Name: Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e langiogenesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Scopri come stabilire un modello di xenotrapianto di mieloma multiplo umano nel pollo per studiare la crescita tumorale, l'invasione e l'angiogenesi. Questo metodo consente lo screening preclinico di farmaci antitumorali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare la signora Cornelia Heis per la sua eccellente assistenza tecnica nell'immunoistochimica e nella preparazione degli embrioni di pollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco per la scienza (FWF Grant No. P19552) e dall'Unione Europea (EU FP7 project Optatio No: 278570).

Secondo la legge austriaca, e l&#39;Ufficio di animali da laboratorio benessere del servizio sanitario pubblico embrioni aviaria degli Stati Uniti non sono considerati animali vertebrati vivi fino hatching.The NIH Office of Laboratory Animal Welfare ha fornito indicazioni scritte in questo settore (http: // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm e NIH Pubblicazione n .: 06-4515). 1. Colture Cellulari e lentivirali trasfezione <ol><li> Linee Cultura MM cellule OPM-2, RPMI-8226 e cellule staminali mesenchimali umane da midollo osseo in mezzo RPMI1640, integrato con 10% di siero fetale bovino vitello e 100 UI / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e glutammina 2 mM in presenza 5% di CO 2 a 37 ° C. </li><li> Trasfettare 5 x 10 6 cellule HEK 293FT con mix virale imballaggio (9 mg) DNA e 3 mg pLenti6 / V5 dest eGFP vettore per l&#39;uso di 30 microlitri di reagente liposomiale trasfezione e medie trasfezione (10 ml). Rimuovere medio trasfezione dopo 12 ore eaggiungere 10 ml DMEM con 10% di siero di vitello e 1% di aminoacidi non essenziali (NEAA). </li><li> Dopo 5 giorni, raccogliere surnatanti di cellule HEK293FT dopo centrifugazione di cellule nuoto (1.000 XG, 5min). Determinare titolo virale mediante real time PCR come descritto altrove 28. </li><li> Trasfettare 1 x 10 6 cellule di MM con particelle lentivirali eGFP (1 x 10 5 particelle) in un piatto 24 bene in mezzo di crescita completa. Dopo 3 giorni, iniziare il processo di selezione aggiungendo 2 ug / ml blasticidin al mezzo di coltura. Per il eGFP lentivirus disponibile in commercio, usare 500 ug / ml di neomicina. </li><li> Dopo 2 settimane di selezione, grappoli di eGFP esprimono cellule di MM apparirà; raccogliere le cellule per centrifugazione (1.000 xg, 5 min) e di espandersi come OPM-2 eGFP e RPMI-8226 sottolinee eGFP per esperimenti (sezione 2 e 3). </li></ol> 2. 3D Multiplo modello mieloma Spheroid <ol><li> Tipo I Freddo collagene soluzione e 10 x DMEM on ghiaccio. </li><li> Mescolare 1/10 Volume di 10 x DMEM medio in matrice di collagene; aggiungere NaOH (0,2 N) per neutralizzare la soluzione acida di collagene ad un valore pH di 7,4; immagazzinare il collagene / soluzione a medio sul ghiaccio. </li><li> Mescolare linee cellulari di MM transgeniche (OPM-2 eGFP o RPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoide,) con cellule umane mesenchimali (50.000 cellule / sferoide, vale a dire, il 30 microlitri drop). </li><li> Miscela di cellule Centrifuga in provette da 15 ml (1000 xg, 5min), aggiungere freddo miscela di collagene preparato (1 ml) al pellet e mescolare bene (con 1.000 punta microlitri). </li><li> Subito pipetta 30 microlitri della miscela di collagene / cella (con 100 microlitri punta) in una piastra a 24 pozzetti su parafilm sterile e lasciare miscela di cellule / collagene polimerizzare per 30 minuti a 37 ° C (vedere Figura 1A). </li><li> Sferoidi MM sovrapposizione con mezzo di coltura contenente 1 ml 1, 10 e 100 nM bortezomib (vedi Figura 1B). </li><li> Dopo 72 h di incubazione a 37 ° C, sferoidi documento dafluorescenza stereomicroscopia (vedi Figura 1C). </li><li> Trasferire ogni spheroid dall&#39;uso di pinze con ganasce piatte larghe in un tubo di reazione per la misura di GFP (vedere Figura 1D). </li></ol> 3. 3D mieloma multiplo Xenograft modello in CAM <ol><li> Incubare uova di gallina in un incubatore speciale per uova di volatili a 37 ° C e 70% di umidità per tre giorni. </li><li> Successivamente, uova aperte e trasferimento embrioni sterilizzati con barche etanolo, quadrato, di 10 cm in plastica di peso con la cultura di cellule coperchio piatto e incubare &quot;ex ovo&quot; per altri sei giorni, in modo che la CAM è in grado di sviluppare (vedere Figura 2A). </li><li> Tipo I freddo collagene soluzione e 10 x DMEM su ghiaccio, mescolare 1/10 volume di 10 x terreno DMEM nella matrice di collagene, Aggiungere NaOH (0,2 N) per neutralizzare la soluzione acida di collagene ad un valore pH di 7,4; immagazzinare il collagene / soluzione a medio sul ghiaccio. </li><li> Mescolare linee cellulari di MM transgenici (OPM-2 o eGFPRPMI-8226 eGFP; 250.000 per sferoide,) con cellule mesenchimali umane (50.000 cellule / sferoide). </li><li> Centrifugare le cellule in 15 ml provette (1.000 XG, 5min, per ciascun composto di prova 1 fiala), aggiungere 1 ml di freddo miscela di collagene preparata con la droga (a concentrazione di lavoro desiderato) al pellet e mescolare bene (con 1.000 punta microlitri). </li><li> Inserire collagene gocce (30 ml ciascuno) su parafilm in 6 ben pate per 30 min per permettere la polimerizzazione della matrice extracellulare a 37 ° C. </li><li> Transfer &quot;onplants&quot; dal punto 3.6 con l&#39;uso del forcipe alla superficie trattata del CAM (2 cm da embrione) di 9 giorni di embrioni di pollo (4 onplants per ogni embrione di pollo, si veda la Figura 2B) </li><li> Dopo 5 giorni di crescita in vivo in un incubatore uovo alla 37 ° C e 70% di umidità, xenotrapianti documento per fluorescenza stereomicroscopia (vedere la Figura 2C). Euthanize embrioni di pollo da ipotermia a 4 ° C in frigorifero per 5h. </li><li> Rimuovere xenotrapianti con tessuto CAM soggiacente da una forbice oftalmica e pinze con ganasce piatte larghe. Usali per la misura di GFP (sezione 4, vedi Figura 2D) o per l&#39;analisi immunoistochimica dei vasi sanguigni e / o cellule tumorali invadono (sezione 5). </li></ol> 4. Quantificazione di eGFP proteine ​​mediante ELISA <ol><li> Trasferire ogni sferoide MM o xenotrapianto asportato in 0,5 ml RIPA buffer contenente 200 mcg / ml inibitori della proteasi. </li><li> Omogeneizzare sferoide / xenotrapianto con un omogeneizzatore tessuto sul ghiaccio. </li><li> Eseguire tre congelamento / scongelamento-cicli in azoto liquido e 37 ° C bagnomaria. </li><li> Centrifugare omogenato a 4 ° C per 20 min (12,000 g) e memorizzare supernatanti. </li><li> Diluire i campioni 1:20 in tampone (200 microlitri) del kit ELISA. Misurare GFP livelli da un GFP commerciale ELISA Kit utilizzando anticorpi biotinilati anti-GFP, secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 5. ImmunohiAnalisi stochemical dei vasi sanguigni e invadere le cellule tumorali <ol><li> Fissare xenotrapianti asportati con area CAM in paraformaldeide al 4% O / N a 4 ° C. </li><li> Inserire xenotrapianti fissi in cassette incorporamento e trasferirli in una stazione embedding tessuto con una serie alcool crescente graduata (50%, 70%, 80%, 95% di etanolo, xilolo e paraffina; ogni passo 60 min). </li><li> Xenotrapianti Sezione (5 micron) mediante l&#39;uso di un microtomo rotativo da banco. Cuocere sezioni di paraffina sui vetrini O / N a 56 ° C. </li><li> Deparaffinare le sezioni di una serie graduata alcool riduzione acqua bidistillata (xilolo, 95%, 80%, 70%, 50% di etanolo, acqua bidistillata; ciascun passo 10 min). </li><li> Eseguire recupero dell&#39;antigene in un bagno d&#39;acqua (95 ° C, 20 min) con una soluzione di recupero dell&#39;antigene (tampone citrate-; pH 7,0; volume di 100 microlitri). </li><li> Bloccare l&#39;attività perossidasica endogena con 100 microlitri 3% H 2 O 2 / metanolo per 30 min. </li><li> Sezioni di blocco in PBS contenenteSiero bovino fetale al 10% per 45 min (volume 100 ml). </li><li> Stain per 1 ora con 100 microlitri di anticorpo primario (1 ug / ml) diluito in PBS contenente siero fetale di vitello 1% a RT. </li><li> Dopo aver lavato 3 volte in PBS, incubare per 1 ora con l&#39;anticorpo secondario biotinilato (0,1 mg / ml) in PBS contenente siero fetale di vitello 1% a RT. </li><li> Dopo aver lavato 3 volte in PBS effettuare reazione colorata dalla soluzione avidina / biotina-complesso (ABC) e la diaminobenzidina (DAB) substrato secondo le istruzioni del produttore. </li><li> 5.11. Smettere di reazione trasferendo sezioni doppio acqua distillata, di contrasto con ematossilina e montare le sezioni con un mezzo di montaggio sintetico. </li></ol>

<ol><li>Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+myeloma%3A+evolving+genetic+events+and+host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions.</a> Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).</li>
<li>Kumar, S. K., Gertz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+adapted+therapy+for+multiple+myeloma%3A+back+to+basics%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics.</a> Leuk.Lymphoma. , (2014).</li>
<li>Prideaux, S. M., Conway, O. E., Chevassut, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Hematol%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of multiple myeloma.</a> Adv.Hematol. 2014, 864058(2014).</li>
<li>Chauhan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orally+active+proteasome+inhibitor+ONX+0912+triggers+in+vitro+and+in+vivo+cytotoxicity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A novel orally active proteasome inhibitor ONX 0912 triggers in vitro and in vivo cytotoxicity in multiple myeloma.</a> Blood. 116 (23), 4906-4915 (2010).</li>
<li>Kuehl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+can+predict+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models can predict cancer therapy.</a> Blood. 120 (2), 238-240 (2012).</li>
<li>Nefedova, Y., Gabrilovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+clinical+prospects+of+Notch+inhibitors+in+the+therapy+of+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Resist.Updat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and clinical prospects of Notch inhibitors in the therapy of hematological malignancies.</a> Drug Resist.Updat. 11 (6), 210-218 (2008).</li>
<li>Yaccoby, S., Barlogie, B., Epstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+myeloma+cells+growing+in+SCID-hu+mice%3A+a+model+for+studying+the+biology+and+treatment+of+myeloma+and+its+manifestations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Primary myeloma cells growing in SCID-hu mice: a model for studying the biology and treatment of myeloma and its manifestations.</a> Blood. 92 (8), 2908-2913 (1998).</li>
<li>Dazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+chronic+phase+CML+hematopoietic+cells+repopulate+NOD%2FSCID+bone+marrow+with+different+kinetics+and+cell+lineage+representation%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol.J%22%5BJournal%5D)">Normal and chronic phase CML hematopoietic cells repopulate NOD/SCID bone marrow with different kinetics and cell lineage representation.</a> Hematol.J. 1 (5), 307-315 (2000).</li>
<li>Lock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+%28NOD%2FSCID%29+mouse+model+of+childhood+acute+lymphoblastic+leukemia+reveals+intrinsic+differences+in+biologic+characteristics+at+diagnosis+and+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mouse model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis and relapse.</a> Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).</li>
<li>Feuring-Buske, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+acute+myeloid+leukemia+progenitor+cells+in+beta+2-microglobulin-deficient+NOD%2FSCID+mice+and+in+NOD%2FSCID+mice+transgenic+for+human+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human acute myeloid leukemia progenitor cells in beta 2-microglobulin-deficient NOD/SCID mice and in NOD/SCID mice transgenic for human growth factors.</a> Leukemia. 17 (4), 760-763 (2003).</li>
<li>Pearce, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AML+engraftment+in+the+NOD%2FSCID+assay+reflects+the+outcome+of+AML%3A+implications+for+our+understanding+of+the+heterogeneity+of+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">AML engraftment in the NOD/SCID assay reflects the outcome of AML: implications for our understanding of the heterogeneity of AML.</a> Blood. 107 (3), 1166-1173 (2006).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+inhibition+of+Notch+signaling+and+Bcl-2%2FBcl-xL+results+in+synergistic+antimyeloma+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Combined inhibition of Notch signaling and Bcl-2/Bcl-xL results in synergistic antimyeloma effect.</a> Mol.Cancer Ther. 9 (12), 3200-3209 (2010).</li>
<li>Tassone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinically+relevant+SCID-hu+in+vivo+model+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A clinically relevant SCID-hu in vivo model of human multiple myeloma.</a> Blood. 106 (2), 713-716 (2005).</li>
<li>Ranga, A., Gjorevski, N., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+through+stem+cell-based+organoid+models%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Drug+Deliv.Rev%22%5BJournal%5D)">Drug discovery through stem cell-based organoid models.</a> Adv.Drug Deliv.Rev. 69-70, 19-28 (2014).</li>
<li>Pereira, R. F., Barrias, C. C., Granja, P. L., Bartolo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+biofabrication+strategies+for+skin+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine.%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Advanced biofabrication strategies for skin regeneration and repair.</a> Nanomedicine.(Lond). 8 (4), 603-621 (2013).</li>
<li>Fischbach, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumors+with+3D+scaffolds%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering tumors with 3D scaffolds).</a> Nat.Methods. 4 (10), 855-860 (2007).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo.</a> J.Vis.Exp. (41), (2010).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+2.+Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+models+to+quantify+angiogenesis+induced+by+inflammatory+and+tumor+cells+or+purified+effector+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 2. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules.</a> Methods Enzymol. 444, 21-41 (2008).</li>
<li>Deryugina, E. I., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochem.Cell Biol. 130 (6), 1119-1130 (2008).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GRP-78+secreted+by+tumor+cells+blocks+the+antiangiogenic+activity+of+bortezomib%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">GRP-78 secreted by tumor cells blocks the antiangiogenic activity of bortezomib.</a> Blood. 114 (18), 3960-3967 (2009).</li>
<li>Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Presta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gelatin+sponge-chorioallantoic+membrane+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">The gelatin sponge-chorioallantoic membrane assay.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 85-91 (2006).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+model+for+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology.</a> Exp.Cell Res. , (2014).</li>
<li>Dohle, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay%3A+how+it+really+works%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J.Vis.Exp. (33), (2009).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chick+embryo+model+for+metastatic+human+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.Urol%22%5BJournal%5D)">A chick embryo model for metastatic human prostate cancer.</a> Eur.Urol. 34 (2), 154-160 (1998).</li>
<li>Koop, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+melanoma+cells+entering+the+microcirculation%3A+over+80%25+survive+and+extravasate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fate of melanoma cells entering the microcirculation: over 80% survive and extravasate.</a> Cancer Res. 55 (12), 2520-2523 (1995).</li>
<li>Martowicz, A., Spizzo, G., Gastl, G., Untergasser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype-dependent+effects+of+EpCAM+expression+on+growth+and+invasion+of+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Phenotype-dependent effects of EpCAM expression on growth and invasion of human breast cancer cell lines.</a> BMC.Cancer. 12, 501(2012).</li>
<li>Martowicz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+overexpression+prolongs+proliferative+capacity+of+primary+human+breast+epithelial+cells+and+supports+hyperplastic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM overexpression prolongs proliferative capacity of primary human breast epithelial cells and supports hyperplastic growth.</a> Mol.Cancer. 12, 56(2013).</li>
<li>Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+lentiviral+vector+titration+methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Comparison of lentiviral vector titration methods.</a> 6, 34(2006).</li>
<li>Farnoushi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+testing+of+drug+response+in+multiple+myeloma+made+possible+by+xenograft+to+turkey+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo testing of drug response in multiple myeloma made possible by xenograft to turkey embryos.</a> Br.J.Cancer. 105 (11), 1708-1718 (2011).</li>
<li>Wunderlich, M., Krejci, O., Wei, J., Mulloy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD34%2B+cells+expressing+the+inv%2816%29+fusion+protein+exhibit+a+myelomonocytic+phenotype+with+greatly+enhanced+proliferative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD34+ cells expressing the inv(16) fusion protein exhibit a myelomonocytic phenotype with greatly enhanced proliferative ability.</a> Blood. 108 (5), 1690-1697 (2006).</li>
<li>Hideshima, T., Mitsiades, C., Tonon, G., Richardson, P. G., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+multiple+myeloma+pathogenesis+in+the+bone+marrow+to+identify+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding multiple myeloma pathogenesis in the bone marrow to identify new therapeutic targets.</a> Nat.Rev.Cancer. 7 (8), 585-598 (2007).</li>
<li>Parikh, M. R., Belch, A. R., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+tissue+culture+model+to+study+primary+human+bone+marrow+and+its+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Vis.Exp%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies.</a> J.Vis.Exp. (85), (2014).</li>
<li>Schuler, J., Ewerth, D., Waldschmidt, J., Wasch, R., Engelhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+multiple+myeloma%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Opin.Biol.Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of multiple myeloma: a critical appraisal.</a> Expert.Opin.Biol.Ther. 13, Suppl 1. S111-S123 (2013).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).</li>
<li>Jilani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+binding+of+lectins+to+embryonic+chicken+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature.</a> J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione

Lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici per refrattario MM richiede meno tempo e costosi sistemi in vivo per valutare la sensibilità di cellule MM umane ai farmaci. Finora, solo pochi sistemi in vivo sono a disposizione per la valutazione preclinica di nuove terapie anti-mieloma. Tutti loro hanno i loro limiti per lo screening su larga scala di librerie di composti 29. I migliori modelli attuali di cellule di MM umane sono altamente immuni topi con deficit 7,13,30 ed embrioni di tacchi...

Il mieloma multiplo (MM) è caratterizzato dalla proliferazione di plasmacellule maligne nel midollo osseo, lesioni ossee e immunodeficienza 1. Sebbene siano disponibili nuove opzioni terapeutiche come gli inibitori del proteasoma (bortezomib) e i farmaci immunomodulatori (pomalidomide e lenalidomide), il MM rimane ancora un tumore maligno incurabile con una prognosi infausta 2. La prognosi infausta potrebbe essere spiegata dalla straordinaria eterogeneità dei cloni di cellule di MM che contribuisce a risposte variabili alla terapia, in particolare in caso di trattamento a lungo termine e pressione di selezione dei cloni di MM 3.
La sperimentazione preclinica di nuovi farmaci e delle loro combinazioni in vitro e in vivo è un passo critico e dispendioso in termini di tempo per lo sviluppo futuro di farmaci. Pertanto, sono necessari utili modelli in vivo di MM per ottenere una migliore comprensione della biologia della malattia e per consentire la scoperta di nuovi farmaci. In realtà, i migliori modelli di xenotrapianto per neoplasie ematologiche e terapie sono topi immunodeficienti, come i topi immunodeficienti combinati gravi (SCID) 4-7, i topi diabetici/SCID (NOD/SCID) non obesi 8,9 o i topi NOD/SCID β-microglobuline-knockout NOD/SCID 10,11.
Sebbene i modelli murini di MM umano in alcuni aspetti possano assomigliare al fenotipo della malattia umana, i topi immunodeficienti sono consanguinei, quindi simulano solo una risposta individuale a un farmaco e i costi sono molto alti. A causa dell'immunosoppressione, gli animali richiedono condizioni di mantenimento speciali e l'attecchimento del MM umano nei topi richiede da 6 settimane a 2 mesi 9,12, a meno che le cellule non vengano innestate direttamente nel midollo osseo utilizzando una procedura tecnicamente impegnativa con tassi di sopravvivenza animale inferiori 7,13. Pertanto, sono stati messi a punto nuovi metodi che utilizzano modelli di organoidi basati su cellule staminali 14, ingegneria tissutale 15 o sofisticati modelli di coltura cellulare 3D 16. Nel prossimo futuro competeranno con i classici esperimenti sugli animali per i test preclinici sui farmaci, ma non possono sostituire i test di tossicità sistemica negli organismi viventi.
L'embrione di pollo ha già dimostrato di essere un organismo adatto per lo xenotrapianto di cellule e tessuti umani a causa della mancanza di risposta immunitaria adattativa fino alla schiusa 17-19. Inoltre, ogni embrione di pollo riflette una reazione individuale ai farmaci applicati o alle cellule tumorali a causa della diversità genetica all'interno della popolazione di pollo. La membrana corioallantoidea (CAM) è un sistema ben consolidato per studiare l'angiogenesi tumore-dipendente 20-22. Quando i tumori solidi vengono innestati nella CAM, mostrano molte caratteristiche dei tumori in vivo, tra cui proliferazione, invasione, angiogenesi e metastasi 23-27. 
Sulla base della precedente esperienza del nostro gruppo con i modelli di xenotrapianto CAM20,26,27, è stato creato un modello di MM umano che combina il vantaggio di un sistema di coltura 3D umano con il modello di embrioni di pollo in via di sviluppo ex ovo. Questo sistema modello di MM consente il monitoraggio in tempo reale della progressione della crescita del MM, la quantificazione della massa cellulare e i test preclinici sui farmaci.

<table><tbody><tr><td>Cellule RPMI-8226</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR profilate</td></tr><tr><td>Cellule OPM-2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR profilate</td></tr><tr><td>Cellule staminali mesenchimali umane&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT celle&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Soluzione per streptococco</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfection Medium/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>particelle lentivirali eGFP</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td><td>Particelle virali pronte all'uso</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 vettore eGFP</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>dagli autori</td></tr><tr><td>Mix di imballaggio ViralpowerTM</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione/ Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Collagene-Type1&nbsp; Coda di ratto</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>polvere DMEM</td> Life <td>Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>plitidepsin</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-uova di gallina bianche</td><td>Charles River</td><td></td><td>Fecondate&nbsp; bianche livornesi&nbsp; uova di gallina</td></tr><tr><td>Barche di pesatura in plastica</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>per coltura ex-ovo</td></tr><tr><td>Quadrato petridish (coperchi)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>per coltura ex-ovo</td></tr><tr><td>RIPA Buffer (10x)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi Compresse inibitrici</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Mini completo senza</td><td></td><td></td><td></td>EDTA</tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio SuperFrost R</td><td>. Langenbrinck</td><td>Art.-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation Wash Buffer 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>Codice-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di recupero target (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>Codice DAKO</td><td>Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Clone ASMA 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 clone MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Clone Vimentin V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin clone D33</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; clone MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>DAKO</td><td>&nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>capra biotinilata- anti-topo IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td># Set di tablet PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB.</td><td>Sigma Biochemicals</td><td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer' s haemalaun solution</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotativo da banco</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stazione di inclusione tissutale</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice per uova</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a stereofluorescenza dotato di una fotocamera digitale collegata (Olympus E410) e luce fredda flessibile.</td><td>Olimpo, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra Turrax&nbsp;</td><td>Omogeneizzatore</td> <td>IKA T10</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di un mieloma multiplo umano xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Il mieloma multiplo (MM), una malattia delle cellule del plasma maligne, resta incurabile e nuovi farmaci sono necessari per migliorare la prognosi dei pazienti. A causa della mancanza del microambiente dell&#39;osso e fattori di crescita auto / paracrino cellule MM umane sono difficili da coltivare. Pertanto, non vi è un urgente bisogno di stabilire una corretta in vitro e in sistemi di coltura in vivo per studiare l&#39;azione di nuove terapie sulle cellule umane di MM. Presentiamo qui un modello di crescere cellule di mieloma multiplo umano in un ambiente 3D complesso in vitro e in vivo. Linee cellulari di MM OPM-2 e RPMI-8226 sono state trasfettate per esprimere la GFP transgene e sono stati coltivati ​​in presenza di cellule mesenchimali umane e collagene di tipo I matrice come sferoidi tridimensionali. Inoltre, sferoidi sono stati innestati sulla membrana corioallantoidea (CAM) di embrioni di pollo e la crescita del tumore è stata monitorata mediante microscopia a fluorescenza stereo. Entrambi i modelli consentono lo studio del romanzo dru terapeuticogs in un ambiente 3D complesso e la quantificazione della massa tumorale dopo omogeneizzazione di innesti in un GFP-ELISA specifico transgene. Inoltre, le risposte angiogenici dell&#39;ospite e l&#39;invasione delle cellule tumorali nel tessuto ospite soggiacente possono essere monitorate quotidianamente da un microscopio stereo e analizzati mediante immunoistochimica contro le cellule tumorali umane (Ki-67, CD138, Vimentin) o cellule murali ospiti che coprono i vasi sanguigni (desmin / ASMA). In conclusione, il sistema permette onplant studiare crescita cellulare MM e l&#39;angiogenesi in un ambiente 3D complesso e permette lo screening per composti terapeutici mirati sopravvivenza e la proliferazione delle cellule di MM.

L&#39;analisi in vitro dei composti target in 3D mieloma multiplo test spheroid A causa delle limitazioni di coltura di cellule primarie umane di MM in vitro abbiamo stabilito nuovi modelli di coltura in vitro 3D per linee cellulari MM umane che fanno uso di una matrice extracellulare crescita e cellule mesenchimali umane primarie di supporto dal midollo osseo (Figura 1A, B). Linee cellulari di MM transgenici EGFP consentono la vis...

Mieloma multiplo (MM), le cellule umane richiedono il microambiente favorevole cellule mesenchimali e componenti della matrice extracellulare per la sopravvivenza e la proliferazione. Abbiamo stabilito un vivo pollo modello embrione con cellule di mieloma e mesenchimali umane trapiantate per studiare gli effetti dei farmaci anti-tumorali sulla crescita del tumore, l&#39;invasione e l&#39;angiogenesi.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stabilire un modello in vivo di embrione di pollo con cellule umane di mieloma e cellule mesenchimali trapiantate, al fine di studiare gli effetti dei farmaci antitumorali sulla crescita tumorale, sull'invasione e sull'angiogenesi. Questo obiettivo viene raggiunto generando cellule umane di mieloma multiplo transgeniche per l'analisi in modelli tridimensionali in vitro e in vivo. Le cellule vengono trasfettate con lentivirus che fornisce GFP per la visualizzazione e resistenza alla blastina per la selezione delle cellule trasfettate.Come secondo passaggio, i viridi 3D. Con le cellule transfezionate, vengono generate cellule mesenchimali e matrice extracellulare, il che permette lo screening su larga scala di farmaci antitumorali in un complesso ambiente in vitro 3D. Successivo tumore 3D.Il PHE può essere coltivato in vivo in embrioni di pollo per testare gli effetti di nuovi farmaci sulla crescita tumorale, sull'invasione e sull'angiogenesi. In definitiva, le dimensioni del tumore e le risposte angiogeniche possono essere documentate giornalmente e dopo l'eutanasia. I tumori possono essere analizzati mediante GFP, ELISA e immunohistochimica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i modelli di xeno innesto a specchio, è rappresentato dall'ECX nel manipolare e nell'effettuare l'immagine di tumori umani. Cellule tumorali umane, insieme a cellule stromali umane di supporto e composti della matrice extracellulare, possono crescere in vivo in embrioni di pollo che non hanno ancora sviluppato risposte immunitarie adattative. Questo metodo può contribuire allo sviluppo di nuove terapie e consente uno screening preclinico rapido per il trattamento di pazienti affetti da mieloma multiplo.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le cellule di mieloma multiplo umano vanno facilmente incontro ad apoptosi a causa dello stress e gli embrioni di guancia possono morire se manipolati in modo improprio a causa di condizioni di coltura esogena inadeguate. La procedura e tutti i suoi passaggi critici saranno dimostrati da Cornelia. Hes e da un tecnico esperto del nostro laboratorio. Per questo protocollo, preparare colture di linee cellulari di mieloma multiplo, OPM2, RPMI 8226 e cellule staminali mesenchimali umane provenienti dal midollo osseo; incubare le cellule normalmente in mezzo supplementato seguendo il protocollo indicato; trasfettare un milione di cellule di mieloma multiplo con 100.000 particelle lentivirali.In una piastra a 24 pozzetti con mezzo di crescita completo, dopo tre giorni iniziare la selezione delle cellule trasfettate aggiungendo due microgrammi di blastina per ogni millilitro di mezzo di coltura oppure, dopo due settimane di selezione, utilizzare 500 microlitri di neomicina per millilitro per il lentivirus EGFP disponibile in commercio, cercando aggregati cellulari che esprimono EGFP. Raccogliere gli aggregati cellulari, sia in sospensione che aderenti, risospendendoli attentamente in un tubo da centrifuga, pellettare le cellule D-E-G-F-P a 1000 ×g per cinque minuti ed espanderle come linee cellulari secondarie. Dopo la selezione e la propagazione di cellule di mieloma multiplo che esprimono GFP, verificarne sempre l'efficienza prima di utilizzarle in ulteriori esperimenti.Per iniziare, raffreddare sulla bocca di ghiaccio una soluzione di collagene di tipo I e il 10 X D-MEM. Una volta raffreddati, mescolare un decimo del volume del mezzo 10 X D-MEM nella soluzione di collagene. Quindi aggiungere goccia a goccia l'idrossido di sodio 0,2 N per neutralizzare la soluzione fino a un pH di 7,4.Mantenere la soluzione sul ghiaccio e verificare il pH con una striscia reattiva. Successivamente, mescolare le linee cellulari transgeniche di mieloma multiplo con le cellule mesenchimali umane. Ora centrifugare la miscela cellulare in provette da 15 millilitri a 1000 G per cinque minuti, scartare il soprannatante e, utilizzando una pipetta P1000, risospendere il pellet in un millilitro della miscela fredda di collagene.Utilizzando una punta da P 100, trasferire immediatamente aliquote da 30 microlitri della miscela su paraffina sterile. In una piastra da coltura a 24 pozzetti, lasciare polimerizzare la miscela per 30 minuti a 37 gradi Celsius, formando così i corticosteroidi. Successivamente, ricoprire i corticosteroidi con un millilitro di mezzo preparato contenente diversi trattamenti.Ad esempio, un farmaco può essere applicato a diverse concentrazioni. Dopo 72 ore di incubazione a 37 gradi Celsius, documentare il PHE mediante microscopia stereoscopica fluorescente. Quindi, utilizzando pinze con ganasce larghe e piatte, trasferire ogni singolo steroido in un tubo da reazione per misurare l'espressione di GFP.In previsione di questa procedura, incubare le uova di pollo in un incubatore per uova a 37 gradi Celsius e 70% di umidità per tre giorni. Successivamente, aprire le uova e trasferire gli embrioni in barche di plastica quadrate sterili da 10 centimetri, contenenti piastrine per colture cellulari, per ottenere tassi di sopravvivenza più elevati degli embrioni di pollo nella coltura ex ovo. Utilizzare barche di plastica invece di piastre per tessuti da 10 centimetri.Inoltre, sterilizzare e pretrattare con barche lunghe contenenti PBS prima dell'uso. Continuare l'incubazione delle uova ex ovo per altri sei giorni, durante i quali si svilupperà la membrana corioallantoinica (CAM). Preparare ora le cellule di mieloma multiplo e le cellule stromali PHE come nella procedura precedente, ma in una piastra a sei pozzetti; quindi, utilizzando pinze, trasferire lo steroide, come su piante, sulla superficie non trattata della CAM, a circa due centimetri dall'embrione di embrioni di pollo di nove giorni.Posizionare quattro piante su ciascun embrione di pollo. Lasciare gli embrioni ex ovo con le piante all'interno dell'incubatrice per uova per cinque giorni. Successivamente, documentare gli xenotrapi mediante microscopia stereoscopica a fluorescenza.Dopo la documentazione, utilizzare forbici e pinze oftalmiche per rimuovere gli xenotrapi insieme a un certo quantitativo di tessuto circostante. Per misurare l'espressione di GFP o eseguire un'analisi immunohistochimica, trasferire ciascuno xenotrapo di mieloma multiplo o di sterioidi in 0,5 millilitri di RIPA contenente inibitori delle proteasi. Successivamente, utilizzare un omogeneizzatore su ghiaccio per frantumare i tessuti; una volta omogeneizzati, congelare e scongelare gli omogenati utilizzando azoto liquido e quindi un bagno termostatato a 37 gradi Celsius.Eseguire questa operazione tre volte, quindi centrifugare gli omogenati a quattro gradi Celsius per 20 minuti a 12.000 G e conservare i soprannatanti. Successivamente, diluire un'alcota di soprannatante da uno a 20 nel tampone dell'assay del kit ELIZA. Quindi misurare i livelli di GFP utilizzando anticorpi anti GFP biotinilati mediante un kit.Iniziare con una fissazione notturna degli xenotrapi escissi in paraformaldeide. Il giorno successivo, disidratare e includere gli xenotrapi fissati. Per prima cosa, caricarli nei cassette.Quindi spostare le cartucce attraverso una serie di alcol a concentrazione crescente. Lasciare ogni bagno per un'ora completa e terminare il processo con l'inclusione in paraffina. Successivamente, ottenere sezioni di xeno innesto di cinque micron utilizzando un microtomo rotativo da banco e fare essiccare le sezioni di paraffina raccolte su vetrini per tutta la notte a 56 gradi Celsius.Il giorno successivo, deparaffinizzare i preparati utilizzando una serie decrescente di alcol fino ad arrivare all'acqua bidistillata. Ogni preparato deve rimanere in ciascun bagno per soli 10 minuti. A questo punto, seguire il protocollo descritto per l'incubazione con gli anticorpi primari e secondari specifici ed eseguire la rivelazione colorimetrica mediante enzima e substrato; dopo la colorazione con ematina, montare i preparati con un mezzo di montaggio sintetico.Due mielomi multipli esprimenti EGFP. Le linee cellulari sono state stabilite e coltivate per tre giorni in presenza del farmaco. Le cellule tumorali trattate con bortezomib e steroidi sono state quindi visualizzate mediante l'espressione di GFP al microscopio stereoscopico a fluorescenza.La massa delle cellule tumorali dopo il trattamento farmacologico è stata quantificata dopo l'omogeneizzazione dei PHE e la misurazione del contenuto di EGFP mediante un saggio ELISA per GFP. In un altro esperimento, embrioni di pollo di tre giorni sono stati coltivati ex ovo per sei giorni. Al nono giorno, i PHE di cellule di mieloma multiplo sono stati trapiantati.Quattro innesti vegetali sono stati applicati su ciascun embrione. La sostanza bersaglio, il bortezomib, è stata applicata topicamente a una mol dopo cinque giorni; gli innesti vegetali hanno formato tumori rispetto ai controlli. Il bortezomib ha inibito la crescita delle cellule del mieloma multiplo negli innesti, in base alla visualizzazione della massa tumorale fluorescente.Un singolo innesto proveniente da tre animali diversi è stato quindi escisso, omogeneizzato e successivamente misurato mediante saggio GFP Eliza. Rispetto ai controlli, il tessuto trattato con bortezomib presentava una massa cellulare mielomatosa significativamente inferiore. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come eseguire esperimenti in cui le cellule tumorali di interesse vengono coltivate nell'uovo di pollo per analizzare la crescita tumorale, la genesi e l'invasione nel tessuto dell'ospite dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del mieloma multiplo per esplorare composti o farmaci innovativi in un organismo modello facile da gestire, che è indispensabile per i test preclinici dei farmaci.

establishment-human-multiple-myeloma-xenograft-model-chicken-to-study

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.

L&#39;analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

Questo video dimostra la procedura di iniezione endovenosa di cellule tumorali nel sistema vascolare della membrana corioallantoica di pollo per generare un modello di metastasi tumorali CAM. Le cellule iniettate alla fine formano colonie sparse di singole cellule tumorali, consentendo lo studio dell'invasione e delle metastasi del cancro.

Iniezione endovenosa di cellule tumorali nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo: una procedura per stabilire un modello di cancro della membrana corioallantoica per studiare l'invasione e le metastasi del cancro

Xenotrapianti tumorali umani in topi immunodeficienti sono strumenti preziosi per studiare biologia del cancro. Sono descritti i protocolli specifici per generare xenotrapianti sottocutanei e intraepatiche da cellule di carcinoma epatocellulare umani o frammenti di tumore. Rigenerazione epatica indotta da epatectomia parziale in topi riceventi si presenta come una strategia per facilitare l'attecchimento intraepatica.

Generazione di sottocutaneo e intraepatica umane carcinoma epatocellulare xenotrapianti in topi immunodeficienti

La tecnica istituita per inoculare ortotopici xenotrapianti carcinoma vescicale invasivo primarie richiede laparotomia e la mobilitazione della vescica. Questa procedura infligge significativa morbilità sui topi, è tecnicamente difficile e richiede molto tempo. Abbiamo quindi sviluppato una alta precisione, approccio percutaneo utilizzando guida ecografica.

Mini-Invasiva Istituzione di murini ortotopico vescica Xenotrapianti

La membrana corioallantoidea del pulcino (CAM) è immunodeficiente e altamente vascolarizzata, il che la rende un modello naturale in vivo di crescita tumorale e angiogenesi. In questo protocollo, descriviamo un metodo affidabile per la crescita di tumori di carcinoma epatocellulare (HCC) tridimensionali e vascolarizzati utilizzando il test CAM.

Il<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare

Il cancro alla prostata è la seconda causa più comune di decessi correlati al cancro negli Stati Uniti. Un modello di cancro ortotopico fornisce un approccio utile per comprendere la biologia del cancro alla prostata e per valutare l'efficacia dei regimi terapeutici. Questo protocollo descrive in dettaglio i passaggi necessari per stabilire un modello murino di cancro alla prostata ortotopico.

Pre-clinica ortotopico Modello murino di Human cancro alla prostata

Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche è una malattia senza un modello animale completo per un'indagine preclinica approfondita. Questo protocollo illustra due nuovi modelli animali per la malattia: il modello di topo ortotopicamente impiantato e il modello a membrana corioallantoica del pollo, che dimostrano entrambe metastasi polmonari simili a casi clinici.

Confrontando il modello di carcinoma a cellule renali a celle chiare metastatico stabilito nel rene del topo e sulla membrana coroallantoica del pollo

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

Questo protocollo descrive in ovo xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) B e T derivate da pazienti, che si verifica 4 giorni dopo l'iniezione.

Nell'Ovo Xenotrapianto di cellule di leucemia linfoblastica acuta (ALL) derivate da pazienti (PDX-ALL)

Scopri come stabilire un modello di xenotrapianto di mieloma multiplo umano nel pollo per studiare la crescita tumorale, l'invasione e l'angiogenesi. Questo metodo consente lo screening preclinico di farmaci antitumorali.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e langiogenesi (Video) | JoVE Journal

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l'angiogenesi

Esplora altri video