Name: Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Scopri la selezione automatica delle dimensioni del gel per migliorare la qualità delle librerie di sequenziamento di nuova generazione da campioni di acqua ambientale. Questo metodo automatizzato aumenta il throughput e la riproducibilità.

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Questo lavoro è stato finanziato da Genome BC, Genome Canada e Coastal Genomics. Gli autori ringraziano Kirby Cronin e Michael Chan per il loro aiuto nella raccolta e nell'elaborazione dei campioni. Vorremmo anche ringraziare Thea Van Rossum e la dottoressa Fiona Brinkman per l'assistenza bioinformatica.

1. Raccolta Acqua e Filtrazione <ol><li> Raccogliere campioni di acqua dolce provenienti da vari siti (Figura 1). Passare campioni attraverso una serie di filtri: 1 micron filtro, filtro 0,2 micron, e 30 kDa taglio del filtro a flusso tangenziale sistematicamente eucariotica separata, particelle di dimensioni batteriche e virali, rispettivamente. Nota: Solo la purificazione e analisi del materiale recuperato sui 0,2 micron filtri (batteri a vita libera) è descritta in questa relazione, ma approcci simili possono essere utilizzati per le altre particelle recuperate dai filtri. </li></ol> 2. Concentrazione batterica, estrazione e purificazione del DNA <ol><li> Rimuovere il filtro a membrana 0,2 micron (s) dal sistema di filtrazione dell&#39;acqua (diagramma schematico, Figura 2). Piegare il filtro 0,2 micron disco a metà e posizionarlo in un tubo da 50 ml con il lato aperto in alto. Aggiungere 5 ml di soluzione tampone fosfato 1x (PBS) e 0,01% Tween, pH 7.4 inil tubo. Se più di un filtro viene utilizzato durante il processo di impiegare un tubo diverso per filtro. Tubo negozio (s) con filtro a 4 ° C fino elaborato. In caso contrario, passare al punto 2.2. </li><li> Rimuovere il filtro 0,2 micron membrana dal tubo 50 ml con una pinza sterile. Filtro Place (s) su una piastra di Petri (lasciare il tampone PBS nel tubo). <ol><li> Con pinze sterili e forbici sterili, tagliate il filtro in piccole strisce (1 cm x 1 cm). Disinfettare pinze e forbici immergendo nel 70% isopropanolo, asciugandosi con un DNA di superficie decontaminante e risciacquo con acqua ultrapura di tipo 1 tra i diversi campioni. </li></ol></li><li> Posizionare il filtro tagliato a striscioline di nuovo nello stesso tubo da 50 ml. Aggiungere 10 ml di PBS 1x e 0,01% Tween, pH 7.4 al filtro quindi c&#39;è un totale di 15 ml di tampone nella provetta 50 ml. </li><li> Aggiungere 6 perle di tungsteno pulite (3 mm di diametro) in ciascun tubo 50 ml, coprire il tubo con Parafilm, e vortex energicamente per 20 minuti (utilizzare 50 ml tubi adattatore vortex). Se multiple filtri vengono elaborati da un campione, trasferimento e piscina tutto l&#39;omogeneizzato in una provetta pulita 50 ml. Centrifugare le provette a 3.300 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet e aliquote cellule batteriche (~ 1 ml Aliquote) in 1,7 ml microprovette. Si noti che ci saranno 5 provette da microcentrifuga per campione. </li><li> Centrifugare le provette da microcentrifuga a 10.000 xg per 10 min, e rimuovere la maggior parte del surnatante fino a ~ 200 microlitri mark. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C, o procedi per estrarre DNA batterico utilizzando un kit di isolamento di DNA disponibile in commercio come da istruzioni del produttore. Durante l&#39;uso batterica estrazione del DNA sia PBS o acqua come controllo di estrazione negativo e E. coli come controllo di estrazione positivo. </li><li> Poiché DNA da più tubi vengono estratti, piscina sub-aliquote parallele dello stesso campione in una provetta 2 ml. Poi condurre / N precipitazione O utilizzando una soluzione composta da 0,1volumi di 3 M acetato di sodio, 2 volumi di etanolo al 100%, e 5 ml di 5 mg / mL acrilammide lineare. Mescolare bene e conservare i campioni a -80 ° C. </li><li> Centrifugare alla massima velocità (17.000 xg) per 30 minuti a 4 ° C. Lavare pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%, aria secca in un armadio biosicurezza per non più di 5 min e risospendere pellet di DNA in 34 ml di 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. Nota: acrilamide lineare aiuterà a visualizzare pellet di DNA dopo la O / N precipitazione. </li><li> Determinare la quantità di DNA e di qualità utilizzando una sensibilità elevata fluorescenza nucleico test acido quantificazione e uno spettrofotometro microvolumi, rispettivamente, seguendo le istruzioni del fabbricante (vedi tabella dei Materiali). Nota: Se più campioni vengono preparati al momento, una fluorescenza test acido nucleico ultrasensibile per quantificare dsDNA e basata su piastra fluorimetro / spettrofotometro può essere usato al posto. </li></ol> 3. DNA Biblioteca Preparazione <ol><li&gt; Normalizza DNA batterico genomico estratto da campioni di acqua ad una concentrazione di ~ 0,2 ng / ml. </li><li> Enzimaticamente frammento uno nanogrammi di DNA batterico utilizzando un metodo basato trasposone-(tagmentation). Aggiungere adattatore e index sequenze sul DNA frammentato seguendo le istruzioni del produttore. Soggetto tagmented campioni a 12 cicli di PCR, come indicato nelle istruzioni del produttore, a quel punto gli indici di sequenziamento sono incorporati. </li></ol> 4. Automated Gel Selezione Size <ol><li> Salta standard di post-PCR clean-up step descritto nelle istruzioni del produttore (Vedi Tabella dei Materiali). Formato selezionare campioni post-PCR direttamente utilizzando una piattaforma automatizzata di selezione del formato a base di gel. <ol><li> Aggiungere 3,5 ml di tampone di caricamento per ogni campione. </li><li> Dopo il protocollo del produttore, caricare i campioni alla workstation elettroforesi, specificando un target formato-selezione di 500-800 bp, in un estratto di 300 mlvolume di ioni, con un 1,5% di agarosio cassette pre-cast. </li><li> Concentrare il materiale in uscita prima (300 ml), fino a 25 ml di etanolo tramite precipitazione. Nota: In alternativa, utilizzare la workstation elettroforesi per automatizzare la concentrazione per un maggior numero di campioni tramite piastra di filtraggio e del collettore di aspirazione. <ol><li> Precipitare il volume di eluizione grezzo utilizzando 0,1 volumi di 3 M acetato di sodio, 2 volumi di etanolo 100% e 5 ml di 5 mg / mL acrilammide lineare. Mescolare bene, posto i campioni a -80 ° CO / N. Centrifugare i campioni a 17.000 xg per 30 min. </li><li> Eliminare surnatanti e procedere a lavare pellet di DNA con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare i campioni di nuovo a 17.000 xg per 30 min, scartano surnatanti, aria secca, e infine risospendere pellet di DNA in 25 ml di 10 mM Tris-Cl, pH 8,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Opzionale) Utilizzare 1 ml di dimensioni librerie DNA selezionato con la piattaforma di selezione formato gel automatico per fare un cinquediluizione -fold con soluzione tampone Tris-EDTA, pH 8.0. Analizzare le librerie con uno strumento elettroforesi capillare basato su chip per analizzare dsDNA qualità secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Biblioteca Normalizzazione e Sequencing <ol><li> Procedere per normalizzare i campioni utilizzando perline di normalizzazione della biblioteca (inclusi nel kit di preparazione biblioteca basato transposon-) come descritto nella guida di preparazione del produttore. <ol><li> In alternativa, misura librerie dsDNA usando un&#39;alta sensibilità fluorescente nucleico dosaggio acido quantificazione, seguita riunendo a rapporti equimolari per raggiungere una concentrazione finale di dsDNA 2 nM. Procedere a denaturare librerie utilizzando 10 ml di biblioteche in pool e 10 ml di 0,2 N NaOH, incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Diluire librerie denaturati mediante tampone di ibridazione (incluso con il kit di preparazione a base transposon-) per un volume finale di 1 ml e la concentrazione di 11:05. </li></ol></li><li> Caricare il campiones in una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione seguendo i protocolli standard di sequenziamento del produttore. </li></ol>

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</ol>

Jared R. Slobodan e Matthew J. Nesbitt entrambi titolari di azioni di Coastal Genomics, una società di proprietà privata British Columbia offre la tecnologia Ranger.

La presenza di dimeri adattatori e raggruppamento di piccole dimensioni inserto preferenzialmente essere sequenziati in piattaforme attuali rappresentano una diminuzione delle rese utilizzabili e sotto-utilizzo della capacità di 15 dell&#39;apparecchiatura. L&#39;uso di metodi branello battitori combinati con un approccio basato trasposone-per preparare librerie può comportare più di taglio DNA rispetto ad altri metodi di estrazione 4,5. Tuttavia, tutti i metodi di estrazione e biblioteca preparazi...

La metagenomica prevede il sequenziamento di tutto il materiale genetico in un campione per caratterizzare le comunità microbiche presenti. Si tratta di un processo complesso e costoso che prevede la conversione degli acidi nucleici estratti in librerie di DNA, seguita dal sequenziamento di nuova generazione. Le librerie di alta qualità sono essenziali per massimizzare l'output dei dati e un'analisi metagenomica accurata. I campioni ambientali, come i campioni d'acqua, spesso pongono sfide significative alla generazione di librerie di alta qualità, a causa delle basse quantità di DNA che possono anche essere degradate1-3 e della presenza di inibitori della PCR4-6. 
Le librerie di alta qualità sono idealmente costituite da segmenti più lunghi di DNA all'interno di una gamma ristretta di lunghezze. Al fine di massimizzare la quantità di dati utili generati per ogni ciclo di sequenziamento, la lunghezza del DNA nella libreria dovrebbe essere almeno pari alla lunghezza massima di lettura del metodo di sequenziamento utilizzato. Quando si utilizza una tecnologia di sequenziamento per sintesi come l'Illumina MiSeq, la dimensione dei frammenti di DNA influisce sull'efficienza con cui i cluster vengono generati sulla cella di flusso. Ad esempio, quando una libreria contiene frammenti di DNA sia più corti che più lunghi, quelli più corti saranno sovrarappresentati nei dati di sequenziamento7,8. Al contrario, una libreria con frammenti di DNA di dimensioni simili sarà rappresentata proporzionalmente nei dati di sequenziamento. Molti kit di preparazione delle librerie utilizzano metodi basati sulla legatura per aggiungere adattatori ai frammenti di DNA e la selezione delle dimensioni è necessaria per rimuovere i dimeri adattatori che non contengono un inserto9,10. Esistono numerosi metodi11,12 per raggiungere questo obiettivo, ma l'unica tecnica che fornisce i risultati più coerenti è la separazione elettroforetica del DNA seguita dal recupero delle lunghezze desiderate di DNA13,14. Questo processo può essere eseguito manualmente per un numero ridotto di campioni, ma quando si tratta di elaborare centinaia di campioni, sono necessarie soluzioni automatizzate. Le piattaforme attualmente disponibili per la selezione automatizzata delle dimensioni dei gel sono a bassa produttività e sono necessarie nuove piattaforme per elaborare un gran numero di campioni per il sequenziamento. La tecnologia Ranger può essere integrata con le stazioni di lavoro esistenti per la manipolazione dei liquidi per consentire l'uso dell'elettroforesi su gel di agarosio per la selezione delle dimensioni e per scopi analitici su una scala che soddisfa l'ambiente odierno ad alta produttività.

<table><tbody><tr><td>Pompa peristaltica Masterflex P/S Serie 1400</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1400-1620</td><td></td></tr><tr><td>0,2 & micro; m Supor Membrana</td><td>VWR</td><td>CA28143-969</td><td>Pall Corporation, Ann Harbor, MI</td></tr><tr><td>Perline in carburo di tungsteno 3 mm (200)</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico 70%</td><td>Jedmon Products</td><td>825751</td><td>Healthcare Plus</td></tr><tr><td>DNA away</td><td>VWR</td><td>7010</td><td>Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA</td></tr><tr><td>Sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q</td><td>Fisher Scientific</td><td>ZMQS6VF0Y</td><td>Merck Millipore. Questo sistema è stato interrotto.</td></tr><tr><td>20x PBS pH 7.5</td><td>VWR</td><td>E703-1L</td><td>Amresco, Inc., Solon, OH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td>Fisher chemicals</td></tr><tr><td>Adattatore Vortex per 2 (50&nbsp; ml) tubi</td><td>VWR</td><td>13000-V1-50</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2, 120&nbsp; V (Modello G560)</td><td>VWR</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td></tr><tr><td>Beckman Centrifuga</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd</td><td>Modello J-6B</td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer Powersoil Kit di isolamento del DNA</td><td>VWR</td><td>12855-100</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Adattatore Vortex per 24 provette (1,5-2 ml)</td><td>VWR</td><td>13000-V1-24</td><td>MoBio, Carlsbad, CA</td></tr><tr><td>Centrifuga Microfuge 18</td><td>Beckman Coulter</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nimbus Seleziona workstation con Ranger Technology</td><td>Hamilton Robotics</td><td>92720-01</td><td>Include la stazione di lavoro per la manipolazione dei liquidi e il kit di reagenti Ranger Tech (hardware per elettroforesi)</td></tr> integrato <tr><td></td><td>Coastal Genomics</td><td>CG-10600-150-12-21</td><td>Include tampone di caricamento e cassette Alcool</td></tr><tr><td>etilico (anidro)</td> <td>Alcoli commerciali</td><td>P016EAAN</td><td>Greenfield Etanolo</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide lineare (5&nbsp; mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9520</td><td>Ambion</td></tr><tr><td>Eppendorf centrifuga refrigerata</td><td>Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd.</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Tampone EB (250 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spettrofotometro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>fluorimetro Life Technologies</td><td>Q32857</td><td>Invitrogen. Questo prodotto è fuori produzione.</td></tr><tr><td>Kit di analisi Qubit dsDNA HS</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>Reagente DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chip DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Agilent 2011</td><td>Agilent Technologies</td> Kit di preparazione del campione di DNA <td>Nextera</td><td></td></tr><tr><td>XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td></td></tr><tr><td>Kit di indice Nextera XT</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti MiSeq v2 (500 cicli)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Miseq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

automated gel selection size per migliorare la qualità delle biblioteche di sequenziamento di nuova generazione preparato da campioni di acqua ambientale

Automated Gel Size Selection to Improve the Quality of Next-generation Sequencing Libraries Prepared from Environmental Water Samples

Il sequenziamento di nuova generazione di campioni ambientali può essere impegnativo a causa della quantità e della qualità variabili del DNA in questi campioni. Per ottenere risultati ottimali dal sequenziamento di nuova generazione, sono necessarie librerie di DNA di alta qualità. I campioni ambientali come l'acqua possono avere una bassa qualità e quantità di DNA, nonché contaminanti che co-precipitano con il DNA. I processi meccanici ed enzimatici coinvolti nell'estrazione e nella preparazione della libreria possono danneggiare ulteriormente il DNA. La selezione della dimensione del gel consente la purificazione e il recupero di frammenti di DNA di dimensioni definite per applicazioni di sequenziamento. Tuttavia, questa attività è una delle fasi più dispendiose in termini di tempo nel flusso di lavoro di preparazione della libreria di DNA. Il protocollo qui descritto consente l'automazione completa del caricamento del gel di agarosio, l'analisi elettroforetica e il recupero di frammenti di DNA mirati. 
In questo studio, descriviamo un approccio ad alto rendimento per preparare librerie di DNA di alta qualità da campioni di acqua dolce che possono essere applicate anche ad altri campioni ambientali. Abbiamo utilizzato un approccio indiretto per concentrare le cellule batteriche da campioni ambientali di acqua dolce; Il DNA è stato estratto utilizzando un kit di estrazione del DNA disponibile in commercio e le librerie di DNA sono state preparate utilizzando un protocollo commerciale basato su trasposoni. Frammenti di DNA da 500 a 800 bp sono stati selezionati utilizzando la tecnologia Ranger, una stazione di lavoro automatizzata per elettroforesi. Il sequenziamento delle librerie di DNA selezionate per dimensioni ha dimostrato miglioramenti significativi nella lunghezza di lettura e nella qualità delle letture di sequenziamento.

Concentrazione DNA, e valutazione della qualità Concentrazioni DNA batterico variava ,01-0,11 ng ​​/ ml per campione dei vari siti di bacino (Tabella 1). DNA isolato da frazione batterica aveva A 260/280 e 260/230 A rapporti di 1,4-1,8 e 0,3-1,6 rispettivamente. Mentre alcuni dei coefficienti A 260/230 erano relativamente bassa, nessuna inibizione apparente è stata osservata nella biblioteca preparato e altre applicazioni a v...

Questo manoscritto descrive un approccio automatizzato di selezione delle dimensioni del gel per purificare i frammenti di DNA per il sequenziamento di nuova generazione. La tecnologia Ranger fornisce l'automazione completa dell'intero processo di caricamento del gel di agarosio, analisi elettroforetica e recupero di frammenti di DNA mirati, consentendo librerie di sequenziamento di nuova generazione ad alta produttività e di alta qualità.

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

Next-generation sequencing of environmental samples can be challenging because of the variable DNA quantity and quality in these samples. High quality DNA ...

In questo video viene illustrato l'utilizzo di uno strumento automatizzato per la selezione dimensionale dei gel al fine di ottenere letture migliorate nelle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione. In primo luogo, campioni di acqua ambientale vengono raccolti e fatti passare attraverso una serie di filtri per separare in modo sistematico particelle di dimensioni eucariotiche, batteriche e virali. I batteri trattenuti vengono ulteriormente concentrati mediante centrifugazione.Quindi il DNA batterico viene estratto. Il DNA estratto viene utilizzato per preparare librerie in cui adattatori e indici sono incorporati nel DNA frammentato. Il DNA viene quindi amplificato mediante PCR e i campioni sono caricati nella stazione di elettroforesi.I frammenti di DNA all'interno di un intervallo specifico vengono quindi selezionati automaticamente. L'analisi dei tracciati ottenuti mediante elettroforesi capillare su chip e ulteriori analisi bioinformatiche dimostrano che questo metodo produce quantità adeguate di frammenti di DNA per analisi successive, con un minimo assemblaggio di frammenti indesiderati inferiori a 200 paia di basi. Il vantaggio principale della stazione elettroforetica automatizzata o delle perle paramagnetiche e di altri sistemi commerciali è che consente una selezione più precisa e ristretta, nella quale fino a 96 campioni possono essere processati in un'unica corsa.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle comunità microbiche in campioni di acqua dolce, può essere applicato ad altri sistemi come acqua di mare, acque reflue in trattamento, campioni vegetali, suolo sedimentario o tappeti microbici, sostanzialmente a qualsiasi campione di DNA per il quale si desideri una selezione ristretta di dimensioni. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato frammenti corti nelle sequenze della piattaforma MySEQ. Abbiamo provato diverse strategie di selezione dimensionale, inclusi diversi tipi di para-beads e rapporti, nonché un approccio manuale di selezione dimensionale su gel.Successivamente abbiamo iniziato a collaborare con Coastal Genomics, una società privata della British Columbia che offre la tecnologia Ranger, dimostrandone la procedura. Oggi parteciperanno Michael Chan, tecnico di ricerca del mio laboratorio, Miguel Yi, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio, e Jared Sloan, un ingegnere di Coastal Genomics. In questo video descriveremo soltanto la purificazione e l'analisi del materiale recuperato sui filtri da 0,2 micron, principalmente batteri liberi, ma tenete presente che approcci simili possono essere utilizzati anche per le altre particelle recuperate dai filtri.Iniziare questa procedura raccogliendo 40 litri di campioni di acqua dolce da diversi siti ambientali in carboy da 20 litri sterilizzati. Filtrare preliminarmente i campioni in situ utilizzando un filtro in polipropilene a maglia da 105 micrometri. In questo caso, i campioni vengono raccolti da bacini idrografici influenzati da aree urbane e agricole.Dopo il prelievo, collocare i campioni in contenitori refrigerati e trasportarli in laboratorio. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo.Impostare un sistema di filtrazione costituito da un carboy per la raccolta del campione collegato, tramite una pompa peristaltica, a una capsula di campionamento da un micron "enviro check". Collegare la capsula di campionamento a un filtro a disco da 0,2 micron e questo a un filtro tangenziale da 30 kilodalton mediante una seconda pompa peristaltica. Accendere le pompe peristaltiche per far passare i campioni attraverso una serie di filtri; le cellule eucariotiche verranno isolate mentre passano attraverso la capsula di campionamento.La frazione batterica verrà isolata sul filtro a disco membranoso, mentre le particelle virali verranno isolate sul filtro a flusso tangenziale. Rimuovere il filtro a membrana da 0,2 micrometri o più filtri dal sistema di filtrazione dell'acqua. Successivamente, piegare il filtro a metà e inserirlo in un tubo da 50 millilitri.Con il lato aperto verso l'alto. Aggiungere cinque millilitri di PBS con tween al tubo. Se è stato utilizzato più di un filtro durante la filtrazione, usare un tubo diverso per ogni filtro.I filtri possono quindi essere conservati a quattro gradi Celsius oppure processati immediatamente come segue. Successivamente, utilizzando pinze sterili, rimuovere il filtro membranoso dal tubo da 50 millilitri e posizionarlo su una piastra di Petri con pinze sterili e forbici sterili. Tagliare il filtro in pezzi di un centimetro per un centimetro tra un campione e l'altro.Disinfettare gli strumenti immergendoli in isopropanolo al 70%, pulendoli con un decontaminante superficiale per DNA e quindi risciacquandoli con acqua ultrapura di tipo 1. Riposizionare i pezzi del filtro nello stesso tubo da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di PBS con tween per portare il volume totale del tampone a 15 millilitri, utilizzando pinze sterili.Aggiungere sei perle di tungsteno pulite, di tre millimetri di diametro, a ciascun tubo da 50 millilitri. Coprire il tubo con parafilm e vortexare vigorosamente per 20 minuti.Dopo aver agitato con il vortex, raccogliere tutte le sospensioni in un unico tubo pulito da 50 millilitri per ogni campione. Centrifugare i tubi a 3.300 ×g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet.In cinque millilitri di soluzione PBS, distribuire le cellule batteriche in aliquote di un millilitro in provette microcentrifuga da 1,7 millilitro e centrifugare in una microcentrifuga a 10.000 ×g per 10 minuti. Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta per rimuovere tutto il soprannatante tranne 200 microlitri. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius oppure procedere all'estrazione del DNA batterico utilizzando un kit commerciale per l'isolamento del DNA.Durante l'estrazione del DNA batterico, utilizzare come controllo negativo di estrazione PBS o acqua e come controllo positivo di estrazione e coli. Dopo la procedura di estrazione del DNA, unire gli aliquote dello stesso campione in un unico tubo da due millilitri in tampone tris 10 millimolare. Procedere quindi con una precipitazione notturna aggiungendo una soluzione composta da 10% di acetato di sodio tre molar, due volumi di etanolo al 100% e cinque microlitri di acrilamide lineare. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifugare i campioni a 17.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio e lasciare asciugare il pellet all'aria libera all'interno di una cappa a sicurezza biologica per non più di cinque minuti.Quindi risospendere il pellet di DNA in tris 10 millimolare. Determinare infine la quantità e la qualità del DNA eseguendo un saggio di quantificazione degli acidi nucleici fluorescente ad alta sensibilità, seguito da spettrometria a microvolume. Dopo aver determinato la quantità di DNA in ogni campione, aggiungere la quantità appropriata di acqua a ciascun tubo per portare la concentrazione a circa 0,2 nanogrammi per microlitro.Utilizzando un kit commercialmente disponibile, preparare una libreria di DNA costituita da frammenti indicizzati a partire da un nanogrammo di DNA batterico. In questo caso, si applica un metodo basato su trasposone, noto come mentazione, per frammentare contemporaneamente il DNA e incorporare sequenze adattatrici. Successivamente, si esegue la PCR per amplificare e indicizzare simultaneamente i campioni di ED, fornendo così barcode specifici su ciascun frammento e le sequenze necessarie per la formazione dei cluster, che possono essere lette dalla piattaforma di sequenziamento.Dopo il completamento della PCR, saltare il normale passaggio di purificazione post-PCR e aggiungere 3,5 microlitri di buffer di carico a ciascun campione per un volume totale di 28,5 microlitri. Trasferire quindi i campioni in una piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in una stazione di elettroforesi con una cassetta preformata di agarosio al 1,5% nell'interfaccia utente del software Ranger.Specifica un intervallo di selezione dimensionale compreso tra 500 e 800 paia di basi. Imposta il volume di estrazione a 300 microlitri. Avvia la corsa.La stazione di elettroforesi caricherà automaticamente i campioni nelle cassette aros. Successivamente viene applicata una tensione alle cassette e un sistema di imaging montato su un braccio meccanico viene utilizzato per identificare la posizione del DNA del campione all'interno degli aros durante tutta la corsa.Il software Ranger acquisisce immagini e, utilizzando standard interni, stima la posizione del bersaglio di dimensione selezionata in ogni campione. Dopo che i bersagli sono stati identificati, il software Ranger varia. La tensione applicata a ciascun campione serve a sincronizzare l'arrivo dei bersagli nei pozzetti di estrazione della cassetta.Infine, la stazione di elettroforesi aspira i bersagli in TBE dai pozzetti di estrazione e li dispensa in una nuova piastra a 96 pozzetti per concentrare il materiale grezzo in uscita, precipitando il volume grezzo dell'eluito mediante acetato di sodio ed etanolo con acrilamide lineare, lasciando in incubazione tutta la notte a meno 80 gradi Celsius. Centrifugare nuovamente i campioni a 17.000 ×g per 30 minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare i soprannatanti e procedere al lavaggio del pellet di DNA con un millilitro di etanolo al 70% ghiacciato, centrifugando.Centrifugare i campioni a 17.000 ×g per 30 minuti, scartare il soprannatante, essiccarli e infine risospendere il pellet di DNA in tris 10 millimolare cloruro; procedere alla normalizzazione dei campioni utilizzando le perle di normalizzazione per libreria, incluse nel kit di preparazione della libreria transpose on base. Infine, procedere al sequenziamento del DNA mediante una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione per ottenere letture più informative nelle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, migliorando la qualità delle librerie di sequenziamento.Sono stati prelevati campioni d'acqua in otto siti diversi del bacino idrografico e sono state preparate librerie di DNA indicizzate a partire dalla frazione batterica isolata, come mostrato in questo elettroferogramma. Le librerie di DNA generate da campioni di acqua dolce dopo la PCR, ma prima della selezione automatica per dimensione, erano composte da frammenti di dimensioni comprese tra 50 paia di basi e 3000 paia di basi. Dopo la selezione per dimensione effettuata mediante la piattaforma automatizzata ad alta capacità, i campioni presentavano un intervallo ristretto di frammenti di DNA compreso tra 500 e 800 paia di basi. Pertanto, l'utilizzo di questa piattaforma automatizzata di selezione per dimensione su gel ha permesso di ottenere rese adeguate e ha ridotto al minimo l'accumulo di frammenti indesiderati inferiori a 200 paia di basi.Il sequenziamento del DNA di questa libreria effettuato sul MiSeq in alluminio ha generato una densità di cluster di 1198 K per millimetro quadrato. La percentuale di cluster che ha superato i filtri è stata dell'84,2% con un rendimento stimato di 9,2 gigabyte. Inoltre, 7,4 gigabyte, ovvero l'82,8% delle letture, presentavano un punteggio di qualità maggiore o uguale a 30.Ciò significa che circa l'83% della base sequenziata con questo protocollo modificato e applicato a campioni di acqua ambientale aveva un'accuratezza nella chiamata delle basi di almeno il 99,9%. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare dati più informativi da librerie di sequenziamento. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare la frazione microbica a cui si mira, la scelta della preparazione della libreria, la lunghezza del frammento target e le piattaforme di sequenziamento.

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Caratterizzare la comunità microbica è stato un obiettivo di lunga data nella microbiologia ambientale. I metodi di sequenziamento di nuova generazione consentono ora la caratterizzazione delle comunità microbiche a una profondità senza precedenti, con costi e manodopera minimi. Descriviamo qui il nostro approccio al sequenziamento dei geni dell'RNA ribosomiale batterico 16S utilizzando un sequenziatore da banco.

Sequenziamento di prossima generazione del 16S RNA ribosomiale Gene ampliconi

Il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta potenziata è un metodo per la preparazione di librerie di sequenziamento per l'analisi della metilazione del DNA basata sulla digestione dell'enzima di restrizione combinata con la conversione del bisolfito di citosina. Questo protocollo richiede 50 ng di materiale di partenza e produce dati di risoluzione delle coppie di basi in regioni genomiche ricche di GC.

ENHANCED ridotto Rappresentanza bisolfito sequenziamento per la valutazione della metilazione del DNA in Risoluzione coppia di basi

Il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito (BSAS) è un metodo per quantificare la metilazione della citosina in regioni genomiche mirate di interesse. Questo metodo utilizza la conversione del bisolfito abbinata all'amplificazione PCR delle regioni target prima del sequenziamento di nuova generazione per produrre una quantificazione assoluta della metilazione del DNA a livello base-specifico.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

Viene descritto un sistema integrato per il sequenziamento mirato di nuova generazione di campioni oncologici. Questo sistema multipiattaforma è ottimizzato per biopsie tumorali di bassa qualità e bassa quantità, accoglie bassi input di DNA, include controlli multivariante ben caratterizzati e presenta un nuovo chiamante di varianti informato da misure quantitative di controllo di qualità pre-analitiche.

Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità

Descriviamo un metodo efficiente, robusto e redditizio per l'estrazione degli acidi nucleici da tamponi per la caratterizzazione delle comunità batteriche che utilizzano 16S rRNA gene amplicone sequenziamento. Il metodo consente un approccio di elaborazione comune per diversi tipi di campioni ed accoglie una serie di processi analitici valle.

Efficiente Nucleic Acid Estrazione e 16S rRNA sequenziamento del gene per batterica Comunità Caratterizzazione

Analisi del contenuto intestinale più comune di macroinvertebrati sono visive. Che richiedono intensa conoscenza diversità morfologica degli organismi di preda, essi perdere morbido corposo preda e, grazie alla forte comminuzione della preda, sono quasi impossibile per alcuni organismi, tra cui anfipodi. Forniamo dettagliati, romanzo approcci genetici per macroinvertebrati preda identificazione nella dieta di anfipodi.

Protocollo di laboratorio per analisi genetiche del contenuto dell'intestino del rDNA acquatica macroinvertebrati Using Group-specific Primers

Gel-seq consente ai ricercatori di preparare contemporaneamente le librerie per entrambi DNA - e RNA-seq trascurabile costo aggiunto a partire da 100-1000 cellule utilizzando un dispositivo semplice idrogel. Questa carta presenta un approccio dettagliato per la fabbricazione del dispositivo, nonché il protocollo biologico per generare librerie accoppiate.

Gel-seq: Un metodo per la preparazione di libreria simultanea di sequenziamento del DNA e RNA utilizzando matrici di idrogel

Full-Length individuo proviral sequenziamento (Flip) fornisce un metodo efficiente e ad alta produttività per l'amplificazione e sequenziamento del singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1 (intatto e difettoso) e permette per la determinazione del loro potenziale replica-competenza. Salti mortali supera i limiti delle precedenti analisi progettate per sequenziare il serbatoio latente di HIV-1.

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

L'identificazione delle interazioni fisiche tra geni ed elementi regolatori è impegnativo ma è stata facilitata dai metodi di cattura conformazione del cromosoma. Questa modifica del protocollo 4C-seq mitiga bias PCR riducendo al minimo eccessiva amplificazione dei modelli di PCR e massimizza la mappability di letture incorporando un passo di digest di aggiunta degli enzimi di limitazione.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

Forniamo un protocollo che può essere generalmente applicato a selezionare aptameri che si legano solo a virus infettivi e non a virus che sono stati resi non infettivi da un metodo di disinfezione o ad altri virus simili. Ciò apre la possibilità di determinare lo stato di infettività nei test portatili e rapidi.

Selezione in vitro di aptameri per differenziare i virus infettivi da quelli non infettivi

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro facile da seguire per condurre la purificazione dell'RNA poli(A), la conversione del bisolfito e la preparazione della libreria utilizzando apparecchiature standardizzate per un campione biologico di interesse.

Arricchimento di mRNA e preparazione della libreria bisolfito-mRNA per il sequenziamento di nuova generazione

Scopri la selezione automatica delle dimensioni del gel per migliorare la qualità delle librerie di sequenziamento di nuova generazione da campioni di acqua ambientale. Questo metodo automatizzato aumenta il throughput e la riproducibilità.

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale (Video) | JoVE Journal

Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

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