Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre un modello 3D di ingegneria tissutale dell'epitelio esofageo umano da utilizzare come piattaforma sperimentale. Ciò si ottiene isolando prima i fibroblasti esofagei umani normali e le cellule epiteliali da campioni di tessuto esofageo umano. Nella seconda fase, i fibroblasti vengono seminati su un acellulare epiteliale, un segno dei pori, un'impalcatura esofagea e coltivati per sette giorni.

Successivamente, lo scaffold viene invertito e le cellule epiteliali esofagee umane isolate vengono aggiunte alla coltura per quattro giorni. Nella fase finale, il modello viene spostato sull'interfaccia aria-liquido per altri cinque giorni di coltura, consentendo lo sviluppo di un epitelio stratificato maturo. In definitiva, l'immunoistochimica viene utilizzata per caratterizzare i marcatori chiave di proliferazione e differenziazione espressi dalle cellule epiteliali modello.

I principali vantaggi di questa tecnica rispetto alla coltura cellulare 2D convenzionale sono che consente alle cellule di avere le interazioni cellula, cellula e matrice cellulare che avrebbero in vivo. E usando questa tecnica, possiamo produrre un epitelio squamoso stratificato maturo simile all'esofago normale. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà per tre motivi.

Uno, può essere una sfida garantire che la maggior parte delle cellule epiteliali non si differenzi prima di essere inclusa nell'impalcatura. In secondo luogo, è necessario prestare attenzione per garantire che venga fornita la corretta interfaccia aria-liquido durante il periodo in cui l'epitelio sta maturando. E tre, può essere una sfida mantenere l'ità durante tutto il periodo della cultura.

Per isolare le cellule epiteliali esofagee umane, posizionare il tessuto della mucosa squamosa esofagea raccolto in una capsula di Petri sterile e utilizzare un bisturi sterilizzato con etanolo per tagliare il tessuto in strisce di 0,5 centimetri. Quindi incubare il tessuto in 0,1% di tryina coperto a 37 gradi Celsius, interrompendo la digestione dopo un'ora con cinque millilitri di FCS. Quindi, tenendo le strisce con una pinza, raschiare delicatamente la superficie epiteliale con la lama del bisturi per uno o due minuti per striscia per rimuovere le cellule epiteliali nel terreno circostante quando tutte le strisce sono state raschiate, trasferire il terreno contenente le cellule epiteliali staccate in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.

Dopo aver fatto girare le cellule, scartare la senna e risospendere il pellet in 12 millilitri di terreno epiteliale. Quindi scartare il terreno da una coltura di cellule ceppiformi e utilizzare una pipetta sterile per piastrare le cellule epiteliali sulle cellule di alimentazione per isolare i fibroblasti esofagei umani. Trasferisci le strisce di tessuto raschiate in una capsula di Petri sterile e infine trita il fazzoletto con il bisturi.

Digerire i pezzi in 10 millilitri di collagenasi allo 0,5%, una soluzione ricoperta a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica con un'atmosfera umidificata per una notte. Il giorno successivo, trasferire il digestato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e far girare le cellule. Resus sospendendo il palato in 10 millilitri di terreno di coltura di fibroblasti.

La coltura in un pallone T 75 in un incubatore per colture cellulari. Per preparare gli scaffold esofagei di maiale decellularizzati, si inizia utilizzando le forbici e un paio di pinzette per aprire longitudinalmente un esofago di maiale. Successivamente, lavare l'esofago in un vaso sterile da 180 millilitri contenente 100 millilitri di PBS sterile per 10 minuti agitando delicatamente per rimuovere eventuali detriti giornalieri durante il risciacquo del fazzoletto.

Spruzzare una tavola di dissezione del sughero con etanolo al 70% quando il sughero è asciutto nell'esofago sulla tavola con il lato della mucosa rivolto verso l'alto. Ora, usa una pinzetta sterile per afferrare la superficie della mucosa a un'estremità dell'esofago e tirare via il tessuto dalla tavola per separare la mucosa dalla sottomucosa sottostante. Quindi, utilizzando una lama di bisturi sterile, sezionare l'esofago longitudinalmente lungo la lanare propria, rimuovendo i perni man mano che la dissezione progredisce per consentire il sollevamento della mucosa.

Scartare la sottomucosa sottostante e utilizzare un bisturi per tagliare la mucosa rimanente in pezzi quadrati di cinque centimetri. Lavare i pezzi in 150 millilitri di PBS sterile con una leggera agitazione come appena dimostrato. Dopo cinque minuti, trasferire il tessuto in un vaso da 180 millilitri contenente 150 millilitri di soluzione di cloruro di sodio molare.

Integrato con antibiotici a 37 gradi. Dopo 72 ore, trasferire il tessuto in 150 millilitri di PBS sterile, a quel punto l'epitelio avrà iniziato a separarsi visibilmente dal tessuto sottostante. Utilizzare una pinza sterile e una lama di bisturi per rimuovere l'epitelio che si stacca e posizionare il tessuto rimanente in un vaso fresco da 150 millilitri di PBS sterile con tre lavaggi di cinque minuti con una leggera agitazione, il tessuto deve ora essere conservato in glicerolo per un minimo di quattro mesi.

Per sterilizzare completamente l'impalcatura, iniziare la preparazione del modello di mucosa esofagea reidratando pezzi di impalcatura suina che sono stati sterilizzati in glicerolo per almeno quattro mesi. In 100 millilitri di PBS sterile per cinque agitazioni di 10 minuti. Sostituzione del supinato con PBS fresco per ogni lavaggio.

Dopo la quinta prova di agitazione lo scaffold è stato sottoposto a un'incubazione notturna in 100 millilitri di DMEM a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, trasferire gli scaffold in pozzetti individuali con una piastra a sei pozzetti rivolta verso l'alto della sottomucosa. Quindi posizionare un anello sterile in acciaio inossidabile di grado medico al centro di ciascuna impalcatura e utilizzare una pinza sterile per premere delicatamente sugli anelli per garantire un'adeguata tenuta con il tessuto per cinque volte.

Centrare i cinque fibroblasti esofagei umani in 0,2 millilitri di terreno fibroblando al centro di ciascun anello. Quindi inondare l'area intorno all'esterno dell'anello con almeno altri due millilitri di terreno fibroblastico e incubare gli scaffold in un incubatore per colture cellulari. Dopo 24 ore, rimuovere gli anelli e sostituire il terreno in ogni pozzetto con almeno cinque millilitri di fibroblasti freschi.

Medio, avendo cura che i ponteggi siano totalmente immersi. Dopo una settimana, scartare il terreno e utilizzare una pinza per capovolgere la superficie della mucosa dell'impalcatura a faccia in su. Riposizionare gli anelli sugli scaffold, quindi aggiungere un centro temporale delle sei cellule epiteliali in 0,2 millilitri di terreno composito, uno al centro di ciascun anello.

Tappare l'area esterna all'anello con circa due millilitri di terreno composito e rimettere i costrutti nell'incubatrice. Dopo 24 ore, rimuovere gli anelli e sostituire il terreno in ogni pozzetto con almeno cinque millilitri di terreno composito fresco, uno, assicurandosi che gli scaffold siano completamente sommersi. Dopo altre 24 ore, sostituire il terreno con almeno cinque millilitri di terreno composito. Due.

Il quarto giorno, posizionare griglie sterili in rete di acciaio inossidabile di grado medico nei pozzetti di una nuova piastra a sei pozzetti e trasferire i costrutti sulle griglie con la mucosa rivolta verso l'alto. Infine, aggiungere una quantità sufficiente di terreno composito tre per raggiungere la parte inferiore del composito lasciando la superficie esposta all'aria, assicurandosi che il campione sia mantenuto in un'interfaccia aria-liquido. La parte più complicata della procedura è l'impostazione dell'interfaccia aria-liquido.

Se non è chiaro se la griglia è in contatto con un liquido con una punta sterile per tubi, è più facile vedere se il tubo è sommerso. In alternativa, puoi provare a far oscillare delicatamente la piastra in quanto è più facile vedere il liquido quando è in movimento e controllare che ci sia del liquido sulla griglia e non copra il campione. Questo, la valutazione logica dell'epitelio presenta un epitelio squamoso stratificato multistrato maturo, simile ma più sottile a quello osservato con il normale esofago umano con le cellule che diventano progressivamente più piatte e infine un nucleare mentre migrano verso la superficie.

La caratterizzazione immunoistochimica dei principali marcatori di proliferazione e differenziamento dimostra che la microanatomia dell'epitelio modello è simile a quella del normale epitelio esofageo umano. Ad esempio, un'espressione comparabile della citocheratina 14 è stata osservata sia nell'esofago nativo che nell'epitelio modello con colorazione limitata alle cellule nello strato basale. Questo modello è stato modificato con successo per incorporare cellule tumorali sostituendo le cellule epiteliali primarie con cellule di carcinoma dimostrando la flessibilità del modello.

Ad esempio, le cellule di carcinoma squamoso producono un epitelio visibile sul costrutto come una regione gialla definita con grandi fessure all'interno dell'epitelio, che probabilmente riflette la presenza di molecole di cellia disfunzionali, comprese le cellule di adenocarcinoma esofageo all'interno del modello che provoca una grande quantità di degradazione dell'impalcatura visibile all'occhio come un assottigliamento dell'impalcatura. Dopo due settimane di crescita all'interfaccia aria-liquido e confermato nell'analisi h ed e come un'evidente riduzione dello spessore dell'impalcatura nella regione sotto le cellule Seguendo questa procedura, altri metodi di espressione genica come il northern o western blotting possono essere applicati allo stesso tessuto per rispondere a domande come, Come risponde l'epitelio agli stress ambientali? Quindi questo fornisce una risorsa davvero preziosa per esaminare più domande in modo più approfondito dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori interessati alla metaplasia di Barrett per studiare l'effetto dell'esposizione a specifici componenti del reflusso sull'espressione genica nell'esofago umano normale.