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L'obiettivo generale del seguente esperimento è applicare questo modello di dormienza in vitro per studiare i meccanismi molecolari e cellulari e generare ipotesi da verificare in modelli in vivo più complessi dal punto di vista biologico. Ciò si ottiene coltivando cellule tumorali del seno positive agli estrogeni in piastre di coltura tissutale codificate in fibrina in condizioni di densità congenica, in cui le loro interazioni avvengono principalmente con il substrato e non tra loro. Come secondo passaggio, uno stato di dormienza viene attivato in alcune delle cellule positive agli estrogeni, sostenuto e mantenuto da FGF2 e fibronectina, rappresentativo delle cellule tumorali del seno nel midollo osseo.

Successivamente, il sistema viene perturbato aggiungendo anticorpi, inibitori, peptidi o acidi nucleici, al fine di interrompere vari aspetti fenotipici e molecolari delle cellule dormienti e determinarne il ruolo nel mantenimento dello stato di quiescenza. I risultati mostrano il numero e l'aspetto delle colonie in crescita e di quelle dormienti, ottenuti trattando le cellule incubate con FGF due su piastre rivestite di fibronectina. Questo metodo può contribuire a chiarire quali vie di segnalazione, molecole di adesione o altri specifici meccanismi molecolari siano responsabili dello sviluppo e del mantenimento della quiescenza nelle cellule tumorali del cancro al seno dipendenti dagli estrogeni localizzate nel microambiente del midollo osseo.

Per iniziare, aspirare il mezzo di coltura dalle piastre che presentano una confluenza di circa il 50% con linee cellulari CF sette e lavarle con PBS preriscaldato. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-EDTA 0,25 disciolta in DMEM, mezzo con elevata concentrazione di glucosio e privo di siero fetale bovino. Incubare le piastre da uno a quattro minuti a 37 gradi Celsius, finché le cellule iniziano a staccarsi.

Una volta che le cellule si staccano dalla piastra e iniziano a formare una sospensione di cellule singole, rompere eventuali aggregati cellulari rimanenti aspirando e dispensando più volte con una pipetta da due millilitri. Se dopo quattro minuti di tripsina persistono ancora aggregati cellulari, scartare le cellule e preparare nuove cellule di coltura; le cellule che rimangono aderenti tra loro dopo quattro minuti potrebbero introdurre errori durante il conteggio del numero di colonie. Piastrare le cellule trattate con tripsina e risospendere a 1.500 cellule per millilitro in mezzo di coltura. Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per mescolare delicatamente la sospensione cellulare aspirando e dispensando con cautela; contare le cellule e verificare che la sospensione sia composta principalmente da cellule singole, utilizzando un contatore cellulare automatico.

Questo può anche essere eseguito manualmente utilizzando una camera di conteggio al microscopio a contrasto di fase. Prelevare quindi tre millilitri della sospensione cellulare e distribuire un millilitro in due dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti rivestita con fibronectina, uno alla volta. Per ottimizzare la distribuzione spaziale delle cellule, assicurarsi di pipettare la sospensione al centro del pozzetto e di non sottoporre la piastra ad ulteriori movimenti prima che le cellule si depositino e aderiscano.

Reintrodurre la sospensione cellulare rimanente nella miscela cellulare principale e mescolare nuovamente le cellule prima di prelevare altri tre millilitri. Questa procedura ridurrà la variabilità del numero di cellule, poiché queste sedimentano continuamente nel tubo e la pipettatura deve essere eseguita rapidamente per distribuire i grandi volumi cellulari, in quanto lasciare le cellule in sospensione a temperatura ambiente e concentrazione di CO2 modulerebbe il loro potenziale congenico. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Questo è considerato il giorno meno uno.

Nella cronologia dell'esperimento. Nel giorno zero del saggio, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo fresco o di mezzo fresco contenente 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti. Il piccolo numero di cellule in una pozzetta dopo sei giorni non avrà un impatto significativo sulla composizione di nutrienti o citochine né sul pH del mezzo originale.

Al terzo giorno, aggiungere 100 microlitri di una soluzione contenente 10 x la concentrazione finale prevista di un agente perturbante, come un inibitore della PI tre chinasi, LY 2 9 4 0 0 2, un controllo negativo LY 3 0 3 5 1 1 o un controllo del mezzo, all'uno millilitro di mezzo già presente nelle pozzette, e lasciare che le soluzioni si mescolino per diffusione. Riposizionare la piastra nell'incubatore per altri tre giorni. Al sesto giorno, sciogliere lo 0,1% di violetto cristallo in una soluzione di etanolo al due percento e borato di sodio 10 millimolare.

A pH nove, aspirare quindi il mezzo dalle pozzette e aggiungere un millilitro di soluzione di violetto cristallo in ciascuna pozzetta per 20 minuti. Preparare la stazione di lavaggio posizionando un secchio di ghiaccio nel lavandino e facendo scorrere continuamente acqua nel secchio; lavare le piastre immergendole nell'acqua con le aperture delle pozzette rivolte verso il basso, a un angolo acuto, all'interno del secchio. Inclinare la piastra a un angolo orizzontale una volta immersa in acqua, in modo che le aperture delle pozzette siano rivolte verso il basso.

Quindi inclinare la piastra in modo da formare un angolo acuto e rimuoverla con un movimento delicato e continuo. Ripetere l'immersione due o tre volte finché l'acqua sul fondo delle pozzette non appare più blu. Successivamente, posizionare le piastre a testa in giù sui fazzoletti di carta sul banco di lavoro per farle asciugare tutta la notte.

Una volta asciutta, posizionare la piastra sotto un microscopio a contrasto di fase invertito e contare il numero di colonie in crescita e di colonie dormienti in ogni pozzetto. A un ingrandimento di 40 x, considerare come colonie in crescita quelle formate da più di 30 cellule e come colonie dormienti quelle composte da 12 cellule o meno. Qui di seguito è mostrato l'aspetto tipico di una colonia in crescita e di una colonia dormiente.

Le colonie in crescita contengono più di 30 cellule, mentre le colonie dormienti contengono 12 cellule o meno, che risultano molte volte più grandi rispetto alle cellule in crescita, con elevati rapporti citoplasma/nucleo, in assenza di aggiunta di FGF due alla coltura. Le colonie sono rappresentate principalmente da clone in crescita. In presenza di FGF due, la stragrande maggioranza delle clone è dormiente; l'effetto di altri agenti può tuttavia essere valutato utilizzando questo sistema. In questo caso, due agenti perturbanti, a concentrazioni precedentemente determinate, sono stati aggiunti ai pozzetti al terzo giorno del saggio Congenico.

La figura mostra un'inibizione preferenziale delle linee cellulari quiescenti da parte dell'inibitore della chinasi PI 3 9 4 0 2, ma nessun effetto da parte del controllo negativo LY 3 0 3 511. Questi esperimenti possono essere utilizzati per comprendere meglio gli elementi che regolano la quiescenza e la resistenza alla terapia. In questo caso, le cellule quiescenti sopravvissute trattate con l'inibitore della chinasi PI 3 sono diventate più piccole, di aspetto dendritico, hanno perso il loro aspetto allargato e apparivano in difficoltà.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire questo saggio congenico per la coltivazione di cellule in stato di quiescenza, di come perturbare le cellule aggiungendo inibitori specifici o agenti perturbanti una volta stabilita la quiescenza e di come quantificare l'effetto degli agenti perturbanti. Questo saggio può essere utilizzato per valutare sia risultati quantitativi che qualitativi, contando le colonie quiescenti o misurando un numero qualsiasi di eventi ultrastrutturali, immunofenotipici o molecolari nelle cellule quiescenti e perturbate. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con i vostri esperimenti.