari possono essere usati fino a quando il corretto diametro della micropipetta e una punta di alta qualità è ottenuta. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Pressione </td><td> Calore </td><td> Tirare </td><td> Velocità </td&gt; <td> Tempo </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Programma per la produzione di micropipette con un P-97 Flaming / marrone Micropipetta Estrattore dotato di un filamento di calore casella micropipette sono realizzati con 1,5 x 1,0 mm 2 (diametro esterno dal diametro interno) capillari di vetro borosilicato ribruciate con filamento. (temperatura di fusione, 821 ° C). 2. Buffer Preparazione <ol><li> Utilizzare filtrato, tampone ossigenato pesci rossi di Ringer 19 nella microelettrodo capillare e saturare la spugna alcool polivinilico (PVA) su cui le larve sono collocati per esperimenti. In alternativa, utilizzare E3<html> supporti embrione o soluzione salina bilanciata di Hank. </li><li> Preparare la soluzione 10x pesci rossi di Ringer, come descritto nella Tabella 2. Regolare a pH 7,8, e sterilizzare utilizzando un filtro 0,22 micron e conservare lo stock 10x a 4 ° C. </li><li> Creare una soluzione di lavoro il giorno dell&#39;esperimento diluendo la soluzione di Ringer 10x a 1x con deionizzata, acqua distillata. Filtrare su un filtro di 0,22 micron. Ossigenare insufflando 95% O 2/5% CO 2 gas per 10 minuti. Cap strettamente seguito per garantire che la soluzione rimane ossigenato. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 MM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 MM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tabella 2: Preparazione della soluzione di 10x pesci rossi di Ringer. 3. Elettroretinogramma Platform <ol><li> Eseguire esperimenti ERG su un tavolo antivibrante all&#39;interno di una gabbia di Faraday per migliorare il rapporto segnale-rumore. Allegare una piattaforma in acciaio personalizzato al tavolo anti-vibrazioni con dadi esagonali. Inserire una piattaforma mobile di plastica con un polimero uretanico ammortizzante inferiore viscoelastico sul tavolo sotto la sorgente luminosa. </li><li> Posizionare la fotocamera con uno stand magnetizzato, volto giù alla piattaforma mobile di plastica. Posizionare il micromanipolatore (che eserciterà la microelettrodo registrazione) con un secondo supporto magnetizzato alla destra della piattaforma mobile di plastica. Assicurarsi che la fotocamera e micromanipolatore non saranno disturbati dal movimento di altre apparecchiature e che non blocchino illuminazione dalla sorgente luminosa. </li><li> Collegare la fotocamera a un monitor video e posizionarla per visualizzare l&#39;occhio dellarva per collocare l&#39;elettrodo nella posizione corretta. </li><li> Assicurarsi che l&#39;impostazione sia collegato a terra con filo di rame. Per controllare il rumore, collocare l&#39;elettrodo di riferimento e punta del microelettrodo registrazione in una piastra di Petri 35 millimetri riempito con soluzione di Ringer. Controllare i livelli di rumore elettrici della configurazione con un oscilloscopio o una funzione incorporata dell&#39;apparato ERG. I livelli di rumore dovrebbero essere non più di ± 10 mV dal basale. </li></ol> 4. Sponge Preparazione <ol><li> Tagliare un piccolo rettangolo di spugna PVA secca che si inserisce perfettamente in una capsula di Petri da 35 mm. Lo spessore della spugna non deve essere maggiore della profondità del piatto. Usare un taglierino con una lama di rasoio pulito per il taglio. </li><li> Effettuare un taglio aggiuntivo nella spugna per accogliere l&#39;elettrodo di riferimento (un taglio superficiale longitudinale sul fondo della spugna o una farfalla tagliato verticalmente attraverso una delle estremità inferiori). </li><li> Utilizzare un marcatore resistente agli agenti chimiciper contrassegnare un puntino sulla spugna (dove verrà posizionata la larva) che può essere utilizzato per il posizionamento della telecamera. </li><li> Immergere la spugna PVA in soluzione di Ringer fino a saturazione. Rimuovere e asciugare rapidamente su un tovagliolo di carta 2-3 volte. Posizionare la spugna in un ambiente pulito 35 millimetri piastra di Petri. </li><li> Posizionare il piatto Petri contenente la spugna sulla piattaforma di plastica in modo che il marchio può essere visualizzata dalla telecamera. </li></ol> 5. elettrodi Preparazione NOTA: La configurazione zebrafish è costituito da un elettrodo di riferimento in contatto con la soluzione satura di PVA spugna del Ringer e un elettrodo di registrazione a contatto con la cornea. L&#39;elettrodo di riferimento costituito da un pellet Ag / AgCl. L&#39;elettrodo di registrazione è una micropipetta di vetro tirato riempito con soluzione di Ringer e tenuto da un supporto microelettrodo contenente un filo di Ag. <ol><li> Cloruro gli elettrodi, mettetelo a bagno in 6-9 ipoclorito% di sodio (candeggina) per 5 min (il MICR registrazioneoelectrode fili) o 15 minuti (l&#39;elettrodo di riferimento). Aria secca su un Kimwipe per 5 min. <ol><li> A seconda dello stile di taglio effettuato nel passo 4.2, posizionare il pellet Ag / AgCl dell&#39;elettrodo di riferimento in (per la farfalla taglio verticale) o sotto (per il taglio superficiale longitudinalmente sul fondo) la spugna. Attaccare il cavo elettrodo di riferimento al sistema di registrazione. </li><li> In alternativa, se l&#39;impostazione ERG ha vincoli di spazio o ci sono particolarmente forti artefatti fotovoltaici dall&#39;elettrodo Ag / AgCl, collegare l&#39;elettrodo di riferimento sulla spugna attraverso un ponte salino agar per spostare l&#39;elettrodo dal percorso ottico. </li></ol></li><li> Attaccare ~ 40 cm di tubo di dimensioni appropriate per una siringa da 5 ml di blocco non-Luer. Riempire la siringa con soluzione di Ringer. Titolari di microelettrodi possesso prese di pressione vengono spediti con adattatori per ospitare tubi con diametri interni di 1/16 &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;o 5/32&quot;. </li><li> Riempire un 1 ml non Luer Siringa serratura conSoluzione di Ringer e, utilizzando un Micro-fil, riempire accuratamente il supporto microelettrodo. Evitare la formazione di bolle. </li><li> Attaccare la siringa da 5 ml di porta di pressione del titolare microelettrodo con tubi e utilizzarla per garantire che il titolare microelettrodo è pieno di soluzione di Ringer. Utilizzando il Micro-fil e la siringa da 1 ml riempita con soluzione di Ringer, riempire il bicchiere micropipetta dalla punta e accertarsi che non siano presenti bolle. </li><li> Fissare la micropipetta di vetro al titolare microelettrodo, facendo attenzione a mantenere il dritto filo elettrodo. Una volta fissato, utilizzare la siringa 5 ml di forzare accuratamente soluzione di Ringer attraverso il microelettrodo fino ad una piccola quantità di soluzione è visibile sulla punta. Applicazione occasionale della pressione alla siringa (quando non è applicata alla cornea) impedirà la formazione di bolle d&#39;aria, nonché occlusioni dovute alla polvere o accumulo di sali, nella punta micropipetta. <ol><li> Se la soluzione viene fuori come un flusso, sostituire la gmicropipetta lass, come l&#39;apertura punta è troppo grande o è danneggiato. </li></ol></li><li> Posizionare con cura il microelettrodo registrazione nel micromanipolatore e collegare il cavo al sistema di registrazione. </li></ol> 6. Analisi Elettroretinogramma NOTA: A causa del predominio cono della retina larvale, risultati di ERG di alta qualità possono essere ottenuti quando i preparativi per la registrazione vengono eseguite sotto bassi livelli di luce bianca indiretta (&lt;1 lux) o con brevi periodi (&lt;1 min) di maggiore intensità ( ≤250 lux) Luce di lavoro. È quindi richiesto un breve periodo di adattamento al buio prima della registrazione (vedere il passaggio 6.7). Tuttavia, gli esperimenti possono essere eseguiti in fioca luce rossa o infrarossa utilizzando una telecamera a raggi infrarossi sensibile. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in (0,22 micron) di acqua sistema di filtraggio-sterilizzato dal Fondo UNC Zebrafish acquacoltura, i media alternativi di embrioni possono essere utilizzati. <ol><li> Tagliare asciugamani di carta quadrato di misura di circa 1cm 2. </li><li> Se misurazione isolato potenziale recettore massa cono, incubare 3-5 larve in acqua sistema con 500 pM (±) -2-Amino-4-fosfonobutirrico acido (APB) per 5 min. NOTA: Mentre APB è una miscela racemica di attivo (L) e inattive (R) forme di AP4, è efficace come L-AP4 ed è meno costoso. </li><li> Anestetizzare 3-5 larve in acqua sistema con 0,02% (w / v) Tricaine fino risponde, circa 1-2 min. </li><li> Utilizzare una pompa pipetta e pipetta Pasteur per trasferire con attenzione larve individuale su carta assorbente quadrati sotto uno stereoscopio dissezione con illuminazione minima (≤250 lux per &lt;1 min). Controllare la posizione di ogni larva e scegliere un candidato che è dorsale verso l&#39;alto con un occhio non occluse. <ol><li> Per le registrazioni estese (&gt; 30 min), mantenere la larva umido dal vetro il corpo fino a, ma non compresa la testa con 3% metilcellulosa con un pennello fine di peli di cammello. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze, trasferire il tovagliolo di carta piae con la larva alla spugna umida PVA. <ol><li> Per le registrazioni estese (&gt; 30 min), applicare un flusso continuo di saturo d&#39;acqua 100% O 2 gas sopra la larva facendo gorgogliare il gas attraverso una pietra porosa in un pallone braccio laterale contenente acqua distillata. Posizionare il tubo uscita dal braccio laterale pallone che convoglia l&#39;ossigeno umidificato vicino alla testa del larva. NOTA: Passo 6.4.1 e 6.5.1 passo sarà prolungare la vita dei pesci 16. </li></ol></li><li> Sotto illuminazione minima, utilizzare il micromanipolatore e fotocamera per posizionare la punta microelettrodo a metà tra il nasale e le estremità caudale dell&#39;occhio e premere delicatamente sul limite dorsale della cornea. NOTA: smarrimento della punta dell&#39;elettrodo alle zone distali lontano della cornea può provocare ERG forme d&#39;onda di polarità invertita. </li><li> Lasciare larva di dark-adattamento per 5-10 min. </li><li> Registra le risposte di prova in flash per luce fornita da una sorgente luminosa a LED o stimolatore ottico utilizzando il Available stimolazione e registrazione attrezzature. Regolare i parametri del protocollo come l&#39;intensità del flash, lunghezza flash, il colore del flash, l&#39;intensità e il colore di sfondo e filtro impostazioni per adattarsi l&#39;esperimento. </li><li> Al termine con l&#39;esperimento, eutanasia larve secondo le linee guida AVMA / IACUC. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo protocollo una procedura semplice per ERG registrazioni di zebrafish larvale è dettagliata. Questa procedura consente una analisi rapida e completa di function.There visiva sono diversi passaggi critici della procedura che dovrebbe essere tenuto in considerazione. Le larve zebrafish deve essere in buona salute prima dell&#39;esperimento per evitare la morte durante i potenziali trattamenti farmacologici e garantire il sostentamento prolungata durante le registrazioni ERG. Inoltre, è importante che le larve uti...

L&#39;elettroretinogramma (ERG) è un metodo elettrofisiologico invasivo che è stato ampiamente utilizzato in clinica per determinare la funzione della retina nell&#39;uomo. L&#39;attività elettrica in risposta ad uno stimolo luce viene misurata ponendo elettrodi di registrazione sulla superficie esterna della cornea. Le caratteristiche del paradigma stimolo e la forma d&#39;onda di risposta definiscono i neuroni retinici contribuiscono alla risposta. Questo metodo è stato adattato per l&#39;uso con un certo numero di modelli animali tra cui topi e zebrafish. La tipica risposta vertebrati ERG ha quattro componenti principali: l&#39;a-onda, che è un potenziale cornea-negative derivanti dall&#39;attività cellule fotorecettori; la b-wave, un potenziale positivo cornea derivato dal ON cellule bipolari; d-onda, un potenziale positivo cornea interpretato come l&#39;attività delle cellule bipolari OFF; e il c-onda, che si verifica alcuni secondi dopo la b-wave e riflette l&#39;attività in Müller glia e il retinale pigmento epitelio 1-4. Ulteriori riferimenti per la comprensione della storia e dei principi di analisi ERG negli esseri umani e modelli animali sono il libro di testo on line, WebVision, presso la University of Utah e testi, come i Principi e Pratica di Elettrofisiologia clinica di Vision 4, 5. Danio rerio (zebrafish) è stato a lungo favorita come un modello di sviluppo dei vertebrati, a causa della sua rapida maturazione e trasparenza, che permette l&#39;analisi morfologica non invasiva dei sistemi d&#39;organo, test comportamentali e sia in avanti e retromarcia schermi genetici (per la revisione, vedi Fadool e Dowling 6). Larve Zebrafish sono altamente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica, che, accoppiato con la loro alta fecondità, loro un ottimo modello animale per le analisi biologiche high-throughput fare. Il più alto rapporto di coni di canne in zebrafish larvale - circa 1: 1 rispetto ai topi (~ 3% a conos) - renderli particolarmente utile per lo studio della funzione cono 7-9. Nella retina dei vertebrati, coni sviluppano prima di aste 10. È interessante notare che, coni zebrafish sono operativi già dal 4 dpf, consentendo selettiva analisi elettrofisiologiche di coni in quella fase 6, 11,12. Al contrario, le risposte ERG a barre compaiono tra 11 e 21 dpf 13. Pertanto, larve di zebrafish 4-7 dpf servire funzionalmente come retina all-cono. Tuttavia, il nativo fotopico risposta ERG di 4-7 dpf larve è dominato dalla b-wave. Applicazione di agenti farmacologici, quali L - (+) - 2-ammino-4-fosfono-butirrico (L-AP4), un agonista per il glutammato metabotropici (mGluR6) recettore espresso dalla ON cellule bipolari, blocca efficacemente la generazione del B-wave e rivela il potenziale isolato massa cono recettore, (la &quot;a-wave&quot;) 14-17. Qui si descrive un semplice e reliablMetodo e per l&#39;analisi ERG utilizzando disponibili in commercio apparecchiature ERG progettato per l&#39;utilizzo con i topi che sono stati concepiti per essere utilizzati con le larve di zebrafish. Questo sistema può essere utilizzato su larve zebrafish di varia background genetici, così come quelli trattati con agenti farmacologici, per aiutare i ricercatori nella identificazione di vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e adattamento alla luce 16. Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo guideranno gli investigatori in uso dell&#39;analisi ERG per rispondere a una serie di domande biologiche relative alla visione, e dimostrare la costruzione di una configurazione flessibile, ERG.

<table><tbody><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td>80/20 Inc</td><td>"Set di erettori industriali" in alluminio progettato su misura per la struttura della gabbia</td><td></td></tr><tr><td>Spugna PVA</td><td>Amazon</td><td>B000ZOWG1C</td><td>Fornisce una piattaforma morbida e umida per il posizionamento di larve di pesce zebra Sistemi di</td></tr><tr><td>filtraggio sterili da 150 ml</td> Soluzioni filtranti <td>Corning</td><td>431154</td><td>Soluzioni filtranti per evitare che piccole articolazioni blocchino le micropipette</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Sistema</td><td></td><td>modulare di elettrofisiologia in grado di generare stimoli visivi per qualsiasi stimolatore e registrazione e analisi digitale delle risposte utilizzando software proprietario, maggiori informazioni su</td></tr><tr><td>Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>contact</td><td>Stimolatore di luce con LED RGB e sorgenti luminose allo xeno per Ganzfeld ERG, maggiori informazioni su http://www.diagnosysllc.com http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>Mantenimento e posizionamento del microelettrodo di registrazione</td></tr><tr><td>Supporto ad anello magnetico</td><td>Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>Mantenimento e posizionamento della telecamera e dell'elettrodo di riferimento</td></tr><tr><td>Prolunghe dei cavi</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>Cavi di ricambio da femmina a maschio da 1,5 mm per il collegamento degli elettrodi</td></tr><tr><td>Pin maschio a femmina Adattatore SAFELEAD Grass</td><td>Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>Collegamento di perni da 2 mm a perni da 1,5 per testiera</td></tr><tr><td>Telaio della zanzariera della finestra (metallo) e scanalatura</td><td>Lowes o Home Depot</td><td>vari</td><td>Per il fissaggio di una rete di rame alla struttura della gabbia di Faraday</td></tr><tr><td>Filtri Steriflip da 50 ml</td><td>SCGP00525 Millipore</td><td></td><td>Soluzioni filtranti per evitare che piccole articolazioni blocchino le micropipette</td></tr><tr><td>Adattatore BNC</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>Collegamento della telecamera al cavo BNC</td></tr><tr><td>Cavo BNC</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>Collegamento della telecamera all'adattatore video</td></tr><tr><td>Obiettivo della telecamera</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>Visualizzazione del posizionamento del microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale</td></tr><tr><td>Accoppiatore della telecamera</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>Visualizzazione del posizionamento del microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale</td></tr><tr><td>Luna Convertitore BNC a VGA + HDMI</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>Adattatore da BNC a VGA che consente la proiezione dell'immagine della telecamera sul monitor del computer</td></tr><tr><td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>Agonista mGluR6, blocca l'onda b che consente l'analisi del potenziale del recettore di massa del cono isolato</td></tr><tr><td>Vetro borosilicato</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>Vetro borosilicato lucidato a fuoco (temperatura di metling = 821&deg; C) con filamento e dimensioni di 1,5 mm x 0,86 mm (diametro esterno per diametro interno)&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 Estrattore fiammante/marrone</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>Per il traino di micropipette in vetro Foglio</td></tr><tr><td>di sorbotano</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>Polimero uretanico viscoelastico sintetico, posizionato sotto i supporti di isolamento passivo e la piattaforma ERG per assorbire gli urti e prevenire lo scivolamento, può essere tagliato a misura</td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>B2436F</td><td>Piattaforma di isolamento dalle vibrazioni per stimolatore ERG e campione</td></tr> <tr><td>di zebrafishSupporti di isolamento passivo</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>Fornisce isolamento dalle vibrazioni alla breadboard</td></tr><tr><td>Rete di rame</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>Per la linea Pompa per pipette a gabbia di Faraday</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>Utilizzata con le pipette Pasteur per trasferire con cura le larve di pesce zebra</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Pasteur VWR</td><td>14672-608</td><td>Utilizzata con la pompa per pipette per trasferire con cura le larve di pesce zebra</td></tr><tr><td>Telecamera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>Visualizzazione del posizionamento del microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale</td></tr><tr><td>Tricaina (MS-222)</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-S</td><td>Anestetico di grado farmaceutico,Micro-fil</td></tr> <tr><td></td><td>WPI</td><td>MF28G-5</td><td>Supporto per microelettrodo di riempimento e vetro per microelettrodo</td></tr><tr><td></td><td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>Contiene il microelettrodo di vetro, si collega all'apparecchiatura ERG</td></tr><tr><td>Elettrodo di riferimento</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td><td>Rompere con cautela l'ultimo centimetro dell'involucro per drenare l'elettrolita ed esporre l'elettrodo a pellet Ag/AgCl sinterizzato</td></tr><tr><td>Elettrodo di riferimento (alternativo)</td><td>WPI</td><td>EP1</td><td>Alternativa a DRIREF-5SH. Elettrodo Ag/AgCl che deve essere collegato/saldato al cavo di collegamento</td></tr><tr><td>Cavo a bassa rumorosità per supporto per microelettrodo</td><td>WPI</td><td>13620</td><td>Collegamento del supporto per microelettrodo di registrazione all'adattatore/testiera</td></tr></tbody></table>

analisi elettroretinogramma della risposta visiva in zebrafish larve

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

L&#39;elettroretinogramma (ERG) è un metodo non invasivo per determinare elettrofisiologico funzione retinica. Attraverso il posizionamento di un elettrodo sulla superficie della cornea, attività elettrica generata in risposta alla luce può essere misurato e utilizzato per valutare l&#39;attività di cellule retiniche in vivo. Questo manoscritto descrive l&#39;uso della ERG per misurare la funzione visiva in zebrafish. Zebrafish sono stati a lungo utilizzato come modello per lo sviluppo vertebrato a causa della facilità di soppressione genica mediante oligonucleotidi morfolino e manipolazione farmacologica. A 5-10 dpf, solo coni sono funzionali nella retina larvale. Pertanto, il zebrafish, a differenza di altri animali, è un potente sistema modello per lo studio della funzione visiva cono in vivo. Questo protocollo utilizza l&#39;anestesia standard micromanipolazione e protocolli stereomicroscopia che sono comuni nei laboratori che eseguono la ricerca zebrafish. I metodi di cui fanno uso di eq elettrofisiologia normaAZIONE e una telecamera a bassa luce per guidare il posizionamento della microelettrodo di registrazione sulla cornea larvale. Infine, si dimostra come un disponibile in commercio ERG stimolatore / registratore originariamente progettato per l&#39;uso con i topi possono essere facilmente adattato per l&#39;uso con zebrafish. ERG di zebrafish larvale fornisce un metodo eccellente per saggiare cono funzione visiva in animali che sono stati modificati da morpholino iniezione oligonucleotide nonché nuove tecniche di ingegneria del genoma come zinco Finger nucleasi (ZFNs), Trascrizione Activator-Like Effector nucleasi (Talens), e cluster regolarmente intervallate brevi palindromo Ripete (CRISPR) / Cas9, i quali hanno notevolmente aumentato l&#39;efficienza e l&#39;efficacia del gene targeting in zebrafish. Inoltre, abbiamo approfittato della capacità di agenti farmacologici di penetrare larve zebrafish per valutare le componenti molecolari che contribuiscono alla fotorisposta. Questo protocollo delinea una configurazione che può essere modificato e utilizzato dai ricercatoricon diversi obiettivi sperimentali.

Tipicamente, ERG sono registrati da larve di zebrafish a 5 dpf, dal momento che un certo numero di studi hanno pubblicato le registrazioni ERG in questa fase 9, 16,20. Risposte larvali sono stati misurati in condizioni di oscurità adattato senza retroilluminazione utilizzando uno stimolo 20 msec di luce LED bianca. Abbiamo utilizzato un sistema di ERG disponibile in commercio costituito da uno stimolatore luce Ganzfeld e computer di controller / registratore. Lo stimolatore utilizza un sistema di modulazione ...

Presentiamo un metodo per l'analisi elettroretinografica (ERG) delle larve di zebrafish utilizzando tecniche di micromanipolazione ed elettroretinografia. Questo è un metodo semplice e diretto per saggiare la funzione visiva delle larve di zebrafish in vivo.

Analisi elettroretinogramma della risposta visiva in Zebrafish larve

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è illustrare i passaggi necessari per eseguire un'analisi elettrografica su pesci zebra larvali. Questo viene realizzato innanzitutto generando micro pipette di vetro con la forma e le dimensioni adeguate. Il secondo passaggio consiste nel configurare con attenzione l'attrezzatura fondamentale per l'esperimento, come gli elettrodi di riferimento e di registrazione.Successivamente, il pesce zebra larvale viene anestetizzato e correttamente orientato rispetto all'apparecchiatura di stimolazione e registrazione. L'ultimo passaggio consiste nel posizionamento accurato dell'elettrodo microscopico in vetro sulla cornea del pesce zebra larvale. In definitiva, pesce zebra larvale.L'analisi ERG è utile per studiare la funzione visiva dei coni nella retina di vertebrati completamente dotati di coni, in vivo. Questo metodo è molto utile per rispondere a domande fondamentali nel campo della scienza della visione, come l'identificazione delle vie di segnalazione che contribuiscono alla sensibilità visiva e all'adattamento alla luce nei coni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché il posizionamento corretto dell'elettrodo microscopico di registrazione sul campione è difficile da apprendere a causa delle piccole dimensioni dell'occhio del pesce zebra larvale.Per iniziare questa procedura, preparare diverse micropipette utilizzando capillari in vetro borosilicato con filamento, tirati a fiamma. Controllare ogni micropipetta al microscopio con un righello graduato appropriato per assicurarsi che il diametro della punta sia compreso tra 10 e 15 micrometri e che l'aspetto sia uniforme. Preparare una soluzione di lavoro nel giorno dell'esperimento diluendo una soluzione ringer 10x a 1x.Con un filtro per acqua distillata deionizzata, sterilizzare la soluzione per assicurare che le particelle non ostruiscano la punta della micropipetta. Successivamente ossigenare con una miscela di 95% di ossigeno e 5% di anidride carbonica per 10 minuti. Chiudere ermeticamente la soluzione subito dopo per garantire che rimanga ossigenata.Ora posizionare una piattaforma mobile in plastica con un fondo in polimero di uretano viscoelastico assorbente degli urti sul tavolo antivibrazioni al di sotto della sorgente luminosa. Successivamente, posizionare la telecamera con un supporto magnetizzato e puntarla verso la piattaforma mobile in plastica. Quindi, posizionare il micromanipolatore dell'elettrodo di registrazione su un secondo supporto magnetizzato.Assicurarsi che la telecamera e il micromanipolatore non vengano disturbati dal movimento di altri apparecchi e che non ostacolino l'illuminazione proveniente dalla sorgente luminosa. Successivamente, collegare la telecamera a un monitor video e posizionarla verso la piattaforma. Verificare che l'allestimento sia correttamente messo a terra con un filo di rame. In questo passaggio, tagliare un piccolo rettangolo di spugna di PVA secca che si adatti perfettamente a una piastra di Petri da 35 millimetri utilizzando una lametta pulita. Effettuare un taglio aggiuntivo nella spugna per alloggiare l'elettrodo di riferimento. Quindi utilizzare un pennarello resistente ai prodotti chimici per segnare un puntino sullo spugna nel punto in cui verrà posizionata la larva.Successivamente, immergere la spugna di PVA nella soluzione di Ringer fino a completa saturazione. Rimuoverla e asciugarla rapidamente su un tovagliolo di carta due o tre volte prima di posizionarla in una piastra di Petri pulita da 35 millimetri. Successivamente, posizionare la piastra di Petri contenente la spugna su una piattaforma di plastica in modo che il segno possa essere visualizzato dalla telecamera.Successivamente, clorurare gli elettrodi immergendoli in una soluzione di cloruro di sodio al 6-9%. Quindi asciugarli all'aria su un fazzoletto Kim per cinque minuti. Posizionare il pellet di argento, cloruro d'argento dell'elettrodo di riferimento all'interno o sotto la spugna, a seconda dello stile dell'incisione effettuata, e collegare il cavo dell'elettrodo di riferimento al sistema di registrazione.Successivamente, collegare circa 40 centimetri di tubo a una siringa da cinque millilitri senza blocco a baionetta e riempire la siringa con soluzione di Ringer. In seguito, riempire una siringa da un millilitro senza blocco a baionetta con soluzione di Ringer. Utilizzando un microfill, riempire con attenzione il porta microelettrodo ed evitare la formazione di bolle d'aria.Quindi collegare la siringa da cinque millilitri al portello di pressione del supporto per microelettrodi mediante un tubicino, utilizzando il microfill e una siringa da un millilitro riempita con soluzione di Ringer. Riempire la micropipetta di vetro a partire dalla punta e assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria. Successivamente, collegare la micropipetta di vetro al supporto per microelettrodi avendo cura di mantenere il filo dell'elettrodo perfettamente dritto.Dopo averlo fissato, utilizzare la siringa da cinque millilitri per spingere con attenzione la soluzione di Ringer attraverso il microelettrodo fino a quando una piccola quantità di soluzione diventa visibile sulla punta. Posizionare ora con cura il microelettrodo di registrazione nel micromanipolatore e collegare il cavo al sistema di registrazione per verificare il rumore di fondo del sistema. Posizionare l'elettrodo di riferimento e la punta del microelettrodo di registrazione in una capsula di Petri da 35 millimetri riempita con soluzione di Ringer.Verificare i livelli di rumore elettrico dell'allestimento mediante un oscilloscopio o una funzione integrata dell'apparecchiatura per ERG. I livelli di rumore non devono superare più o meno 10 microvolt rispetto alla linea di base. In questo procedimento, tagliare diversi quadrati di carta da cucina di un centimetro quadrato, anestetizzare da tre a cinque larve in una piastra di Petri da 35 millimetri aggiungendo trica a una concentrazione finale dello 0,02% e attendendo da uno a due minuti.Successivamente, trasferire con attenzione un singolo larva su un quadratino di carta da filtro sotto una stereomicroscopio con illuminazione minima. Verificare la posizione della larva scegliendone una con il lato dorsale rivolto verso l'alto e con l'occhio occluso per sessioni di registrazione che durano più di 30 minuti. Mantenere la larva umida applicando sulla superficie del corpo il 3% di metilcellulosa mediante un pennello fine in pelo di cammello.Quindi trasferire il quadratino di carta da cucina con la larva sulla spugna in PVA umida. Successivamente, applicare un flusso continuo di acqua satura di ossigeno al 100% sulle larve facendo gorgogliare il gas attraverso un pietrisco poroso in un pallone laterale contenente acqua distillata. Posizionare l'ossigeno umidificato proveniente dal braccio laterale del pallone vicino alla testa della larva mediante un tubo, in condizioni di illuminazione minima.Utilizzare il micromanipolatore e la telecamera per posizionare la punta del microelettrodo nel punto medio tra le estremità nasale e temporale dell'occhio e premere delicatamente sul limite dorsale della cornea. Lasciare che le larve si adattino al buio per cinque-dieci minuti. Quindi registrare le risposte allo stimolo luminoso fornito da una sorgente luminosa a LED o da un stimolatore ottico.Questa figura mostra un tipico tracciato di ERG in un pesce zebra larvale di cinque giorni post-fecondazione. I pesci adattati al buio sono stati esposti a luce bianca LED per 20 millisecondi con intensità comprese tra 1 e 5.000 candele per metro quadrato, con l'inizio dello stimolo luminoso al secondo zero. Il potenziale negativo dell'onda a è difficile da distinguere, mentre il potenziale positivo dell'onda b rappresenta il picco dominante del tracciato.Questo riquadro mostra le ampiezze medie della risposta dell'onda B, adattate utilizzando l'equazione di Naka-Rushton. Questa figura mostra un tipico tracciato di ERG in un pesce zebra larvale di cinque giorni post-fecondazione (DPF), adattato al buio e trattato con PB. I pesci sono esposti a luce bianca LED per 20 millisecondi con intensità comprese tra 1 e 5.000 candele per metro quadrato, e il potenziale recettoriale massimo dei coni isolati rappresenta l'elemento dominante della forma d'onda. Questo riquadro mostra le ampiezze medie della risposta di un pesce zebra larvale trattato con PB, adattate utilizzando l'equazione di Naka-Rushton.Questa figura mostra un tipico tracciato di ERG in un pesce zebra larvale trattato con cinque D-P-F-A-P-B. Utilizzando un paradigma a doppio flash. I pesci adattati al buio sono esposti a una successione di luce bianca della durata di 20 millisecondi.I LED lampeggiano con un'intensità di 1000 canula per metro quadrato e l'ISI tra i lampeggi è di due secondi. Qui viene indicato l'inizio di ogni stimolo luminoso. Questa figura mostra il rapporto tra la risposta massima del potenziale recettoriale del cono isolato allo stimolo secondario e quella allo stimolo iniziale, al crescere dell'ISI, il che indica il recupero progressivo della sensibilità dei fotoricettori.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la qualità delle registrazioni dipende dall'integrità della connessione tra l'elettrodo e la cornea e dallo stato di salute delle larve. Lo sviluppo di questa tecnica ha notevolmente migliorato la capacità dei ricercatori nel campo delle scienze della visione di studiare l'adattamento e il recupero dei coni nella retina dei vertebrati in vivo.

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Neuroscienze

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