Name: Un In Vitro Dormienza Modello di estrogeno-sensibili cancro al seno nel midollo osseo: Uno strumento per gli studi molecolari del meccanismo e ipotesi Generation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri un modello in vitro di dormienza per il cancro al seno estrogeno-sensibile nel midollo osseo. Questo metodo permette di studiare i meccanismi molecolari e generare ipotesi per test in vivo.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

1. clonogenica <ol><li> Preparare una singola sospensioni di cellule di linee cellulari di cancro al seno estrogeno-dipendenti MCF-7 e T47D cellule utilizzando la procedura descritta di seguito <ol><li> Aspirare il mezzo di coltura (DMEM / 10% di calore inattivato siero fetale bovino / glutammina e pen / strep) da un tessuto piatto le colture 10 cm, non confluenti superiore al 50% con MCF-7 o cellule T-47D. Risciacquare con PBS. Incubare con tripsina / EDTA 0,25% 2,21 mM disciolto in DMEM alto glucosio a 37 ° C per 1-4 min. </li><li> Controllare cellule a intervalli di 1 minuto sotto un microscopio a contrasto di fase per garantire una distribuzione singola cellula. Risospendere le cellule con una pipetta 2 ml pipettando su e giù parecchie volte per interrompere il contatto cellula-cellula per ottenere un, lo stato della cella singola quasi invariabile. </li><li> Continuare a incubare cellule in tripsina a 37 ° C per un massimo di 4 minuti se si osserva grumi di cellule dopo soli 2 minuti di incubazione. Non utilizzare queste cellule per studi clonogeniche se rimangono aderenti alla postaach altro dopo 4 minuti di tripsinizzazione perché sarà introdotto errore nella resa numero di colonia. NOTA: Se le cellule sono raggruppate, il numero di colonie formate rifletterà il prodotto di un minor numero di cellule rispetto al numero incubata. Se le cellule sono eccessivamente tripsinizzate, il loro potenziale clonogenico può essere ridotta. </li><li> Preparare una sospensione di cellule singole di 1500 cellule / ml terreno di coltura per 24 pozzetti, o meno, (+ 500 cellule / ml, a seconda del tipo di cellula o numero di passaggio), per diluizioni seriali in un tubo master contenente l&#39;intero volume necessario per tutte le variabili nell&#39;esperimento. NOTA: L&#39;obiettivo è una densità cellulare finale di 800 cellule / cm 2 (gamma di circa 500 a 1.100 cellule / cm 2). L&#39;obiettivo è di produrre circa 100 + 50 colonie, che permette relativamente facile conteggio, impedisce affollamento e permette colonie sufficienti per portare a differenze statistiche significative quando le colonie sono aumentati o diminuiti di perturba sperimentalezioni. </li></ol></li><li> Incubare le cellule a clonogenica densità con procedura descritta di seguito <ol><li> Incubare le cellule in pozzetti quadruplice su 24 piastre fibronectina rivestite pozzetti ad una densità di 1.500 clonogenica cellule / pozzetto da un master singolo tubo sospensione cellulare di 1500 cellule / ml. Triturare il terreno contenente celle con una pipetta da 5 ml mediante l&#39;elaborazione di 3 ml e l&#39;erogazione di 1 ml di mezzo in ognuna delle 2 pozzi. NOTA: fibronectina rivestite piastre devono essere acquistati già rivestito da un fornitore commerciale. Piastre rivestimento esterno di una qualità controllata, risultati processo automatizzato in una superficie irregolare inadatto per questo dosaggio. </li><li> Mescolare la sospensione pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml, elabora 3 ml di sospensione cellulare e riempire 2 pozzi con 1 ml ciascuno. Riempire solo 2 pozzetti alla volta da una pipetta. Restituisce il volume rimanente nella pipetta alla sospensione cellulare nel tubo principale, risospendere le cellule ancora pipettando su e giù e redige un altro 3 ml per riempire altri 2 wells con 1 ml ciascuno. NOTA: La continua miscelazione del tubo principale è necessario perché le cellule saranno continuamente sedimentare. Elaborazione di volume sufficiente per riempire solo 2 pozzetti è necessario aggiungere il numero di cellule simili a ciascun pozzetto perché cellule sedimentare nella pipetta pure. </li><li> Lavorare rapidamente per distribuire i grandi volumi di cellule perché le cellule che consentono di sedersi in sospensione a temperatura ambiente e la concentrazione di CO 2 si modula loro clonogeniche potenziali (osservazioni non pubblicate). </li><li> Ottimizzare la distribuzione spaziale delle cellule durante l&#39;atto della loro pipettando nei pozzetti per saggi colonia. Farlo lentamente pipettando la sospensione contenente la concentrazione cellulare finale nel mezzo del pozzo. Non sottoporre il piatto per favorire il movimento prima di cellule si depositano sul fondo. Non agitare la piastra perché miscelazione circolare efficacemente centrifugare le cellule al perimetro delle ben creando alte densità di cellulari e colonie confluenti innumerevoli a 6 giorni. NOTA: Non mescolare se non necessario in quanto questo è meno desiderabile di alcuna miscelazione a tutti dopo l&#39;introduzione del volume con le cellule in sospensione. Se è necessario miscelare cellule, farlo spostando la piastra posteriore e indietro in direzioni perpendicolari mentre poggia su una superficie piana. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C 5% di CO 2 senza cambiamento dei media per 6 giorni. Il piccolo numero di cellule in un pozzo dopo 6 giorni non influisce significativamente la composizione nutritiva o citochina né il pH del mezzo originale. </li><li> Progettare il decorso del test nel modo seguente: incubare celle su fibronectina rivestite substrati del giorno 1. Sostituire medio esistente con 1 ml di media fresco o mezzo fresco contenente 10 ng / ml il giorno 0. cellule macchia il giorno 6, come di seguito 2 FGF- in 1.4). Condurre eventuali perturbazioni sperimentali il giorno 3, come di seguito al punto 1.3). </li></ol></li><li> Perturbazioni set up sperimentale di molecolare di segnalazione o di Adesione Molecole <ol><li> Il giorno 3, aggiungere 10056; l di una soluzione contenente 10 volte della concentrazione finale previsto dell&#39;agente perturbante al mezzo 1 ml nei pozzetti. Non mescolare. Continuare ad incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 per altri 3 giorni. NOTA: Agenti perturbante può includere una varietà di inibitori e agenti di blocco delle molecole di adesione, recettori o altre proteine ​​di superficie, gli inibitori di vie intracellulari di segnalazione, molecole, fattori, cofattori o proteine ​​strutturali, che possono svolgere un ruolo nel sostenere lo stato dormiente. </li><li> Colonie Stain il giorno 6, come segue. </li></ol></li><li> Colonie Stain <ol><li> Cellule Macchia dopo 6 giorni in coltura con un fresco 0,1% viola cristallo nel 2% di etanolo / 10 mM borato di sodio (pH 9,0) soluzione. Aspirare e aggiungere la soluzione al cristalvioletto uno ml a ciascun pozzetto per 20 min. </li><li> Lavare le piastre immergendole con le aperture e rivolti verso il basso con un angolo acuto in un secchio di ghiaccio traboccante di rubinetto in esecuzione continuadell&#39;acqua nel lavandino. Inclinare la piastra per un angolo orizzontale, una volta sott&#39;acqua, bene l&#39;apertura verso il basso, e poi inclinare indietro ad angolo acuto quando si toglie in un unico movimento fluido delicato. </li><li> Ripetere l&#39;immersione 2 o 3 volte fino a quando l&#39;acqua sul fondo dei pozzetti non è blu. Lavaggi vigorosi possono rimuovere le cellule o colonie che sono meno aderente causa di intervento sperimentale, che aumenta notevolmente l&#39;errore nel conteggio e dati. </li><li> Lastre secche durante la notte mettendo a testa in giù sul asciugamani sul banco accanto ai loro corrispondenti coperture etichettati. </li></ol></li><li> Conta Colonie <ol><li> Contare il numero di crescita e dormienti colonie in ogni bene dopo 6 giorni di incubazione, colorazione e asciugatura. Contare le colonie in modo ottimale a 40X con lo zoom in un microscopio a contrasto di fase invertito. Contare colonie di&gt; 30 cellule come cresce e colonie di 12 o meno celle, con l&#39;aspetto morfologico di dimensioni molto grandi rispetto alle cellule in crescita, grande Expacitoplasma nded con ampio citoplasma al nucleo rapporti, mostrati in figura 1 7,15. NOTA: Gruppi di 13-29 cellule non sono normalmente considerati come non sono molto frequenti nei saggi di dormienza semplici. Essi possono essere conteggiati se perturbazioni spostano il potenziale di crescita sia cellule in crescita o dormienti. Questi risultati saranno poi bisogno di essere correlato con significato biologico. </li></ol></li></ol> 2. clonogenica Incubazione per immunofluorescenza Studies <ol><li> Regolare il numero di cellule a circa 7,500-8,000 cellule / pozzetto in 6 pozzetti, per corrispondere alla cella i numeri / superficie analoga a 24 esperimenti così. </li><li> Posizionare un giro, sterile, fibronectina rivestite fodera in ogni base ben di 6 piatti e per studi di imaging prima dell&#39;aggiunta delle cellule. Cellule Pipettare in 3 ml di volume in ciascun pozzetto 2 pozzetti alla volta a concentrazioni delineati, come descritto per gli esperimenti clonogeniche sopra in 1.2). </li><li> Incubare le celluleper 6 giorni, come sopra in 1.2.4 e 1.2.5. Aggiungere fattori perturbanti il ​​giorno 3 a 10x concentrazioni in 300 volumi microlitri, come descritto nelle procedure di saggio colonia in 1.3). </li><li> Cellule Stain il giorno 6 con anticorpi per cellulare molecole di adesione come integrine α4, α5, α6, β1, β3, per esempio, di adesione focale molecole complesse FAK, paxillina e vinculina, per esempio, proteine ​​coinvolte nella motilità quali α-tubulina, per esempio, di segnalazione membri pathway come fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, per esempio, o qualsiasi altra proteina che è la destinazione di ricerca per il suo ruolo in dormienza, utilizzando tecniche standard per la diretta o indiretta immunofluorescenza. <ol><li> Rimuovere i vetrini con una pinza giorno 6. Fissare in acetone / metanolo 1: 1 a -20 ° C per 20 min e aria secca. Un fissativo alternativa, ad esempio paraformaldeide, possono essere utilizzati, se necessario. Cellule permeabilize con 0,1% Triton X-100, 0,1% di citrato di sodio per 2 min fo il rilevamento di antigeni intracellulari. Lavare le cellule con PBS. </li><li> Per la colorazione immunofluorecence indiretta, scivoli blocco per 1 ora a temperatura ambiente con il 5% BSA o con 10% di siero preimmune dalla specie in cui si genera l&#39;anticorpo secondario. </li><li> Incubare per una notte a 4 ° C con anticorpi primari a cellula molecole di adesione, molecole complesse focali, segnalando membri pathway o qualsiasi altra proteina che è l&#39;obiettivo di ricerca per il suo ruolo in dormienza diluito per diluizioni specifiche consigliate dal produttore in PBS 0,1% TRITON X -100. </li><li> Lavare 3 volte con PBS. Incubare coprioggetto con anticorpi fluoroforo-coniugato a temperatura ambiente per 2 ore. Come esempio, Alexa Fluor 488 asino anti-topo IgG anticorpo può essere utilizzato per rilevare anticorpi primari monoclonali murini. Mount coprioggetto lato della cella verso il basso su vetrini utilizzando un agente antifade con Dapi. Sigillare i perimetri con smalto. </li><li> Per immunofluorescenza diretta, effettuare la BSAil blocco di cui sopra al punto 2.4.2), incubare con anticorpo primario fluoroforo coniugato notte a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS. Incubare i vetrini con un agente antifade e Dapi e sigillare con smalto. </li><li> Vassoi diapositive Coprire con un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per l&#39;imaging e la fotografia in qualsiasi momento fino a diverse settimane più tardi. Visualizzare e fotografia cellule utilizzando qualsiasi sistema di imaging microscopici fluorescenza dotato di una fotocamera a 1,000x ingrandimenti. </li><li> Per fibrillare actina colorazione, i vetrini blocco in 1% di albumina di siero bovino (BSA) per 30 min e incubare in BODIPY FL-Phallacidin (verde) o Rodamina phalloidin (rosso) a temperatura ambiente per 20 min. Aggiungi un agente antifade e sigillare come sopra. </li></ol></li></ol> 3. clonogenica incubazione per studi molecolari <ol><li> Western Blot <ol><li> Incubare ER + di cancro al seno cellule MCF-7 o T47D a densità clonogenici di 20.000 cellule / 60 mm Piastra e 50.000 cellule mm piastra / 100 su fibronecstagnato piastre a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Incubare le cellule a densità leggermente superiori di 75.000 cellule / 100 millimetri piatto per studi molecolari richiedono quantità mg per le proteine ​​da lisati. Usa fino a dieci targhe per punto sperimentale per raccogliere sufficienti proteine ​​per studi molecolari con macchie occidentali o per l&#39;isolamento di RNA per Northern blot. </li><li> Numero delle cellule in gel a base di carico è un complemento necessario per confrontare l&#39;espressione della proteina in cellule di crescita e dormienti molto diverse dimensioni. Raccogliere le cellule per trypsinizing e contare una aliquota in un emocitometro nello 0,2% Trypan Blue per la preparazione di lisati per Western blot invece di raschiare via le cellule con una sola lama bordo. </li><li> Cellule centrifuga a 10.000 xg per 2 minuti, togliere i media per aspirazione, aggiungere 200 microlitri tampone di lisi, sonicazione le cellule in tampone di lisi e determinare la concentrazione di proteine. </li><li> Calcolare la quantità di proteina per cellula dividendo la resa di proteine ​​per il numero di celluleche hanno generato tale importo. Caricare il lisato in ogni pozzetto di gel di poliacrilammide separati che rappresenta sia) quantità equivalenti di proteine ​​e b) le quantità di proteine ​​che rappresentano il numero di cellule equivalenti. Almeno 25 ug di proteine ​​deve essere caricato in ciascun pozzetto. NOTA: Questo permetterà il confronto tra crescita e dormienti cellule, che sono significativamente differenti in termini di dimensioni e di proteine ​​(Figura 1). </li></ol></li><li> Citometria A Flusso <ol><li> Raccogliere le cellule da 100 lastre mm da tripsinizzazione, come in 3.1 e analizzare con la fluorescenza delle cellule attivi standard (FACS) i protocolli utilizzando primaria o secondaria colorazione immunofluorescenza per antigeni intracellulari o extracellulari, come indicato in 2.4. NOTA: Rimozione cellule da piastre di coltura tissutale mediante tripsinizzazione non influenza la concentrazione di proteine ​​di membrana come determinato mediante etichettatura anticorpo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Supportato dal Dipartimento della Difesa Grants DAMD17-01-C-0343 e DAMD17-03-1-0524, la Commissione di Stato del New Jersey su Cancer Research 02-1140-CCR-E0 e Ruth Estrin Goldberg Memorial per la Ricerca sul Cancro (RW)

Il nostro modello è composto da diversi elementi chiave della dormienza nel midollo osseo. Consiste di estrogeni cellule sensibili, che sono del tipo destinato a rimanere sospeso nel osseo per prolungati periodi 10, si compone di fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo, FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dal stroma del midollo osseo e pesantemente depositato nella matrice extracellulare del midollo osseo 31,32 e l&#39;incubazione delle cellule con densità de...

Le cellule tumorali del seno metastatizzano al midollo osseo prima che la malattia è rilevabile 1, non appena i piccoli tumori si sviluppano vasi sanguigni 2,3. Il processo metastatico è rapido ma inefficiente. Le cellule entrano i nuovi vasi sanguigni rapidamente a milioni al giorno 4 ma pochi sopravvivono il viaggio in organi distanti 5. Tuttavia, alcuni sopravvivono micrometastasi nel midollo e può essere trovato come cellule singole o piccoli grumi di cellule in aspirati di midollo osseo da pazienti di nuova diagnosi 1. Queste cellule resistono chemioterapia adiuvante, che viene somministrato per lo scopo di eliminarli 6. Questa resistenza è dotato, sostanzialmente, dalla sopravvivenza segnalazione avviata da interazioni con il midollo microambiente osseo 7,8. Micrometastasi possono essere trovati in circa un terzo delle donne con carcinoma mammario localizzato e rappresentano un indicatore indipendente di sopravvivenza quando analizzato da analisi univariata 9. Alcuni micrometastases sono la crescita iniziata, ma i modelli di ricorrenza dipendono dal tipo di cellulare. I pazienti con carcinoma mammario triplo negativo tendono a ripresentarsi tra 1 a 4 anni, suggerendo scarso controllo sullo stato dormiente. Altri tipi di cellule, tra cui ER / PR + cellule, possono rimanere dormienti per un massimo di 20 anni, con un costante, continuo tasso di recidiva 10. Mentre le differenze di dormienza firme espressione genica tra ER- linee di cellule del seno e tumori ER + e riflettono diversi potenziali dormienza 11, le interazioni con il midollo osseo stroma probabilmente rappresentano un contributo significativo alla dormienza. Lo studio di dormienza in vivo è estremamente difficile perché micrometastasi sono rari e vengono oltrepassati dalle cellule ematopoietiche di oltre 10 6 -fold. Quindi, i modelli interessati devono essere generati che forniscono dati in vitro che possono suggerire meccanismi e generare ipotesi verificabili in vivo. Un certo numero di modelli dormienza, compreso mathemodelli matico 12,13, modelli in vitro 7,8,14,15, modelli in vivo di xenotrapianto 16, combinazioni di in vitro e modelli di xenotrapianto 17,18 e tumorali e metastasi spontanee modelli 19, hanno dato qualche informazione in dormienza cellula tumorale 20 . Ognuno di questi modelli hanno i loro limiti e sono di se stessi in primo luogo utile per generare ipotesi per quanto riguarda la segnalazione molecolare e interazioni che governano dormienza da testare in modelli più biologicamente rilevanti. Con l&#39;obiettivo generale di definire i meccanismi molecolari di dormienza, le interazioni con il microambiente che si traduce in arresto del ciclo, ridifferenziazione e resistenza terapeutica e dei meccanismi che provocano recidiva + cellule ER, abbiamo sviluppato un modello in vitro che fornisce selezionato elementi rilevanti del stromale microambiente 7. Questo modello, mentre relativamente scarsa nella sua componenti, è sufficientemente robusto per permettere agli investigatori di ricavare i meccanismi molecolari specifici che influenzano le funzioni significative di dormienza. Questi esperimenti generano ipotesi che possono essere testati direttamente in vivo. Il modello si basa su alcuni elementi chiave che abbiamo dimostrato di essere rilevanti in dormienza. Essi comprendono l&#39;uso di cellule di carcinoma mammario estrogeno-dipendenti, coltura di cellule ad una densità clonogenico dove loro interazione è principalmente con il substrato e componenti solubili del mezzo, un substrato fibronectina e la presenza del fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF-2) nel mezzo. Abbiamo caratterizzato i meccanismi che regolano il sistema in vitro, compresa l&#39;induzione di arresto del ciclo cellulare da FGF-2 21, mediata attraverso TGFβ 22, la sopravvivenza di segnalazione attraverso PI3 chinasi e ERK 7,8 8 e differenziazione morfogenica ad un fenotipo epiteliale, che dipendeva inattivazione RhoA, integrina45; 5β1 upregulation e legatura dei stromale fibronectina per la sopravvivenza 7,15 (Figura 1). Gli effetti in vitro del ciclo cellulare di FGF-2 in cellule MCF-7 cominciano a concentrazioni almeno un log inferiore a 10 ng / ml 21,23. Il razionale era basato sul controllo temporale del FGF-2 governa mammaria morfogenesi duttale, espansione ciclica e recessione in un certo numero di sistemi di mammifero 24-27. Abbiamo dimostrato che FGF-2 induce la differenziazione, tra cui morfogenesi duttale in coltura 3D 28, e che l&#39;espressione di FGF-2 sono generalmente perso con trasformazione maligna dei tumori umani 29. L&#39;espressione di FGR1 rimasto intatto nei carcinomi mammari intervistati 29 e MCF-7 cellule continuare ad esprimere tutte le 4 recettori FGF 30. Nel contesto di dormienza, FGF-2 è esportato da e pesantemente depositato sul midollo osseo stroma 31,32 dove funziona nella conservazione di cellule staminali ematopoietiche 33. Noi demonstrated che FGF-2 induce uno stato dormiente in ER + di cancro al seno cellule coltivate su substrati di fibronectina, anche abbondanti nel midollo, dove induce la differenziazione morfogenica 7. Nel modello, le cellule del cancro al seno sono la crescita inibita, inattivare Rho A attraverso la RhoGap GRAF, ridifferenziare ad un fenotipo epiteliale e ri-express integrine α5β1 lost con la progressione maligna. Si legano fibronectina attraverso l&#39;integrina α5β1 e attivano la sopravvivenza segnalando che rendono resistenti alla terapia citotossica 7,8,15 (Figura 1). L&#39;inibizione della Rho GTPasi classe è stato dimostrato in precedenza per indurre un fenotipo dormiente 34. Qui ci illustrerà le procedure specifiche che permetteranno ai ricercatori di stabilire il modello e studiare i meccanismi molecolari e cellulari specifiche che disciplinano dormienza di cellule ER + di cancro al seno. Negli esperimenti qui presentati per illustrare l&#39;utilizzo del modello, Abbiamo mirato il percorso PI3K (Figura 1B) con un inibitore di Akt e un inibitore della PI3K e tutti i membri della famiglia Rho (Figura 1B) con un inibitore pan-Rho e Rho chinasi (ROCK) inibitore.

<table><tbody><tr><td>Celle MCF-7</td><td>Celle ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>ATCC</td><td>HTB-123</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectin 24 pozzetti Clear Flat Bottom Piastra multipozzetto trattata</td><td>con TC Corning</td><td>354411</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectina 60 mm Piastre</td><td>di coltura Corning</td><td>354403</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat Fibronectina 100 mm Piastre di coltura</td><td>Corning</td><td>354451</td><td></td></tr><tr><td>BD BioCoat 22x22mm #1 Vetrino coprioggetti con applicazione uniforme di fibronectina umana</td><td>Piastra per</td> coltura tissutale Corning <td>354088</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetti</td><td>CellTreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Glucosio medio-alto 10X Polvere</td><td>Corning Life Sciences</td><td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino inattivato al calore</td><td>Fonte di siero internazionale</td><td>FB02-500HI</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina/2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina, 100x,</td> liquido <td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>FGF umano ricombinante R</td><td>& base D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore Akt (1L6-idrossimetil-chiro-inositolo-2-(R)-2-O-metil-3-O-ottadecil-sn-glicerocarbonato)</td><td>CalBiochem</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>LY294002&nbsp;</td><td>CalBiochem</td><td>19-142</td><td>Chenical PI3K inibitore</td></tr><tr><td>C3 transferasi&nbsp;</td><td>Il citoscheletro</td><td>CTO3</td><td>inibisce RhoA, RhoB e RhoC, ma non le GTPasi correlate come Cdc42 o Rac1</td></tr><tr><td>Y-27632 dicloridrato.</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>129830-28-2</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY FL-fallacidina (verde)&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>B607</td><td>Fluorocromo per colorazione fibrillare actina</td></tr><tr><td>BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (rosso)&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>R415</td><td>Fluorocromo per colorazione fibrillare actina</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Asino anticorpo IgG di topo, reagente ReadyProbes</td><td>Sonde molecolari</td><td>R37114</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant con DAPI&nbsp;</td><td>Sonde molecolari</td><td>P-36931</td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; dormienza modello di estrogeno-sensibili cancro al seno nel midollo osseo: uno strumento per gli studi molecolari del meccanismo e ipotesi generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

Lo studio della dormienza del cancro al seno nel midollo osseo è un'impresa eccezionalmente difficile a causa della complessità delle interazioni delle cellule dormienti con il loro microambiente, la loro rarità e l'eccessivo eccesso di cellule ematopoietiche. A tal fine, abbiamo sviluppato un modello clonogenico 2D in vitro della dormienza di cellule di carcinoma mammario sensibili agli estrogeni nel midollo osseo. Il modello è costituito da alcuni elementi chiave necessari per la dormienza. Questi includono 1) l'uso di cellule di carcinoma mammario sensibili agli estrogeni, che sono il tipo che probabilmente rimane dormiente per periodi prolungati, 2) incubazione di cellule a densità clonogenica, in cui l'interazione strutturale di ciascuna cellula è principalmente con il substrato, 3) fibronectina, un elemento strutturale chiave del midollo e 4) FGF-2, un fattore di crescita abbondantemente sintetizzato dalle cellule stromali del midollo osseo e fortemente depositato nella matrice extracellulare. Le cellule incubate con FGF-2 formano cloni dormienti dopo 6 giorni, che consistono di 12 o meno cellule che hanno un aspetto piatto distinto, sono significativamente più grandi e più sparse rispetto alle cellule in crescita e hanno un ampio rapporto citoplasma/nucleo. Al contrario, le cellule incubate senza FGF-2 formano principalmente colonie in crescita costituite da >30 cellule relativamente piccole. Le perturbazioni del sistema con anticorpi, inibitori, peptidi o acidi nucleici il giorno 3 dopo l'incubazione possono influenzare significativamente vari aspetti fenotipici e molecolari delle cellule dormienti a 6 giorni e possono essere utilizzate per valutare il ruolo di molecole, fattori o vie di segnalazione localizzate nella membrana o nella sopravvivenza delle cellule dormienti. Pur riconoscendo la natura in vitro del test, può funzionare come uno strumento molto utile per raccogliere informazioni significative sui meccanismi molecolari necessari per l'insediamento e la sopravvivenza delle cellule dormienti. Questi dati possono essere utilizzati per generare ipotesi da testare in modelli in vivo.

<html> Gli esperimenti sono stati condotti per ricapitolare il test. L&#39;andamento temporale dell&#39;esperimento è mostrato in Figura 2A. Le cellule vengono incubate a densità clonogenica giorno -1, si aggiunge FGF-2 in un mezzo fresco al giorno 0 e le cellule sono coltivate fino al giorno 6, quando sono macchiati e le colonie sono contate. Eventuali perturbazioni al sistema vengono somministrati il giorno 3 in 100 volumi microlitri a 10x concentrazioni finali desiderato. Figura 2B mo...

Abbiamo sviluppato un modello in vitro di dormienza nel midollo osseo per cellule di cancro al seno sensibili agli estrogeni. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l'uso del modello per lo studio della biologia molecolare e cellulare della dormienza e per la generazione di ipotesi per successivi test in vivo.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormienza Modello di estrogeno-sensibili cancro al seno nel midollo osseo: Uno strumento per gli studi molecolari del meccanismo e ipotesi Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è applicare questo modello di dormienza in vitro per studiare i meccanismi molecolari e cellulari e generare ipotesi da verificare in modelli in vivo più complessi dal punto di vista biologico. Ciò si ottiene coltivando cellule tumorali del seno positive agli estrogeni in piastre di coltura tissutale codificate in fibrina in condizioni di densità congenica, in cui le loro interazioni avvengono principalmente con il substrato e non tra loro. Come secondo passaggio, uno stato di dormienza viene attivato in alcune delle cellule positive agli estrogeni, sostenuto e mantenuto da FGF2 e fibronectina, rappresentativo delle cellule tumorali del seno nel midollo osseo.Successivamente, il sistema viene perturbato aggiungendo anticorpi, inibitori, peptidi o acidi nucleici, al fine di interrompere vari aspetti fenotipici e molecolari delle cellule dormienti e determinarne il ruolo nel mantenimento dello stato di quiescenza. I risultati mostrano il numero e l'aspetto delle colonie in crescita e di quelle dormienti, ottenuti trattando le cellule incubate con FGF due su piastre rivestite di fibronectina. Questo metodo può contribuire a chiarire quali vie di segnalazione, molecole di adesione o altri specifici meccanismi molecolari siano responsabili dello sviluppo e del mantenimento della quiescenza nelle cellule tumorali del cancro al seno dipendenti dagli estrogeni localizzate nel microambiente del midollo osseo.Per iniziare, aspirare il mezzo di coltura dalle piastre che presentano una confluenza di circa il 50% con linee cellulari CF sette e lavarle con PBS preriscaldato. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina-EDTA 0,25 disciolta in DMEM, mezzo con elevata concentrazione di glucosio e privo di siero fetale bovino. Incubare le piastre da uno a quattro minuti a 37 gradi Celsius, finché le cellule iniziano a staccarsi.Una volta che le cellule si staccano dalla piastra e iniziano a formare una sospensione di cellule singole, rompere eventuali aggregati cellulari rimanenti aspirando e dispensando più volte con una pipetta da due millilitri. Se dopo quattro minuti di tripsina persistono ancora aggregati cellulari, scartare le cellule e preparare nuove cellule di coltura; le cellule che rimangono aderenti tra loro dopo quattro minuti potrebbero introdurre errori durante il conteggio del numero di colonie. Piastrare le cellule trattate con tripsina e risospendere a 1.500 cellule per millilitro in mezzo di coltura. Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per mescolare delicatamente la sospensione cellulare aspirando e dispensando con cautela; contare le cellule e verificare che la sospensione sia composta principalmente da cellule singole, utilizzando un contatore cellulare automatico.Questo può anche essere eseguito manualmente utilizzando una camera di conteggio al microscopio a contrasto di fase. Prelevare quindi tre millilitri della sospensione cellulare e distribuire un millilitro in due dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti rivestita con fibronectina, uno alla volta. Per ottimizzare la distribuzione spaziale delle cellule, assicurarsi di pipettare la sospensione al centro del pozzetto e di non sottoporre la piastra ad ulteriori movimenti prima che le cellule si depositino e aderiscano.Reintrodurre la sospensione cellulare rimanente nella miscela cellulare principale e mescolare nuovamente le cellule prima di prelevare altri tre millilitri. Questa procedura ridurrà la variabilità del numero di cellule, poiché queste sedimentano continuamente nel tubo e la pipettatura deve essere eseguita rapidamente per distribuire i grandi volumi cellulari, in quanto lasciare le cellule in sospensione a temperatura ambiente e concentrazione di CO2 modulerebbe il loro potenziale congenico. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Questo è considerato il giorno meno uno.Nella cronologia dell'esperimento. Nel giorno zero del saggio, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo fresco o di mezzo fresco contenente 10 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti. Il piccolo numero di cellule in una pozzetta dopo sei giorni non avrà un impatto significativo sulla composizione di nutrienti o citochine né sul pH del mezzo originale.Al terzo giorno, aggiungere 100 microlitri di una soluzione contenente 10 x la concentrazione finale prevista di un agente perturbante, come un inibitore della PI tre chinasi, LY 2 9 4 0 0 2, un controllo negativo LY 3 0 3 5 1 1 o un controllo del mezzo, all'uno millilitro di mezzo già presente nelle pozzette, e lasciare che le soluzioni si mescolino per diffusione. Riposizionare la piastra nell'incubatore per altri tre giorni. Al sesto giorno, sciogliere lo 0,1% di violetto cristallo in una soluzione di etanolo al due percento e borato di sodio 10 millimolare.A pH nove, aspirare quindi il mezzo dalle pozzette e aggiungere un millilitro di soluzione di violetto cristallo in ciascuna pozzetta per 20 minuti. Preparare la stazione di lavaggio posizionando un secchio di ghiaccio nel lavandino e facendo scorrere continuamente acqua nel secchio; lavare le piastre immergendole nell'acqua con le aperture delle pozzette rivolte verso il basso, a un angolo acuto, all'interno del secchio. Inclinare la piastra a un angolo orizzontale una volta immersa in acqua, in modo che le aperture delle pozzette siano rivolte verso il basso.Quindi inclinare la piastra in modo da formare un angolo acuto e rimuoverla con un movimento delicato e continuo. Ripetere l'immersione due o tre volte finché l'acqua sul fondo delle pozzette non appare più blu. Successivamente, posizionare le piastre a testa in giù sui fazzoletti di carta sul banco di lavoro per farle asciugare tutta la notte.Una volta asciutta, posizionare la piastra sotto un microscopio a contrasto di fase invertito e contare il numero di colonie in crescita e di colonie dormienti in ogni pozzetto. A un ingrandimento di 40 x, considerare come colonie in crescita quelle formate da più di 30 cellule e come colonie dormienti quelle composte da 12 cellule o meno. Qui di seguito è mostrato l'aspetto tipico di una colonia in crescita e di una colonia dormiente.Le colonie in crescita contengono più di 30 cellule, mentre le colonie dormienti contengono 12 cellule o meno, che risultano molte volte più grandi rispetto alle cellule in crescita, con elevati rapporti citoplasma/nucleo, in assenza di aggiunta di FGF due alla coltura. Le colonie sono rappresentate principalmente da clone in crescita. In presenza di FGF due, la stragrande maggioranza delle clone è dormiente; l'effetto di altri agenti può tuttavia essere valutato utilizzando questo sistema. In questo caso, due agenti perturbanti, a concentrazioni precedentemente determinate, sono stati aggiunti ai pozzetti al terzo giorno del saggio Congenico.La figura mostra un'inibizione preferenziale delle linee cellulari quiescenti da parte dell'inibitore della chinasi PI 3 9 4 0 2, ma nessun effetto da parte del controllo negativo LY 3 0 3 511. Questi esperimenti possono essere utilizzati per comprendere meglio gli elementi che regolano la quiescenza e la resistenza alla terapia. In questo caso, le cellule quiescenti sopravvissute trattate con l'inibitore della chinasi PI 3 sono diventate più piccole, di aspetto dendritico, hanno perso il loro aspetto allargato e apparivano in difficoltà.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire questo saggio congenico per la coltivazione di cellule in stato di quiescenza, di come perturbare le cellule aggiungendo inibitori specifici o agenti perturbanti una volta stabilita la quiescenza e di come quantificare l'effetto degli agenti perturbanti. Questo saggio può essere utilizzato per valutare sia risultati quantitativi che qualitativi, contando le colonie quiescenti o misurando un numero qualsiasi di eventi ultrastrutturali, immunofenotipici o molecolari nelle cellule quiescenti e perturbate. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Un modificato 3-D in vitro del sistema è presentato in cui caratteristiche di crescita di diverse linee cellulari tumorali in membrana basale ricostituita in correlazione con il comportamento inattivo o proliferativa delle cellule tumorali in un sito secondario...

Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l&#39;interruttore di crescita metastatica

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Modello in vivo per la prova Effetto dell&#39;ipossia sul tumore metastasi

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.

Modello di matrice extracellulare tridimensionale dell'osso per Osteosarcoma

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Scopri un modello in vitro di dormienza per il cancro al seno estrogeno-sensibile nel midollo osseo. Questo metodo permette di studiare i meccanismi molecolari e generare ipotesi per test in vivo.

Un In Vitro Dormienza Modello di estrogeno-sensibili cancro al seno nel midollo osseo: Uno strumento per gli studi molecolari del meccanismo e ipotesi Generation (Video) | JoVE Journal

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