Name: Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Impara un saggio di invasione tumorale 3D semi-automatizzato per studiare il comportamento delle cellule cancerose in un ambiente fisiologicamente rilevante. Questo metodo consente il monitoraggio dell'invasione nel tempo per la ricerca oncologica.

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Questo lavoro è stato finanziato dal National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) e dall'Oracle Cancer Trust. SE è supportato dall'Institute of Cancer Research e dal Cancer Research UK (numero di sovvenzione C309/A8274). Riconosciamo il finanziamento del NHS al NIHR Biomedical Research Centre.

1. Generazione di riproducibile Spheroids tumorali Sized <ol><li> Lavare monostrati di cellule tumorali con tampone fosfato (PBS, 5 ml per 25 cm 2 o 8-10 ml per un pallone 75 centimetri 2), aggiungere la dissociazione delle cellule enzima (1 ml per 25 cm 2 o 2 ml per 75 cm 2 pallone) e incubare cellule a 37 ° C per 2-5 min. </li><li> Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare la dissociazione cellulare dell&#39;enzima con mezzo di crescita completo (5 ml per 25 cm 2 o 8 ml per un matraccio 75 centimetri 2). </li><li> Sospensione cellulare Centrifugare a 500 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, toccare il tubo e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di coltura completo utilizzando una pipetta P1000. Ciò dovrebbe produrre una sospensione di cellule singole, senza gruppi di cellule. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e diluire la sospensione cellulare per ottenere 0,5-2 x 10 4 cellule / ml (densità cellulare ottimale deve essere determinato per ciascuna linea cellulare in order per ottenere sferoidi tumorali di 300-500 micron di diametro 4 giorni dopo la semina cella 12,13). </li><li> Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e, con una pipetta multicanale, dispensare 200 pl / pozzetto in ultra-low di attacco (ULA) 96 pozzetti piastre inferiori rotonde 12. </li><li> Trasferire le piastre di un incubatore (37 ° C, 5% CO 2, 95% di umidità). Quattro giorni dopo, confermare visivamente tumore formazione sferoide e procedere con il test di invasione 3D. </li></ol> 2. 3D Tumore Spheroid Invasion Assay <ol><li> Scongelare BMM sul ghiaccio. </li><li> Mantenere una serie di puntali con filtro sterili per P10, P200 e P1000 pipette e provette sterili (1,5 ml di volume o maggiore a seconda del volume totale richiesto) a -20 ° C. </li><li> Posizionare le piastre a 96 pozzetti contenenti ULA 4 giorni vecchi sferoidi sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 l / pozzetto di terreno di crescita dalle piastre sferoidali. Per questo angolo passo le punte verso l&#39;inside parete dei pozzetti U-bottom, evitando il contatto con il fondo del pozzetto e la posizione degli sferoidi; minimizzare il disturbo degli sferoidi. </li><li> Utilizzando punte ghiacciate, trasferire BMM di tubi ghiacciati. Per invasione citochine indotta o per studi di valutazione di droga, aggiungere i reagenti (a 2x la concentrazione finale) per la BMM con punte ghiacciate. Ad esempio, utilizzare il fattore di crescita epidermico (EGF) per stimolare l&#39;invasione delle cellule di carcinoma squamoso CAL S e R CAL. Mescolare bene agitando delicatamente, evitando la formazione di bolle. </li><li> Dispensare delicatamente 100 microlitri della BMM nel pozzetto U-bottom, puntando la punta verso la parete interna del pozzo. Questa fase è la più critica come, per l&#39;analisi di immagine ottimale, sferoidi devono rimanere al centro del pozzo 12. </li><li> Ripetere il passaggio 2.6 per tutti i pozzetti necessari, permettendo 5-6 ripetizioni / condizione. Se necessario, passare a una punta appena raffreddato. NOTA: quando più esperto, &#39;erogazionese BMM usando una pipetta multicanale. </li><li> Usando un ago sterile, rimuovere le bolle, se presente. <ol><li> Utilizzando un microscopio, controllare visivamente che sferoidi sono in una posizione centrale. In caso contrario, centrifugare la piastra a 300 xg per 3 min a 4 ° C. Questo farà sì che sferoidi occupano una posizione centrale in ogni pozzetto. </li></ol></li><li> Trasferire la lastra in un termostato a 37 ° C e consentire al BMM solidificare. </li><li> 1 ora più tardi, con una pipetta multicanale, aggiungere delicatamente 100 ml / pozzetto di terreno di coltura completo. Per invasione o di valutazione farmaco studi citochine indotta, includere citochine o inibitori nel medio (1x concentrazione finale). In alternativa, se i reagenti non sono stati aggiunti al BMM nel passo 2.5, aggiungerli al mezzo a questo punto (3x la concentrazione finale desiderata). </li></ol> 3. Automated Image Acquisition <ol><li> Piatti di scansione sul citometro (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali) ad intervalli starting da tempo zero (t0 = giorno del test di invasione istituito, subito dopo il punto 2.10 fino a 72 ore, o 96 ore per invasione linee cellulari tumorali più lente. </li><li> Selezionare l&#39;applicazione &#39;Confluence&#39;. </li><li> Controllare che il sferoide è a fuoco e, se necessario, regolare manualmente e fissare il &#39;Fuoco partì-&#39;. </li><li> In &quot;impostazioni di campionamento&quot;, selezionare la scansione un campo centrale visivo (FOV). Dopo BMM Inoltre, sferoidi tumorali dovuti rimanere in una posizione centrale, quindi non vi è alcuna necessità di eseguire la scansione dell&#39;intero bene. </li><li> Nel software, definiscono i pozzetti da analizzare evidenziandoli sulla mappa piatto. Clicca su &#39;Start Scan&#39;. NOTA: La scansione viene salvato e può essere rivisto in seguito off-line automaticamente. </li></ol> 4. Automated Image Analysis <ol><li> Seleziona l&#39;applicazione &#39;Confluence&#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Analysis&#39;, regolare applicImpostazioni ation (ad esempio, &quot;precisione&quot;: basso, normale, alto, &quot;soglia di intensità&quot;: 1 - 15) per produrre una segmentazione precisa intorno alla sferoide, inclusi i processi cellulari e invadopodi estendono nel BMM (vedi Figura 1). Regolare le impostazioni per ogni linea di cellule tumorali e / o in vari momenti. Misure di applicazione La &#39;Confluence&#39; la% della superficie ben coperto dalle cellule invasori, nel FOV selezionato. </li><li> Verificare che le impostazioni di analisi sono appropriate (ad esempio, la segmentazione è preciso) per gli altri spheroids nella piastra cliccando su alcuni pozzi diversi. Se la segmentazione non delinea con precisione uno sferoide, regolare ulteriormente le impostazioni dell&#39;applicazione. </li><li> Clicca su &#39;Start&#39; analisi &#39;. </li><li> Nella scheda &#39;Risultati&#39;, controllare più pozzi per verificare la qualità dell&#39;analisi. Export &#39;Bene dati a livello di&#39; a un foglio di calcolo. </li><li> Ripetanalisi t per tutti i punti temporali. Calcolare la media% di confluenza per pozzi replicati e invasione del terreno (% confluenza) contro il tempo in un grafico a barre, con grafici scientifici e software statistico di scelta. </li></ol> 5. Manuale Image Acquisition <ol><li> Registrare un&#39;immagine per ciascun sferoide tumore ad intervalli partire da t = 0 fino a 72-96 ore, a seconda della velocità di invasione della linea cellulare in questione, utilizzando un microscopio invertito (per una piastra a 96 pozzetti questo richiede circa 20 - 30 min). Utilizzare un obiettivo 10X. Utilizzare un obiettivo 4X quando un&#39;area invasa è troppo grande per essere completamente catturato all&#39;interno del campo di vista 10X. </li><li> Salvare ogni singola immagine acquisita. </li><li> Per la calibrazione, prendere le immagini di uno stadio reticolo (1 mm) utilizzando entrambi gli obiettivi 10X e 4X (e salvare le immagini). </li></ol> 6. Manuale Image Analysis <ol><li> Aprire le immagini palco reticolo nel software di analisi delle immagini di scelta. </li><li> Inserisci il gratmisurazioni icule, le unità (micron), gli obiettivi usati (10X o 4X) e di eseguire la calibrazione. Questo passaggio è necessario solo una volta. Per la successiva analisi delle immagini, è sufficiente ricaricare le impostazioni di calibrazione necessarie. </li><li> Aprite le immagini del saggio di invasione e selezionare le impostazioni di calibrazione in funzione dell&#39;obiettivo del microscopio (10X o 4X) usata per ottenere le immagini. <ol><li> In alternativa, importare immagini ottenute su un citometro di imaging (fase 3) e analizzare manualmente, come descritto per le immagini ottenute con un microscopio invertito (vedere i risultati mostrati in Figura 3 e Figura 4). </li></ol></li><li> Misurare l&#39;area coperta da sferoidi. <ol><li> Nel software utilizzato qui per la Rappresentante dei risultati (per specifiche vedi Tabella di attrezzature e materiali), vai su &#39;misura&#39; e selezionare &#39;Count / size&#39;. Abbiamo scelto &#39;File&#39; poi &#39;Carica impostazioni&#39; e selezionare predeterminato assaImpostazioni y. Quindi scegliere &#39;Conte&#39;. Il sferoide dovrebbe poi essere segmentato in modo accurato. </li><li> In alternativa, andare su &#39;Modifica&#39; poi &#39;Disegna / Unisci oggetti&#39; per aprire la finestra &#39;bacchetta magica / Trace&#39;. Usate il cursore bacchetta di cliccare sull&#39;immagine sferoide su ed ottenere la segmentazione. Seleziona &#39;Traccia&#39; (nella finestra &#39;bacchetta magica&#39;) per delineare manualmente la sferoide utilizzando un mouse. </li></ol></li><li> Misure di esportazione di diversi parametri (area, diametro, perimetro ecc) ad un foglio di calcolo. Record sul foglio le informazioni sull&#39;immagine rilevanti (ad esempio, ben il numero, punto di tempo relativo). </li><li> Tracciare l&#39;area media di sferoidi ripetute (invasione) in funzione del tempo con grafica scientifica e software statistico. In alternativa, calcolare la variazione dell&#39;area sferoide ciascun tempo, rispetto alla zona a t = 0. Quindi invasione trama (% t0) in funzione del tempo come gra lineariph. </li></ol>

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</ol>

Tutti gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi in competizione.

I due modelli tumorali qui descritti (glioblastoma e SCCHN) sono stati appositamente selezionati per esemplificare il nostro test 3D come siano clinicamente rilevanti tumori localmente invasivi con un bisogno insoddisfatto per terapie efficaci 12. A seguito di trattamento farmacologico, la valutazione dei cambiamenti in vitro farmacodinamica (PD) biomarker in può essere eseguita facilmente mediante western blot o immunologici del lisati in seguito all&#39;uso di specifici reagenti commercialmente disponibili per consentire il recupero delle cellule da BMM e / o l&#39;analisi di immunofluorescenza di invadere sferoidi tumorali tutto colorazione mount. Questo saggio di invasione è una tecnica utile per la valutazione rapida e riproducibile di invasione delle cellule tumorali in un mezzo semisolido e quindi particolarmente adatto per il futuro in screening di farmaci vitro. Le cellule tumorali invadono la matrice in modo 3D come si diffondono fuori da un &quot;micro-tumorale&quot;, rappresentata dalla sferoidale tumore, e si estendono in un extracellulambiente ar a matrice. La vera tridimensionalità del dosaggio è evidente nella morfologia cellulare, che è diverso dal piatto, morfologia aderente cellule assumono quando si spostano su un substrato solido. Il grado di invasione è facilmente quantificato utilizzando un citometro di imaging, permettendo una lettura-out automatico, oppure utilizzando un microscopio convenzionale in combinazione con software di imaging. Inoltre, questo metodo è adatto per l&#39;imaging fluorescente 13 (per esempio con linee cellulari che esprimono proteine ​​fluorescenti o pre-etichettato con coloranti fluorescenti). Il metodo è semplice da eseguire con la sola fase critica rappresentata dall&#39;aggiunta della BMM, quando vi è un rischio di disturbare la posizione centrale dello sferoide nel U bene. Questo può portare ad analisi di immagine ottimale, con sferoidi in diversi piani focali. E &#39;quindi fondamentale per aggiungere lentamente e con cautela la BMM di ogni bene. Dopo BMM Inoltre, è consigliabile verificare la targasotto un microscopio e se la localizzazione è considerata inaccettabile, questo può essere risolto dolce centrifugazione. Con l&#39;esperienza, questo è raramente necessaria. Anche se questo metodo è molto robusto e riproducibili, variabilità inter-sperimentale potrebbe verificarsi con diversi lotti di BMM. Per evitare ciò, si consiglia di acquistare sufficiente BMM da una singola partita per completare una serie di studi. Una limitazione del metodo (come per tali dosaggi) è la difficoltà nel distinguere tra l&#39;invasione e la proliferazione, che le cellule tumorali probabilmente subiscono durante il periodo di tempo del test. Anche se il tempo di raddoppio delle cellule può essere preso in considerazione, o inibitori del ciclo cellulare come citocalasina D introdotto, non è facile da controllare o chiaramente distinguere tra questi due aspetti diversi della progressione tumorale, in particolare per le cellule tumorali in rapida crescita e per coloro che hanno una più &quot;espansiva&quot;, piuttosto che infiltrante, modello di invasione. Per questo motivosi suggerisce che un saggio di crescita 3D parallelamente viene eseguito per valutare gli effetti specifici di agenti inibitori o stimolatori. Se si eseguono studi di risposta attenta dosi, può essere possibile selezionare concentrazioni che minimizzano gli effetti sulla proliferazione. Per esempio abbiamo dimostrato che l&#39;inibitore HSP90 17-AAG inibisce U-87 MG 3D tumore sferoide invasione già a 24 ore ed a concentrazioni inferiori concentrazione che inibisce la crescita 3D del 50% (GI 50) 12. D&#39;altra parte, il significato di questo test rispetto ad altri test invasione standard (ad esempio, saggi filtro basato o invasione delle singole cellule in matrici 3D 1), è che le cellule tumorali invadono nella matrice circostante dalla sferoidale, che assomiglia a una &quot; micro-tumorale &quot;o&quot; micro-metastasi &quot;, e quindi tiene conto degli aspetti importanti della fisiopatologia di una massa tumorale. Il metodo presentiamo fornisce informazioni sullacomportamento collettivo delle cellule tumorali, quando lasciando inizialmente sferoidi, e anche individualmente, quando singole cellule raggiungono le regioni più lontane nel BMM. Inoltre, le cellule all&#39;interno sferoidi tumorali possono verificarsi ipossia e nutrienti privazione che, attraverso i cambiamenti nell&#39;espressione genica, in grado di promuovere la migrazione e l&#39;invasione; tali caratteristiche sono assenti nelle analisi 2D. Inoltre, tutto questo è disponibile in un formato ad alta produttività attraverso l&#39;utilizzo di piastre a 96 pozzetti specifici e la recente tecnologia di imaging, consentendo un saggio 3D più complesso da essere facilmente utilizzato nella convalida di destinazione e la scoperta di farmaci. Il metodo che presentiamo in grado di ospitare ulteriori applicazioni per affrontare ulteriori aspetti di invasione delle cellule tumorali. In particolare, la complessità supplementare può essere previsto con l&#39;aggiunta di cellule ospiti, come i fibroblasti e / o cellule endoteliali, nel sferoidale stesso o matrice circostante. Questo può anche essere modificato, non solo in termini di rigidità (con l&#39;uso di diversi concentrations di BMM), ma anche in termini di composizione (con l&#39;aggiunta di altri componenti dipendenti dalla specifica del tessuto / organo del modello adottato tumore: ad esempio, per i tumori cerebrali tenascin 16 e collagene per carcinoma mammario 17). Un simile set-up (generazione di sferoidi e di imaging) possono anche essere adattate per valutare invasione tissutale in 3D, dove sferoidi tumorali sono co-coltura con corpi embrionali simile a un tessuto complesso 12 o con altri organoidi specifici delle cellule (ad esempio, per astrociti glioma 18 o cripta colture per i tumori gastrointestinali), ma ulteriore lavoro è necessario per consentire l&#39;analisi automatica delle immagini.

Lo sviluppo di farmaci antitumorali classica è in gran parte concentrata sull&#39;uso di vitro saggi cellulari in a schermo per gli agenti citotossici che inibiscono la proliferazione delle cellule tumorali e / o promuovono la morte cellulare programmata (apoptosi). Più di recente, gli sforzi si sono spostati verso terapie mirate con lo sviluppo di inibitori delle cause molecolari alla base della proliferazione delle cellule maligne. Nonostante alcuni risultati spettacolari, tali agenti sono spesso associati con il rapido sviluppo di resistenza al farmaco. Dato che è il potenziale invasivo e metastatico delle cellule tumorali che è responsabile della maggior parte dei decessi per cancro, e che malattia recidivante presenta spesso un fenotipo più aggressivo, è logico anche considerare complementari in vitro modelli sperimentali 1,2 per identificare nuovi agenti che inibiscono questi tasti aggiuntivi &quot;caratteristiche&quot; del cancro. Durante la progressione maligna, le cellule tumorali acquisisconola capacità di invadere i tessuti circostanti e / o la diffusione in organi distanti (metastasi). Le cellule tumorali penetrano la membrana basale dalla formazione di invadopodi 3,4. Queste strutture sono arricchiti con filamenti di actina, proteine ​​di adesione specifici e proteinasi e sono collettivamente responsabili per la motilità delle cellule tumorali e la degradazione della matrice extracellulare (ECM) 5. Invadopodi estendono nel ECM e si crede di essere importante per l&#39;invasione delle cellule tumorali e di stravaso anche in canali vascolari, facilitando ematogena (o linfatica) diffusione e metastasi. Metodi standard attuali per valutare l&#39;invasione delle cellule tumorali in vitro sono i seguenti. Transwell o basato Boyden saggi camera 2,6 dove sospensioni di cellule singole sono seminate in cima ad un filtro rivestito con uno spesso strato di proteine ​​ECM-derivato. Cellule poi invadono e muovono nella camera inferiore in risposta ad un chemio-attrattore. Comunemente usato ECMproteine ​​sono collagene di tipo I, o di una membrana simile matrice seminterrato (BMM, ad esempio, Matrigel, derivato dal tumore EHS 7) che riproduce la composizione naturale delle membrane basali. In alternativa alle Boyden tipo camera saggi basati filtro-8, le cellule possono essere seminati su di un gel di ECM (a cui possono essere aggiunti fibroblasti) dove formano un monostrato e quindi singolarmente o collettivamente invadere nel gel. Invasion può essere misurata in termini di numero di cellule che invadono e / o la distanza percorsa dalla superficie del gel 9. Le cellule tumorali possono anche essere completamente incorporati in una matrice o come una sospensione di cellule singole o sferoidi - solitamente poste tra due strati di ECM gel- consentendo alle cellule di invadere dalla massa tumorale nella matrice circostante 2,6,10,11. Il tridimensionale (3D) tumore sferoide invasione test qui descritta fornisce un sistema rapido invasione automatizzabili utilizzando un highly riproducibile, metodo standardizzato 12 in un formato di piastra da 96 pozzetti con uno sferoide per pozzetto. BMM viene aggiunto direttamente a ciascun pozzetto per fornire una matrice semi-solido in cui le cellule tumorali invadono dal corpo sferoidale. Il grado di invasione delle cellule tumorali è monitorata ad intervalli per un periodo di 72-96 ore. Questo metodo fornisce i seguenti vantaggi rispetto ai saggi attuali in vitro invasione citati: il tumore celle sono organizzate in una struttura 3D simulando una micro-regione tumore o un micro-metastasi; sferoidi tumorali sono altamente riproducibili in dimensioni; il saggio di invasione viene eseguita in situ nella stessa piastra come sviluppo del tumore sferoidale, senza la necessità di spostarli piastre secondarie; il metodo, in combinazione con le più recenti tecnologie di analisi automatica delle immagini, permette sia alto contenuto e alto rendimento analisi di invasione delle cellule tumorali. L&#39;analisi delle immagini viene effettuata utilizzando un sistema di imaging citometro, che analizza un 96 pozzettipiastra entro 10 minuti. Utilizzando l&#39;applicazione confluenza, la portata e la velocità dell&#39;invasione raggiunti sia da singole cellule o gruppi di cellule si diffondono dalle sferoidi tumorali e invasori nella matrice può essere misurata in modo dinamico. Per trasmissione inferiore, un metodo alternativo per l&#39;analisi delle immagini viene presentato, basato sull&#39;uso di un microscopio invertito e software di imaging standard.

<table><tbody><tr><td>Matrice di membrana basale Corning Matrigel</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>354234</td><td>Mantenere a 4 &amp;deg;C per prevenire la solidificazione ed erogare utilizzando punte di pipetta refrigerate</td></tr><tr><td>Estratto di membrana basale Cultrex, PathClear</td><td><a href="http://www.trevigen.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Trevigen</a></td><td>3432-005-01</td><td>Mantenere a 4 &amp;deg;C per prevenire la solidificazione ed erogare utilizzando punte di pipetta refrigerate</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con attacco ultra-basso</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td><a href="http://www.miltenyibiotec.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Miltenyi Biotec</a></td><td>130-093-825</td><td>Aggiungere 100 &amp;mu;l di BSA 1% (p/v) in acqua a 100 &amp;mu;g di EGF. A 25 &amp;mu;l di questa soluzione, aggiungere 4.975 &amp;mu;l di mezzo RHB-A per ottenere una soluzione lavorativa di 5 &amp;mu;g/ml. Aliquotare e conservare a -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mezzo RHB-A</td><td><a href="http://www.stemcellsinc.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Stem Cells Inc.</a></td><td>SCS-SF-NB-01</td><td>Per la diluizione dell'EGF</td></tr><tr><td>DMEM</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>31966-021</td><td>Riscaldare in bagno termostatato a 37 &amp;deg;C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td><a href="http://www.biosera.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Biosera</a></td><td>1001/500</td><td>Trattare a 56 &amp;deg;C per inattivare il complemento prima dell'uso</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GIBCO</a></td><td>12605</td><td>Soluzione per la dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Citometro Celigo</td><td><a href="http://www.nexcelom.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Nexcelom Bioscience</a></td><td>n/a</td><td>Strumentazione specializzata per acquisizione e analisi di immagini. L'acquisizione manuale delle immagini mediante microscopia e un software indipendente per l'analisi delle immagini rappresentano un'alternativa</td></tr><tr><td>Microscopio invertito IX70</td><td><a href="http://www.olympus.co.uk/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Olympus</a></td><td>n/a</td><td>Utilizzato con fotocamera per l'acquisizione manuale delle immagini</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale Retiga Exi Fast 1394</td><td><a href="http://www.qimaging.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Qimaging</a></td><td>n/a</td><td>Collegata al microscopio per l'acquisizione manuale delle immagini</td></tr><tr><td>Image-Pro Plus 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software utilizzato per controllare fotocamera e microscopio durante l'acquisizione manuale delle immagini</td></tr><tr><td>Image-Pro Analyzer 7.0</td><td><a href="http://www.mediacy.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Media Cybernetics</a></td><td>n/a</td><td>Software autonomo per l'analisi delle immagini e la misurazione manuale della dimensione degli sferoidi</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td><a href="http://www.microsoft.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Microsoft</a></td><td>n/a</td><td>Software per grafici scientifici e analisi statistiche</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td><a href="http://www.graphpad.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GraphPad</a></td><td>n/a</td><td>Software per grafici scientifici e analisi statistiche</td></tr></tbody></table>

tridimensionale (3d) tumore spheroid invasion assay

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasione di tessuti circostanti normali è generalmente considerata come una caratteristica fondamentale del maligno (al contrario di benigni) i tumori. Per alcuni tipi di cancro, in particolare (ad esempio, i tumori del cervello, il glioblastoma multiforme e carcinoma a cellule squamose della testa e del collo -. SCCHN) si tratta di una causa di grave morbilità e può essere anche in assenza di metastasi a distanza in pericolo di vita. Inoltre, i tumori che hanno recidivato dopo il trattamento, purtroppo, spesso presente con un fenotipo più aggressivo. Pertanto, vi è la possibilità di indirizzare il processo di invasione di fornire nuove terapie che potrebbero essere complementare ad agenti anti-proliferativi standard. Fino ad ora, questa strategia è stata ostacolata dalla mancanza di robusti test riproducibili adatti per un&#39;analisi dettagliata di invasione e per lo screening di stupefacenti. Qui forniamo un metodo di micro-plate semplice (sulla base di uniformi, auto-assemblaggio sferoidi tumorali 3D), che ha un grande potenziale per tale stumuore. Noi esemplificano la piattaforma test utilizzando una linea cellulare di glioblastoma umano e anche un modello SCCHN in cui lo sviluppo della resistenza contro mirata del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) è associato con una maggiore potenziale matrice invasivo. Forniamo anche due metodi alternativi di quantificazione semi-automatico: uno che utilizza un sistema di imaging citometro e al secondo, che richiede semplicemente la microscopia e immagine di acquisizione standard di analisi di immagine digitale.

3D tumore sferoide invasione è valutato attraverso un riproducibile, metodo semplice, automatizzato schematicamente illustrata in figura 1: sferoidi tumorali riproducibile dimensioni sono ottenuti placcatura cellule in ULA 96-pozzetti a fondo sferico. 4 giorni sferoidi post-iniziazione sono incorporati in BMM. Questo fornisce una struttura semi-solido in cui le cellule tumorali invadono e sparsi dello sferoide. Spheroids sono in posizione centrale alla base di ogni bene e di invasione nella BMM è facilmente monitorata ad intervalli a partire da t = 0 fino a 72-96 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. Questo può fornire un&#39;analisi immagine completamente automatizzato. Esempi di diversi tipi di invasione delle cellule del cancro sono illustrate nelle figure 2 -. 4 L&#39;altamente maligno multiforme glioblastoma umano (GBM) linea cellulare U-87 MG, forma una struttura 3D sferica stretto e viene qui utilizzato per esemplificare tumori cerebrali nei quali locali invasione è una chiave pericolo di vitacaratteristica. Una volta incorporato in BMM, cellule da sferoidi U-87 MG si sviluppa con un tipico &quot;starburst&quot; invasione modello 12. Le cellule tumorali radialmente estendono nella matrice in cui mantengono una forma 3-dimensionale. Il processo è seguito in un periodo di 72 ore, come mostrato in Figura 2 per U-87 sferoidi MG, quando il grado di invasione delle cellule tumorali, con dettagli dei processi cellulari e invadopodi estendono nella BMM è chiaramente evidente. Completamente automatizzato analisi delle immagini utilizzando un&#39;immagine citometro consente la quantificazione precisa della invasione delle cellule tumorali nel corso del tempo. La quantificazione in figura 2 è ottenuto come illustrato nella figura 1, dove l&#39;analisi automatizzata produce segmentazione attorno alle sporgenze cellulari estendono nella BMM dal 87-U MG corpo sferoidale. Si noti che per questa linea cellulare, il corpo sferoidale tumore è escluso dalla misurazione dell&#39;area invasa. Un modello diverso di invasion è stato visualizzato da linee umani squamose della testa e del collo di cellule tumorali. CAL S e CAL R sono isogenico ma CAL S è sensibile a, e CAL R resistente agli inibitori della chinasi di EGFR tirosin 14. In assenza di EGF, né linea cellulare invaso nel BMM (Figura 3) Tuttavia, poiché la concentrazione di EGF è stato aumentato (a 2,5 ng / ml), gli sferoidi sembrano &#39;germoglio&#39;. Alle concentrazioni elevate di EGF (40 e 80 ng / ml) il grado di invasione è stata ridotta. Questo è coerente con il classico a campana dose-risposta per EGF in termini di invasione che è stato precedentemente riportato 15. In 20 ng / ml EGF, sporgenze simili a dita estruso dal corpo principale di sferoidi CAL R mentre cellule CAL S erano meno invasiva dopo 72 ore (Figura 3). Questa invasione differenza era evidente 48 ore dopo sferoidi sono stati collocati in BMM (contenente 20 ng / ml FEG per distinguere la massima tra le linee cellulari) Ed il meglio dopo 72 ore (Figura 4). Queste immagini sono state acquisite rapidamente utilizzando un citometro di imaging, come per U-87 MG. Tuttavia, in questo caso, per esemplificare un metodo alternativo, il grado di invasione è stata quantificata manualmente utilizzando il software di analisi di immagine stand-alone e si presenta graficamente (figure 3 e 4). Questi risultati mostrano una differenza fenotipica tra cellule farmaco-sensibili e resistenti all&#39;azione che potrebbero essere utilizzati per lo screening per composti che specificamente antagonizzare l&#39;resistente fenotipo invasivo droga. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig1.jpg" /> Figura 1. Schema di 3D tumore sferoide saggio di invasione. Il flusso di lavoro mostra i passaggi del metodo comporta l&#39;inclusione di immagini rappresentative di sferoidi U-87 MG glioblastoma solo dopo l&#39;incorporazione in BMM (pannello superiore; t = 0) e dopo l&#39;invasione<html> in BMM (pannello inferiore; t = 72 ore) con e senza la segmentazione che misura l&#39;area coperta dalle cellule invasori. Bar = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig2.jpg" /> Figura 2. Time-corso di U-87 MG glioblastoma sferoide invasione in BMM. U-87 MG sferoide invasione 3D nel BMM è stato monitorato e quantificato fino a 72 ore utilizzando un sistema di imaging citometro. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione sono mostrati invasione delle cellule tumorali. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> re 3 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. CAL R (resistenza) e CAL S (sensibilità) tumore sferoidale invasione. (A) Immagini rappresentative e (B) quantificazione manuale di EGF dose-dipendente R CAL e CAL S tumore sferoide invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52686/52686fig4.jpg" /> Figura 4. Le cellule da CAL R (resistente) sferoidi sono più invasivi rispetto CAL S (sensibili) sferoidi tumorali quando sono immessi in BMM. Dopo stimolazione EGF CAL R sferoidi tumorali mostrano una invasione più pronunciato rispetto CAL S. (A) Immagini rappresentative e (B) la quantificazione manuale dell&#39;invasione sono mostrati. Bar = 500 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52686/52686fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un saggio in vitro, semiautomatico, tridimensionale in microtitolazione dell'invasione delle cellule tumorali. Questo viene ottenuto innanzitutto generando steroidi tumorali di dimensioni riproducibili in sospensione in piastre ultralow ad attacco rotondo da 96 pozzetti, con un singolo steroloide in ciascun pozzetto. Il secondo passaggio consiste nel rimuovere parte del mezzo e aggiungere direttamente in ciascun pozzetto una matrice simile alla membrana basale (BMM), al fine di fornire una matrice semisolida attraverso la quale le cellule tumorali possano invadere partendo dal corpo dello steroloide.Successivamente, l'invasione del tumore da parte dello steroide viene monitorata a intervalli per un periodo di 72-96 ore, durante il quale l'acquisizione delle immagini viene eseguita automaticamente su un citometro oppure manualmente al microscopio. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare l'invasione delle cellule tumorali mediante un citometro automatico o un software di analisi delle immagini. In definitiva, il saggio di invasione dello steroide tumorale in 3D viene utilizzato per modellare l'invasione tumorale in vitro in un formato più fisiologicamente rilevante e adatto a studi di validazione di bersagli e di screening farmacologico.Riteniamo che questa tecnica sia complementare ai semplici saggi di proliferazione cellulare bidimensionali normalmente utilizzati per la validazione di bersagli e lo screening di farmaci nella ricerca sul cancro, poiché consente anche di studiare l'invasione, un aspetto chiave della progressione tumorale in un formato tridimensionale fisiologicamente rilevante. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando ottimizzai il fenotipo tumorale 3D, la crescita in micropiastre. Pensai che sarebbe stato utile impiegare lo stesso allestimento e osservare anche l'invasione, e il risultato fu semplice: bastò rimuovere una parte del mezzo da ogni pozzetto e sostituirlo con una matrice simile alla membrana basale.La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale, poiché mantenere gli steroidi in posizione centrale in ciascun pozzetto dopo la tradizione delle BMM può risultare difficile all'inizio. Ciò può portare a un'analisi delle immagini subottimale a causa della presenza degli steroidi in diversi piani focali. Con l'esperienza.Questo accade raramente, ma se necessario, il processo può essere facilitato da una delicata centrifugazione della piastra. Per iniziare, lasciare tutte le BMM su ghiaccio durante la notte, preparando un set di puntali filtro sterili per pipette P 10 E 200 e P 1000 e tubi sterili a meno 20 gradi Celsius. Posizionare anche le piastre a 96 pozzetti con superficie ultra antiadesiva contenenti steroidi di quattro giorni di vita sul ghiaccio.Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 microlitri per pozzetto di mezzo di crescita dalle piastre di sparvi. In questo passaggio, orientare la punta verso la parete interna del fondo a U, facendo attenzione a non toccare il fondo del pozzetto e la posizione dello spero.Per ridurre al minimo le perturbazioni dei corticosteroidi, trasferire le BMM in provette ghiacciate utilizzando punte a freddo. Per studi sull'invasione indotta da citochine o sulla valutazione di farmaci, aggiungere i reagenti alle BMM usando punte a freddo. Ad esempio, utilizzare il fattore di crescita epidermico o EGF per stimolare l'invasione delle cellule di carcinoma squamoso Cal S e cal r.Quindi dispensare delicatamente 100 microlitri di BMM nel ubo. Mirare accuratamente la punta verso la parete interna della pozzetta. Questo passaggio è il più critico.Per quanto riguarda l'analisi dell'immagine ottica, i steroidi devono rimanere al centro del, bene. Ripetere questo passaggio per tutte le pozzette necessarie, prevedendo da cinque a sei ripetizioni per ogni condizione. Se necessario, sostituire con una nuova punta precedentemente raffreddata utilizzando un ago sterile.Rimuovere le bolle se presenti. Utilizzare un microscopio per verificare visivamente che gli steroidi siano in posizione centrale; in caso contrario, centrifugare la piastra a 300 ×g per tre minuti a 4 gradi Celsius. Questo garantirà che gli steroidi siano posizionati centralmente in ciascun pozzetto.Successivamente, trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e lasciare solidificare il BMM dopo un'ora. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere delicatamente 100 microlitri per pozzetto di terreno di crescita completo. Mezzo o studi sull'invasione indotta da citochine o sulla valutazione di farmaci.Aggiungere citochine o inibitori al mezzo per l'acquisizione automatica delle immagini. Scansionare le piastre sul citometro a intervalli regolari. A partire dal tempo zero, selezionare l'applicazione per la confluenza.Quindi verificare che lo steroide sia a fuoco. Se necessario, regolare manualmente la messa a fuoco e correggere l'offset del fuoco nelle impostazioni di campionamento.Scansionare un singolo campo visivo centrale. Dopo l'aggiunta di BMM, i steroidi tumorali dovrebbero essere rimasti in posizione centrale. Pertanto, non è necessario scansionare l'intera pozzetta nel software.Definire le pozzette da scansionare evidenziandole sulla mappa della piastra. Quindi fare clic su avvia scansione. Per l'analisi automatica delle immagini, selezionare l'applicazione di confluenza.Nella scheda di analisi, regolare le impostazioni dell'applicazione per ottenere una segmentazione precisa attorno allo steroide, inclusi i prolungamenti cellulari e i podi dell'invadente che si estendono nel BMM. Regolare le impostazioni per ciascuna linea cellulare tumorale e/o in diversi punti temporali. Verificare che le impostazioni di analisi siano appropriate per altri steroidi nella piastra cliccando su alcune pozzette diverse.Se la segmentazione non delinea accuratamente uno steroide, regolare ulteriormente le impostazioni dell'applicazione. Fare clic su avvia analisi nella scheda dei risultati. Verificare più pozzetti per controllare la qualità dell'analisi prima di esportare i dati a livello di pozzetto in un programma di foglio elettronico.Ripetere l'analisi per tutti i punti temporali, quindi calcolare la percentuale media di confluenza per i pozzetti replicati e rappresentare l'invasione in funzione del tempo mediante un grafico a barre. Per l'acquisizione manuale delle immagini, utilizzare un microscopio invertito dotato di obiettivo 10x per registrare un'immagine per ciascun steroido tumorale a intervalli regolari, a partire da T uguale a zero fino a T compreso tra 72 e 96 ore.A seconda della velocità di invasione del rivestimento cellulare in esame, utilizzare un obiettivo Forex quando un'area invasa è troppo estesa per essere completamente inclusa nel campo visivo a 10 x. Salvare ogni singola immagine acquisita per l'analisi manuale delle immagini. Aprire le immagini della grafica dello stage nell'analisi dell'immagine.Il software scelto per la calibrazione richiede immagini di un reticolo dello stage acquisite. Utilizzando sia obiettivi 10x che 4x. Inserire le misure grafiche, le unità e gli obiettivi utilizzati ed eseguire la calibrazione.Questo passaggio è richiesto solo una volta per le analisi successive delle immagini. Ricaricare semplicemente le impostazioni di calibrazione necessarie. Successivamente, aprire le immagini dell'assay di invasione e selezionare le impostazioni di calibrazione in base all'obiettivo del microscopio utilizzato per ottenere le immagini.Misurare l'area coperta dagli steroidi nel software utilizzato. Andare su misura e selezionare conteggio dimensioni. Scegliere quindi carica impostazioni e selezionare le impostazioni predeterminate del saggio.Quindi selezionare il conteggio. Il corticosteroide deve quindi essere segmentato con precisione. Esportare le misurazioni, che corrispondono a diversi parametri, in un foglio elettronico e registrare sul foglio le informazioni relative all'immagine.Infine, tracciare l'area media di steroidi replicati o di invasioni in funzione del tempo utilizzando un software scientifico per la creazione di grafici e l'analisi statistica. Qui viene mostrato come esempio l'invasione di cellule tumorali osservata nella linea cellulare di glioblastoma U 87 MG, che può essere utilizzata come modello per illustrare l'invasione dei tumori cerebrali. Una volta incorporate nella matrice, le cellule si diffondono con un tipico modello di invasione a raggi di stella, processo che viene seguito per un periodo di 72 ore.Analisi dell'immagine completamente automatizzata. L'utilizzo di un citometro ad immagini produce una segmentazione attorno alle protrusioni cellulari e consente una quantificazione precisa dell'invasione delle cellule tumorali. Si noti che per questa linea cellulare, il corpo steroideo è escluso dalla misurazione dell'area invasa.L'analisi delle immagini completamente automatizzata viene eseguita facilmente e fornisce la quantificazione dell'invasione delle cellule tumorali nel tempo. Un diverso modello di invasione cellulare è mostrato da linee isogeniche di carcinoma a cellule squamose di testa e collo. Le linee cellulari tumorali Cal S sono sensibili, mentre CAL R è resistente agli inibitori della tirosina chinasi EGFR.In assenza di EGF, nessuna delle due linee cellulari ha invaso la BMM in presenza di protrusioni simili a dita di EGF, espulse dal corpo principale dei Cal ars steroidi. Mentre le cellule Cal s erano meno invasive dopo 72 ore, in questo caso le immagini sono state acquisite rapidamente mediante un citometro ad immagini e, per illustrare un metodo alternativo, il grado di invasione è stato quantificato manualmente utilizzando un software autonomo di analisi delle immagini. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che ogni linea cellulare deve essere ottimizzata per la capacità di formare steroidi, la densità di semina cellulare, la composizione della matrice e le impostazioni di acquisizione e analisi delle immagini. Seguendo questo procedimento, lo stesso metodo potrebbe essere adattato per valutare l'invadimento tissutale tridimensionale, utilizzando, ad esempio, tumori in co-coltura con corpi embrionali per riprodurre un tessuto complesso o altri organoidi come astrociti per il glioblastoma, colture di cripte per i tumori gastrointestinali o fegato per il carcinoma epatocellulare e le metastasi del cancro del colon.

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Un test per misurare quantitativamente fattore di crescita trasformante (TGF)-β-indotta invasione in 3-dimensionale gel collagene è descritto. Questo saggio si avvale della MCF10A serie di linee cellulari, che rappresentano diversi stadi di sviluppo del cancro al seno. Questo metodo può essere adottato per essere utilizzato con altre linee cellulari e può essere utilizzato per indagare altri potenziali attivatori o inibitori di invasione.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

Fonte: Guyon, J., et al. Un modello sferoidale 3D per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)Il video dimostra la generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali. Gli sferoidi sono formati da cellule tumorali cerebrali umane e incorporati in una matrice di collagene. Le cellule tumorali alla periferia sferoidale adottano un fenotipo invasivo, secernendo proteasi per degradare il collagene e avanzando per invadere la matrice circostante.

Generazione di un modello sferoidale tridimensionale dell'invasione delle cellule tumorali

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

I processi che governano l'invasione della vescica cancro rappresentano opportunità di biomarcatore e sviluppo terapeutico. Qui vi presentiamo un modello di invasione del cancro della vescica che incorpora 3-d cultura di sferoidi di tumore, time-lapse imaging e microscopia confocale. Questa tecnica è utile per definire le caratteristiche del processo invasivo e per lo screening di agenti terapeutici.

Sistema di coltura cellulare 3D per studiare l'invasione e la valutazione terapeutica nel cancro della vescica

Il microambiente tumorale è una parte essenziale della crescita e dell'invasione del cancro. Per simulare la progressione del carcinoma, è necessaria una matrice umana biologicamente rilevante. Questo protocollo introduce un miglioramento per il saggio di invasione sferoidale tridimensionale in vitro applicando una matrice a base di leiomioma umano. Il protocollo introduce anche un'analisi di invasione cellulare basata su computer.

Matrice a base di tumore umano in un saggio di invasione sferoide tridimensionale

L'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello in vitro 3D per studiare la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro (CAF) in un ambiente di massa tumorale, che può essere affrontato in diversi sistemi di analisi, come l'immunofluorescenza, la trascrizione l'analisi e l'imaging delle cellule di vita.

Un modello esplosivo 3D come sistema più fisiologico per la differenziazione dei fibroblasti associati al cancro e gli studi sull'invasione in vitro

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Presentato qui è un protocollo per la fabbricazione di un dispositivo di imaging sferoide. Questo dispositivo consente l'imaging a fluorescenza dinamica o longitudinale degli sferoidi delle cellule tumorali. Il protocollo offre anche una semplice procedura di elaborazione delle immagini per l'analisi dell'invasione delle cellule tumorali.

Imaging a fluorescenza risolta nel tempo e analisi dell'invasione delle cellule tumorali nel modello sferoide 3D

L'invasione è un importante fenomeno biologico nello sviluppo e nella progressione del cancro. Questo processo è influenzato dalle cellule non neoplastiche e dai componenti del microambiente tumorale. Lo scopo di questo studio è quello di descrivere un metodo alternativo per analizzare l'invasione delle cellule tumorali in vitro utilizzando colture tridimensionali (3D).

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Impara un saggio di invasione tumorale 3D semi-automatizzato per studiare il comportamento delle cellule cancerose in un ambiente fisiologicamente rilevante. Questo metodo consente il monitoraggio dell'invasione nel tempo per la ricerca oncologica.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

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