Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un saggio in vitro, semi-automatizzato e tridimensionale su micropiastra dell'invasione delle cellule tumorali. Ciò si ottiene generando prima steroidi tumorali di dimensioni riproducibili in sospensione in fondo rotondo con attacco ultrabasso 96, piastre pozzetto in una sola volta steroide in ogni pozzetto. Il secondo passo consiste nel rimuovere parti del terreno e aggiungere la membrana basale come la matrice o il BMM direttamente a ciascun pozzetto per fornire una matrice semisolida in cui le cellule tumorali invadono dal corpo steroideo.

Successivamente, l'invasione degli steroidi tumorali viene monitorata a intervalli per un periodo compreso tra 72 e 96 ore, durante il quale l'acquisizione delle immagini viene eseguita automaticamente su un citometro o manualmente su un microscopio. Il passaggio finale consiste nell'analizzare l'invasione delle cellule tumorali attraverso un citometro automatizzato o un software di imaging. In definitiva, il test 3D sull'invasione degli steroidi tumorali viene utilizzato per modellare l'invasione del cancro in vitro in un formato fisiologicamente più rilevante e suscettibile di studi di convalida mirata e screening farmacologico.

Riteniamo che questa tecnica sia complementare ai semplici saggi bidimensionali di proliferazione cellulare normalmente utilizzati per la convalida del bersaglio e lo screening dei farmaci nella ricerca sul cancro, perché ci consente anche di studiare l'invasione, che è un aspetto chiave della progressione del cancro in un formato tridimensionale fisiologicamente rilevante. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho ottimizzato il phep tumorale 3D, la crescita su micropiastra. Ho pensato che sarebbe stato bene usare la stessa configurazione e l'aspetto anche all'invasione, e il risultato è stato facile semplicemente rimuovendo una parte del terreno da ogni pozzetto e sostituendolo con la matrice simile alla membrana del basamento.

La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale in quanto mantenere gli steroidi in una posizione centrale di ogni bene dopo la tradizione del BMM può essere difficile all'inizio. Ciò può comportare un'analisi dell'immagine non ottimale a causa del fatto che gli steroidi si trovano su piani focali diversi. Con esperienza.

Questo accade raramente, ma se necessario, il processo può essere facilitato da una delicata centrifugazione della piastra. Per iniziare tutto il BMM su ICE durante la notte, conservare un set di puntali con filtro sterili per pipette P 10 E 200 e P 1000 e le provette sterili sono a meno 20 gradi Celsius. Posizionare anche le piastre a 96 pozzetti con attacco ultra basso contenenti steroidi di quattro giorni sul ghiaccio.

Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 microlitri per pozzetto di terreno di coltura dalle piastre dei passeri. Per questo gradino, inclinare la punta verso la parete interna del fondo a U. Evitando bene il contatto con il fondo del pozzo e la posizione dello sphe.

Al fine di ridurre al minimo il disturbo degli steroidi utilizzando punte ghiacciate, trasferire il BMM in tubi ghiacciati. Per l'invasione indotta da citochine o per studi di valutazione dei farmaci, aggiungere reagenti al BMM utilizzando punte ghiacciate. Ad esempio, utilizzare il fattore di crescita epidermico o EGF per stimolare l'invasione delle cellule di carcinoma squamoso Cal S e Cal r.

Quindi erogare delicatamente 100 microlitri di BMM nell'ubo. Puntare bene la punta verso la parete interna del pozzo. Questo passaggio è il più critico.

Per quanto riguarda l'analisi ottica delle immagini, gli steroidi devono rimanere al centro del, bene. Ripetere questo passaggio per tutti i pozzetti richiesti, consentendo da cinque a sei repliche per condizione. Se necessario, passare a una punta appena raffreddata utilizzando un ago sterile.

Rimuovere le bolle se presenti. Utilizzare un microscopio per controllare visivamente gli steroidi sono in una posizione centrale se non sono centrifugare la piastra a 300 volte G per tre minuti di quattro gradi Celsius. Ciò garantirà che gli steroidi siano situati centralmente in ogni pozzo.

Quindi, trasferire la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e lasciare solidificare il BMM un'ora dopo. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere delicatamente 100 microlitri per pozzetto di crescita completa. Studi di invasione indotta da mezzo o citochine o di valutazione di farmaci.

Includere citochine o inibitori nel terreno per l'acquisizione automatizzata delle immagini. Scansiona le piastre sul citometro a intervalli. A partire dal tempo zero, selezionare l'applicazione di confluenza.

Quindi controlla che lo steroide sia a fuoco. Se necessario, regolare manualmente la messa a fuoco e correggere l'offset della messa a fuoco. In Impostazioni di campionamento.

Il selettore esegue la scansione di un campo visivo centrale. Dopo l'aggiunta di BMM, gli steroidi tumorali dovrebbero essere rimasti in una posizione centrale. In questo modo non è necessario eseguire la scansione dell'intero pozzetto nel software.

Definisci i pozzetti da scansionare evidenziandoli sulla mappa delle piastre. Quindi fare clic su avvia scansione. Per l'analisi automatizzata delle immagini, selezionare l'applicazione di confluenza.

Nella scheda di analisi, regolare le impostazioni dell'applicazione per produrre una segmentazione precisa intorno allo steroide, compresi i processi cellulari e i podi invasori che si estendono nel BMM. Regolare le impostazioni per ogni linea cellulare tumorale e/o in vari punti temporali. Verificare che le impostazioni di analisi siano appropriate per altri steroidi nella piastra facendo clic su alcuni pozzetti diversi.

Se la segmentazione non delinea accuratamente uno steroide, regolare ulteriormente le impostazioni dell'applicazione. Fare clic su avvia analisi nella scheda dei risultati. Controllare più pozzetti per verificare la qualità dell'analisi prima di esportare i dati a livello di pozzo in un programma di fogli di calcolo.

Ripetere l'analisi per tutti i punti temporali, quindi calcolare la confluenza percentuale media per i pozzi replicati e l'invasione più rispetto al tempo in un grafico a barre. Utilizzando la grafica scientifica e il software statistico di scelta per l'acquisizione manuale delle immagini, utilizzare un microscopio invertito dotato dell'obiettivo 10x per registrare un'immagine per ogni steroide tumorale a intervalli. A partire da T è uguale a zero dopo che T è uguale a 72 e 96 ore.

A seconda della velocità di invasione del rivestimento cellulare in questione, utilizzare un obiettivo Forex quando un'area invasa è troppo grande per essere completamente catturata entro il campo visivo di 10 x. Salva ogni singola immagine acquisita per l'analisi manuale delle immagini. Apri le immagini del grafico dello stadio nell'analisi di imaging.

Il software di scelta per la calibrazione è costituito dalle immagini di una fase di ripresa grafica. Utilizzando sia gli obiettivi 10 x che quattro x. Inserisci le misure grafiche, le unità di misura e gli obiettivi utilizzati ed esegui la calibrazione.

Questo passaggio è necessario una sola volta per la successiva analisi dell'immagine. È sufficiente ricaricare le impostazioni di calibrazione richieste. Quindi, aprire le immagini del saggio di invasione e selezionare le impostazioni di calibrazione in base all'obiettivo del microscopio utilizzato per ottenere le immagini.

Misura l'area coperta dagli steroidi nel software utilizzato qui. Vai alla misura e seleziona la dimensione del conteggio. Scegliere le impostazioni di caricamento, quindi selezionare le impostazioni predeterminate del saggio.

Quindi scegli count. Lo steroide dovrebbe quindi essere accuratamente segmentato. Le misurazioni di esportazione sono parametri diversi in un foglio di calcolo e registrano le informazioni rilevanti sull'immagine sul foglio di calcolo.

Infine, tracciare l'area media degli steroidi replicati o dell'invasione rispetto al tempo utilizzando grafici scientifici e software statistici. Mostrato qui come esempio di invasione delle cellule tumorali osservata nella linea cellulare di glioblastoma U 87 MG, che può essere utilizzata per esemplificare l'invasione del tumore cerebrale. Una volta incorporate nelle cellule BMM diffuse con un tipico modello di invasione starburst, il processo viene seguito per un periodo di 72 ore.

Analisi delle immagini completamente automatizzata. L'uso di un citometro per immagini produce una segmentazione attorno alle sporgenze cellulari e consente una quantificazione precisa dell'invasione delle cellule tumorali. Si noti che per questa linea cellulare, il corpo steroideo è escluso dalla misurazione dell'area invasa.

L'analisi delle immagini completamente automatizzata è facile da eseguire e fornisce la quantificazione dell'invasione delle cellule tumorali nel tempo. Un diverso modello di invasione cellulare è mostrato da squamose umane, testa e collo isogeni. Le linee cellulari tumorali a cui Cal S è sensibile e CAL R è resistente agli inibitori della tirosin-chinasi EG FFR.

In assenza di EGF, nessuna delle due linee cellulari ha invaso il BMM in presenza di sporgenze simili a dita di EGF, estruse dal corpo principale degli steroidi di Cal ars. Mentre le cellule di Cal erano meno invasive dopo 72 ore, le immagini in questo caso sono state acquisite rapidamente utilizzando un citometro per immagini e, per esemplificare un metodo alternativo, il grado di invasione è stato quantificato manualmente utilizzando un software di analisi delle immagini autonomo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che ogni linea cellulare deve essere ottimizzata per la sua capacità di formare steroidi, la densità di semina cellulare, la composizione della matrice e le impostazioni dell'immagine e dell'analisi Seguendo questa procedura. Lo stesso metodo che potrebbe anche essere adattato per valutare un'invasione tissutale 3D utilizzando, ad esempio, i tumori in co-coltura con corpi embrionali per assomigliare a un tessuto complesso o altri organoidi come gli astrociti per il glioma o le colture criptate per i tumori gastrointestinali, o il fegato per il carcinoma epatocellulare e le metastasi del cancro del colon.