Automated Gel Selection Size per migliorare la qualità delle Biblioteche di sequenziamento di nuova generazione Preparato da campioni di acqua ambientale

In questo video viene illustrato l'utilizzo di uno strumento automatizzato per la selezione dimensionale dei gel al fine di ottenere letture migliorate nelle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione. In primo luogo, campioni di acqua ambientale vengono raccolti e fatti passare attraverso una serie di filtri per separare in modo sistematico particelle di dimensioni eucariotiche, batteriche e virali. I batteri trattenuti vengono ulteriormente concentrati mediante centrifugazione.

Quindi il DNA batterico viene estratto. Il DNA estratto viene utilizzato per preparare librerie in cui adattatori e indici sono incorporati nel DNA frammentato. Il DNA viene quindi amplificato mediante PCR e i campioni sono caricati nella stazione di elettroforesi.

I frammenti di DNA all'interno di un intervallo specifico vengono quindi selezionati automaticamente. L'analisi dei tracciati ottenuti mediante elettroforesi capillare su chip e ulteriori analisi bioinformatiche dimostrano che questo metodo produce quantità adeguate di frammenti di DNA per analisi successive, con un minimo assemblaggio di frammenti indesiderati inferiori a 200 paia di basi. Il vantaggio principale della stazione elettroforetica automatizzata o delle perle paramagnetiche e di altri sistemi commerciali è che consente una selezione più precisa e ristretta, nella quale fino a 96 campioni possono essere processati in un'unica corsa.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle comunità microbiche in campioni di acqua dolce, può essere applicato ad altri sistemi come acqua di mare, acque reflue in trattamento, campioni vegetali, suolo sedimentario o tappeti microbici, sostanzialmente a qualsiasi campione di DNA per il quale si desideri una selezione ristretta di dimensioni. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo osservato frammenti corti nelle sequenze della piattaforma MySEQ. Abbiamo provato diverse strategie di selezione dimensionale, inclusi diversi tipi di para-beads e rapporti, nonché un approccio manuale di selezione dimensionale su gel.

Successivamente abbiamo iniziato a collaborare con Coastal Genomics, una società privata della British Columbia che offre la tecnologia Ranger, dimostrandone la procedura. Oggi parteciperanno Michael Chan, tecnico di ricerca del mio laboratorio, Miguel Yi, un ricercatore post-dottorato del mio laboratorio, e Jared Sloan, un ingegnere di Coastal Genomics. In questo video descriveremo soltanto la purificazione e l'analisi del materiale recuperato sui filtri da 0,2 micron, principalmente batteri liberi, ma tenete presente che approcci simili possono essere utilizzati anche per le altre particelle recuperate dai filtri.

Iniziare questa procedura raccogliendo 40 litri di campioni di acqua dolce da diversi siti ambientali in carboy da 20 litri sterilizzati. Filtrare preliminarmente i campioni in situ utilizzando un filtro in polipropilene a maglia da 105 micrometri. In questo caso, i campioni vengono raccolti da bacini idrografici influenzati da aree urbane e agricole.

Dopo il prelievo, collocare i campioni in contenitori refrigerati e trasportarli in laboratorio. Conservare i campioni a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo.

Impostare un sistema di filtrazione costituito da un carboy per la raccolta del campione collegato, tramite una pompa peristaltica, a una capsula di campionamento da un micron "enviro check". Collegare la capsula di campionamento a un filtro a disco da 0,2 micron e questo a un filtro tangenziale da 30 kilodalton mediante una seconda pompa peristaltica. Accendere le pompe peristaltiche per far passare i campioni attraverso una serie di filtri; le cellule eucariotiche verranno isolate mentre passano attraverso la capsula di campionamento.

La frazione batterica verrà isolata sul filtro a disco membranoso, mentre le particelle virali verranno isolate sul filtro a flusso tangenziale. Rimuovere il filtro a membrana da 0,2 micrometri o più filtri dal sistema di filtrazione dell'acqua. Successivamente, piegare il filtro a metà e inserirlo in un tubo da 50 millilitri.

Con il lato aperto verso l'alto. Aggiungere cinque millilitri di PBS con tween al tubo. Se è stato utilizzato più di un filtro durante la filtrazione, usare un tubo diverso per ogni filtro.

I filtri possono quindi essere conservati a quattro gradi Celsius oppure processati immediatamente come segue. Successivamente, utilizzando pinze sterili, rimuovere il filtro membranoso dal tubo da 50 millilitri e posizionarlo su una piastra di Petri con pinze sterili e forbici sterili. Tagliare il filtro in pezzi di un centimetro per un centimetro tra un campione e l'altro.

Disinfettare gli strumenti immergendoli in isopropanolo al 70%, pulendoli con un decontaminante superficiale per DNA e quindi risciacquandoli con acqua ultrapura di tipo 1. Riposizionare i pezzi del filtro nello stesso tubo da 50 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di PBS con tween per portare il volume totale del tampone a 15 millilitri, utilizzando pinze sterili.

Aggiungere sei perle di tungsteno pulite, di tre millimetri di diametro, a ciascun tubo da 50 millilitri. Coprire il tubo con parafilm e vortexare vigorosamente per 20 minuti.

Dopo aver agitato con il vortex, raccogliere tutte le sospensioni in un unico tubo pulito da 50 millilitri per ogni campione. Centrifugare i tubi a 3.300 ×g per 15 minuti a 4 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet.

In cinque millilitri di soluzione PBS, distribuire le cellule batteriche in aliquote di un millilitro in provette microcentrifuga da 1,7 millilitro e centrifugare in una microcentrifuga a 10.000 ×g per 10 minuti. Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta per rimuovere tutto il soprannatante tranne 200 microlitri. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius oppure procedere all'estrazione del DNA batterico utilizzando un kit commerciale per l'isolamento del DNA.

Durante l'estrazione del DNA batterico, utilizzare come controllo negativo di estrazione PBS o acqua e come controllo positivo di estrazione e coli. Dopo la procedura di estrazione del DNA, unire gli aliquote dello stesso campione in un unico tubo da due millilitri in tampone tris 10 millimolare. Procedere quindi con una precipitazione notturna aggiungendo una soluzione composta da 10% di acetato di sodio tre molar, due volumi di etanolo al 100% e cinque microlitri di acrilamide lineare. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius.

Il giorno successivo, centrifugare i campioni a 17.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, lavare il pellet con un millilitro di etanolo al 70% freddo di ghiaccio e lasciare asciugare il pellet all'aria libera all'interno di una cappa a sicurezza biologica per non più di cinque minuti.

Quindi risospendere il pellet di DNA in tris 10 millimolare. Determinare infine la quantità e la qualità del DNA eseguendo un saggio di quantificazione degli acidi nucleici fluorescente ad alta sensibilità, seguito da spettrometria a microvolume. Dopo aver determinato la quantità di DNA in ogni campione, aggiungere la quantità appropriata di acqua a ciascun tubo per portare la concentrazione a circa 0,2 nanogrammi per microlitro.

Utilizzando un kit commercialmente disponibile, preparare una libreria di DNA costituita da frammenti indicizzati a partire da un nanogrammo di DNA batterico. In questo caso, si applica un metodo basato su trasposone, noto come mentazione, per frammentare contemporaneamente il DNA e incorporare sequenze adattatrici. Successivamente, si esegue la PCR per amplificare e indicizzare simultaneamente i campioni di ED, fornendo così barcode specifici su ciascun frammento e le sequenze necessarie per la formazione dei cluster, che possono essere lette dalla piattaforma di sequenziamento.

Dopo il completamento della PCR, saltare il normale passaggio di purificazione post-PCR e aggiungere 3,5 microlitri di buffer di carico a ciascun campione per un volume totale di 28,5 microlitri. Trasferire quindi i campioni in una piastra a 96 pozzetti. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in una stazione di elettroforesi con una cassetta preformata di agarosio al 1,5% nell'interfaccia utente del software Ranger.

Specifica un intervallo di selezione dimensionale compreso tra 500 e 800 paia di basi. Imposta il volume di estrazione a 300 microlitri. Avvia la corsa.

La stazione di elettroforesi caricherà automaticamente i campioni nelle cassette aros. Successivamente viene applicata una tensione alle cassette e un sistema di imaging montato su un braccio meccanico viene utilizzato per identificare la posizione del DNA del campione all'interno degli aros durante tutta la corsa.

Il software Ranger acquisisce immagini e, utilizzando standard interni, stima la posizione del bersaglio di dimensione selezionata in ogni campione. Dopo che i bersagli sono stati identificati, il software Ranger varia. La tensione applicata a ciascun campione serve a sincronizzare l'arrivo dei bersagli nei pozzetti di estrazione della cassetta.

Infine, la stazione di elettroforesi aspira i bersagli in TBE dai pozzetti di estrazione e li dispensa in una nuova piastra a 96 pozzetti per concentrare il materiale grezzo in uscita, precipitando il volume grezzo dell'eluito mediante acetato di sodio ed etanolo con acrilamide lineare, lasciando in incubazione tutta la notte a meno 80 gradi Celsius. Centrifugare nuovamente i campioni a 17.000 ×g per 30 minuti. Al termine della centrifugazione, eliminare i soprannatanti e procedere al lavaggio del pellet di DNA con un millilitro di etanolo al 70% ghiacciato, centrifugando.

Centrifugare i campioni a 17.000 ×g per 30 minuti, scartare il soprannatante, essiccarli e infine risospendere il pellet di DNA in tris 10 millimolare cloruro; procedere alla normalizzazione dei campioni utilizzando le perle di normalizzazione per libreria, incluse nel kit di preparazione della libreria transpose on base. Infine, procedere al sequenziamento del DNA mediante una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione per ottenere letture più informative nelle piattaforme di sequenziamento di nuova generazione, migliorando la qualità delle librerie di sequenziamento.

Sono stati prelevati campioni d'acqua in otto siti diversi del bacino idrografico e sono state preparate librerie di DNA indicizzate a partire dalla frazione batterica isolata, come mostrato in questo elettroferogramma. Le librerie di DNA generate da campioni di acqua dolce dopo la PCR, ma prima della selezione automatica per dimensione, erano composte da frammenti di dimensioni comprese tra 50 paia di basi e 3000 paia di basi. Dopo la selezione per dimensione effettuata mediante la piattaforma automatizzata ad alta capacità, i campioni presentavano un intervallo ristretto di frammenti di DNA compreso tra 500 e 800 paia di basi. Pertanto, l'utilizzo di questa piattaforma automatizzata di selezione per dimensione su gel ha permesso di ottenere rese adeguate e ha ridotto al minimo l'accumulo di frammenti indesiderati inferiori a 200 paia di basi.

Il sequenziamento del DNA di questa libreria effettuato sul MiSeq in alluminio ha generato una densità di cluster di 1198 K per millimetro quadrato. La percentuale di cluster che ha superato i filtri è stata dell'84,2% con un rendimento stimato di 9,2 gigabyte. Inoltre, 7,4 gigabyte, ovvero l'82,8% delle letture, presentavano un punteggio di qualità maggiore o uguale a 30.

Ciò significa che circa l'83% della base sequenziata con questo protocollo modificato e applicato a campioni di acqua ambientale aveva un'accuratezza nella chiamata delle basi di almeno il 99,9%. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare dati più informativi da librerie di sequenziamento. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare la frazione microbica a cui si mira, la scelta della preparazione della libreria, la lunghezza del frammento target e le piattaforme di sequenziamento.