Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell'arteria cerebrale media nei topi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare la neuroprotezione dopo un precondizionamento ipossico ripetitivo o RHP, misurando simultaneamente il volume dell'infarto e l'integrità della barriera ematoencefalica. Questo risultato si ottiene sottoponendo i topi a nove esposizioni ipossiche stocastiche, variabili sia per durata che per intensità, al fine di garantire una protezione neurovascolare contro l'ictus. Successivamente, l'ictus viene indotto nel topo e seguito dall'iniezione di blu di Evans.

Il blu di Evans si lega selettivamente all'albumina e consente la quantificazione della rottura della barriera ematoencefalica successivamente alla soppressione dell'animale dopo l'iniezione. Il cervello viene asportato e colorato con TTC per quantificare il volume dell'infarto. I risultati mostrano benefici neuroprotettivi del precondizionamento ipossico ripetitivo nei topi dopo un ictus ischemico.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il condizionamento ipossico con singola esposizione, è che il RHP produce neuroprotezione per almeno otto settimane nei topi. Questo metodo di quantificazione doppia può rispondere a domande fondamentali nella ricerca sull'ictus, ad esempio come misurare simultaneamente i volumi di infarto e la rottura della barriera ematoencefalica, anche se questo metodo può essere utilizzato per ottenere informazioni sull'ictus ischemico, il RHP può essere applicato anche ad altri stati patologici infiammatori sistemici e del sistema nervoso centrale. Per iniziare, dividere i topi in due gruppi.

Il gruppo RHP, che riceve esposizioni di 8% e 11% di ossigeno, e il gruppo di controllo, che riceve contemporaneamente esposizioni di 21% di ossigeno, rimuovono il coperchio superiore del filtro di ogni gabbia e posizionano la gabbia, con cibo e bottiglie d'acqua intatte, nelle camere collegate ai rispettivi serbatoi di ossigeno. Chiudere e fissare il coperchio della camera. Aprire la valvola principale dei serbatoi e impostare il flusso iniziale per ogni camera di induzione a due litri al minuto (LPM).

Dopo cinque minuti di esposizione, ridurre la portata a un LPM per il resto dell'esposizione. Alla fine dell'esposizione, ridurre la portata a zero LPM e chiudere la valvola del gas. Per i serbatoi.

Aprire i coperchi delle camere e sostituire il coperchio superiore con filtro su ogni gabbia. Posizionare le gabbie nell'allevamento standard fino alla successiva esposizione ipossica. Spruzzare ogni camera di induzione con un disinfettante e deodorante dopo ogni utilizzo.

Esponi sia i topi RHP che i controlli alla stessa ora del giorno nel corso delle due settimane del protocollo. Quindi esegui un'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media o A-T-M-C-A-O come descritto nel testo. L'iniezione di EB deve essere effettuata 22 ore dopo la riperfusione e deve circolare nel torrente ematico per due ore prima dell'eutanasia e della colorazione NTTC.

Preparare la quantità di EB necessaria per l'iniezione. Quindi aspirare la quantità desiderata di soluzione a temperatura ambiente in una siringa per insulina da 0,3 cc. Con un ago da 29 gauge, immobilizzare il topo utilizzando un contenitore con fondo piatto.

Tenere la coda in modo che la vena laterale sia rivolta verso l'alto. Le vene laterali si trovano su entrambi i lati della linea centrale della coda. Tenere la punta della coda per mantenere fermo il topo durante l'iniezione.

Inserire l'ago nella vena a una profondità di circa tre-cinque millimetri. Senza perforare la vena, iniettare tutto il colorante nell'arco di un minuto. Se la soluzione viene iniettata correttamente nella vena, si dovrebbe riscontrare una resistenza minima applicando pressione sulla siringa.

Confermare un'amministrazione sistemica venosa riuscita di EB attraverso un immediato cambiamento di colore degli arti caudali e degli occhi del topo. Rimuovere l'ago dalla coda ed esercitare delicatamente pressione con garza pulita per arrestare l'emorragia. Iniziare il conteggio del tempo.

Quando la pelle del topo diventa blu, lasciare circolare l'EB per due ore in modo che penetri nella barriera ematoencefalica indebolita. La perfusione e la colorazione con TTC devono avvenire 24 ore dopo la riperfusione, ovvero 24 ore dopo la T-M-C-A-O e due ore dopo la somministrazione di EB; sacrificare l'animale con un sovradosaggio di isoflurano in una piccola camera di induzione. La perfusione deve iniziare immediatamente dopo il sacrificio per minimizzare l'autolisi, che inizia in assenza di ossigeno dopo la morte.

Fissare rapidamente l'animale su una piattaforma di polistirolo con gli arti anteriori bloccati attraverso le zampe. Praticare un'incisione laterale attraverso la parete addominale a partire dalla linea mediana appena al di sotto della gabbia toracica. Tagliare con attenzione il diaframma per esporre il cuore.

Avviare la pompa di perfusione a una portata di cinque millilitri al minuto utilizzando una siringa da 60 cc riempita con soluzione salina tamponata al fosfato ghiacciata 0,01 molare o PBS, collegata a un ago per infusione alato da 27 gauge. Inserire la punta dell'ago di circa 0,5 centimetri nel ventricolo sinistro del cuore e praticare un'incisione nell'atrio destro. Durante la perfusione, il sangue venoso progressivamente diluito dovrebbe fuoriuscire dall'atrio fino a quando non appare sangue venoso. Far passare attraverso il cuore 30 millilitri di PBS 0,01 molare incolore privo di sangue.

Successivamente, aggiungere cinque millilitri di soluzione di TTC in 20 provette trasparenti per scintillazione. Immediatamente dopo la perfusione, decapitare gli animali ed estrarre i cervelli utilizzando piccole forbici e, se necessario, una spatola. Verificare che l'emisfero controlaterale all'arteria cerebrale media occlusa appaia pallido, senza evidente fuoriuscita di EB o edema.

Successivamente, versare PBS in una matrice cerebrale in acrilico progettata per ottenere sezioni coronali dello spessore di 1,0 millimetro di un cervello di topo. Posizionare il cervello con la faccia dorsale verso l'alto all'interno della matrice e versare immediatamente PBS sul cervello. Mantenere il cervello umido.

Rimuovere i bulbi olfattivi inserendo una lama in acciaio inossidabile dello spessore di 0,21 millimetri nella seconda fessura a partire dal lato rostrale della matrice. Quindi rimuovere il cervelletto inserendo una lama nella quarta fessura a partire dal lato caudale della matrice. Inserire una lama nella fessura centrale tra quelle rimanenti nella matrice.

Inserire quindi le lame rimanenti dividendole uniformemente attraverso il tessuto residuo per garantire la distribuzione più omogenea possibile del tessuto durante il taglio. Una volta inserite tutte le lame, aggiungere una o due gocce di PBS al cervello per inumidirlo. Successivamente, rimuovere le lame una alla volta dalla matrice, iniziando dalla regione rostrale.

Conservare le prime sette fette per l'analisi con TTC. Dopo T-M-C-A-O, utilizzare una piccola spatola per trasferire con attenzione le fette dalla lama al vial contenente il TTC. Una volta che tutte le sezioni sono nel vial, chiuderlo con il tappo e collocarlo in un bagno di acqua calda fino a quando le sezioni diventano rosa.

Ruotare delicatamente il flacone nel bagno, se necessario, per evitare sovrapposizioni delle sezioni, che potrebbero causare una colorazione non uniforme. Successivamente, smaltire il TTC e versare una soluzione di paraformaldeide al 4% nel flacone per coprire le sezioni cerebrali. Questo passaggio interrompe la reazione chimica del TTC.

Disporre immediatamente i tagli su un vetrino in vetro pulito di dimensioni una per tre pollici e orientarli da rostrale a caudale mentre vengono posizionati sul vetrino. Scansionare il vetrino. Utilizzando uno scanner standard, impostare la risoluzione a un minimo di 600 DPI per l'analisi dell'immagine.

Assicurarsi di includere il nome dell'animale e un righello metrico nell'immagine scannerizzata. Infine, capovolgere il vetrino e scannerizzare il lato posteriore per verificare che tutti i dati siano stati raccolti. RHP riduce i volumi di infarto del 46% rispetto ai topi di controllo, ma non ha alcun effetto sul gonfiore emisferico derivato dai dati TTC negli stessi animali.

RHP riduce la compromissione della barriera emato-encefalica definita dalla fuoriuscita di Blu di Evans, normalizzata rispetto all'emisfero controlaterale; colorazioni TTC rappresentative sia dai soggetti trattati con RHP che dai controlli esposti all'ossigeno al 21%. I topi sono mostrati con i corrispondenti volumi di infarto e la fuoriuscita di Blu di Evans indicati sotto ciascun campione. L'emisfero ipsilaterale è quello ischemico del cervello, mentre il controlaterale è il lato non colpito.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di iniettare il blu di Evans 22 ore dopo la fusione e permettergli di circolare per due ore prima del sacrificio dell'animale, successivamente al suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca preclinica sull'ictus per esplorare i meccanismi di protezione endogena dall'ictus nei topi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come misurare l'effetto neuroprotettivo dell'RHP attraverso la doppia quantificazione dell'integrità della barriera ematoencefalica e dei volumi di infarto.