Name: Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri un metodo enzimatico per isolare cellule staminali mesenchimali da coaguli di midollo osseo usando l'urochinasi. Questa tecnica rapida ed economica consente di recuperare campioni altrimenti scartati per la ricerca rigenerativa.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale Svizzera Grant CR3I3_140717/1 e dalla Fondazione Svizzera per Paraplegici.

NOTA: aspirati di midollo osseo umano dalla cresta iliaca sono stati raccolti da donatori consenzienti, con l&#39;approvazione del comitato etico del cantone di Lucerna. Canine aspirati di midollo osseo da cresta iliaca sono stati raccolti con consent.Human del proprietario del cane (circa. 20 ml) e canino (circa. 10 ml) aspirati di midollo osseo erano anti-coagulato per aggiunta di 15 ml di 3,8% di citrato di sodio immediatamente dopo la sospensione in sala operatoria. I campioni sono stati trasferiti al ambiente di laboratorio per la lavorazione lo stesso giorno ritirata. 1. Preparazione di Urokinase (Prima del 1 ° Use) <ol><li> Ricostituire urokinase utilizzando sterile tampone fosfato salino (PBS) secondo le istruzioni del produttore: Aggiungere 10 ml di PBS al pallone setto-ingresso utilizzando una siringa da 10 ml. Sciogliere la sostanza secca agitando per ottenere 50.000 unità di iniezione (U) per ml. </li><li> Preparare 500 microlitri aliquote (25.000 U ciascuno) in stubi terile. Conservare aliquote -20 ° C e utilizzare quando richiesto per almeno 6 mesi. </li></ol> 2. preparative Steps (prima di ogni midollo osseo Treatment) <ol><li> Scongelare una aliquota di urochinasi (25.000 U) per coagulato aspirato midollare (volumi di aspirato fino a 25 ml sono stati trattati con successo con una sola aliquota di 25.000 U). </li><li> Preriscaldare un bagno d&#39;acqua o agitazione incubatore a 37 ° C. </li></ol> 3. enzimatica Digest del Clot <ol><li> Eseguire tutti i lavori in una cappa a flusso laminare biosicurezza per evitare la contaminazione microbica dei campioni di midollo osseo durante la lavorazione. Quando si lavora con materiale umano potenzialmente infetto, è consigliato l&#39;uso di guanti protettivi e una gestione attenta. </li><li> Inserire un filtro 100 micron cella sulla cima di una provetta sterile da 50 ml. Versare con cautela l&#39;aspirato midollare attraverso il filtro delle cellule, inclinando il filtro o spostamento in materiale coagulo. Utilizzare un puntale sterile permigliore flusso attraverso le maglie del filtro. NOTA: Evitare qualsiasi diluizione del coagulo, ad esempio, lavando il coagulo con PBS. Urokinase agisce indirettamente e richiede componenti del siero (es., Del plasminogeno) dalla biopsia per un&#39;efficace digest. Continuando la procedura con il materiale del coagulo, il filtrato può essere conservato a temperatura ambiente fino a nuovo uso nel passo 3.6. </li><li> Trasferire il materiale coagulo midollo osseo in un piatto di coltura cellulare vuota con pinza sterile. Tagliare i detriti in piccoli pezzi di circa 2 mm 3 utilizzando un bisturi sterile. </li><li> Trasferire i piccoli pezzi di coagulo in una provetta da 50 ml utilizzando le pinze sterili. Assicurarsi che il coagulo tritato ha un aspetto bagnato. Se sembra essere asciutto, utilizzare alcune delle filtrato dal punto 3.1 per inumidire. </li><li> Triturare il coagulo pipettando su e giù per 5 volte con un 5 ml microtitolo pipetta. Aggiungere 1 aliquota urochinasi al campione. Incubare per 30 minuti a 37 ° C sia a bagnomaria o inun scuotimento (leggermente) incubatore. </li><li> Triturare pipettando su e giù per 5 volte con una pipetta 5 ml. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza. Incubare per altri 30 min a 37 ° C. Dopo l&#39;incubazione, triturare ancora 5 volte con un 5 ml pipetta. Passare su una nuova 100 micron filtro cella di mettere in comune con il filtrato dal punto 3.2. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a temperatura ambiente per 10 min a 500 x g. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in media come descritto di seguito o secondo la procedura standard di laboratorio per la cultura espansione MSC. </li></ol> 4. Semina per la Cultura di espansione cellulare e Piastre CFU <ol><li> Risospendere le cellule (comprensivi di eritrociti e cellule mononucleari) in 50 ml di terreno di base: Alpha-MEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e 2,5 mg / ml di amfotericina B . Contare le cellule 01:10 diluito in soluzione Trypan Blue con un chambe Neubauerr. </li><li> Piastra le cellule in fiasche di coltura cellulare alla densità di 5 x 10 7 cellule / cm 2 e incubare in un incubatore umidificato a 37 ° C. Se disponibile, utilizzare ipossiche (5% di ossigeno) condizioni. Per il controllo del test CFU, piatto 10 9 cellule in un piatto di coltura cellulare di 10 cm di diametro. </li><li> Dopo 3 giorni di coltura, le cellule staminali mesenchimali sono fissate al piatto di coltura cellulare, mentre altre cellule rimangono in sospensione. Cambiare la media con terreno base integrato con 5 ng / ml di base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF). Per il controllo del test CFU, trattare il piatto di coltura cellulare allo stesso modo. </li><li> Continuare coltura cellulare per un totale di 2 settimane, scambiando supporti tre volte alla settimana. Se le cellule superano l&#39;80% di confluenza, raggruppati per tripsinizzazione. Per il controllo del dosaggio CFU, scambiare media similmente, ma non dividere le celle per il corso di due settimane. </li></ol> 5. Giemsa per Assay CFU <ol><li> Preparare 10 ml di Giemsa soluzione per ogni piatto: dilute soluzione di riserva (7,6 g / l Giemsa in glicerolo: metanolo) 1:10 in acqua sterile (preparare sempre una diluizione di lavoro fresco). </li><li> Rimuovere il supporto dal piatto di coltura cellulare e lavare le cellule con PBS. Essere molto precautious quando si applica il liquido alla capsula di Petri e di evitare lavare via le cellule. </li><li> Fissare cellule in metanolo puro per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il metanolo. Aggiungere la Giemsa soluzione e incubare per 60 minuti in un incubatore umidificato a 37 ° C. </li><li> Lavare due volte con PBS. Far asciugare il capo piastra prima su un tovagliolo di carta. Contare le colonie manualmente. Ciò si ottiene con un pennarello sul retro della piastra. </li></ol> 6. MSC Differenziazione <ol><li> MSC Canine differenziazione NOTA: MSC Canine sono state differenziate in condrogenica, osteogenico e lignaggi adipogenico dalla stimolazione con il supporto appropriato per quattro settimane. </li><li> Per Differenziazione adipogenico, MSC cultura in monostrato a 4 x 10 5 cells / cm 2 alternando due diverse condizioni di coltura come segue; <ol><li> Culture in mezzi di manutenzione adipogenesi contenente DMEM + Glutamax, 3% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 ug / ml di amfotericina B e insulina 170 mM. </li><li> Cultura in adipogenesi mezzi indurre con terreno di mantenimento integrato con il 3% FBS, siero di coniglio 5%, 1 micron desametasone, a 500 micron 3 Isobutyl-1-metilxantina, 33 micron biotina, 5 micron rosiglitazone e 17 micron pantotenato 16. </li><li> Revel le goccioline lipidiche dalla colorazione con Oil Red-O. In breve, riparare le cellule con il 10% di formaldeide, lavare con PBS e macchiare con il 0,35% di olio O rosso in isopropanolo. </li></ol></li><li> Per la cultura differenziazione osteogenica MSC in monostrato a 7 x 10 3 cellule / cm 2 e stimolare il seguente: <ol><li> Avanzata DMEM (GIBCO) + Glutamax, 5% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 ug / ml di amfotericina B, 501; M di acido L-ascorbico 2-fosfato 10 mM ß-glicerofosfato e 100 nM desametasone. </li><li> Identificare i depositi di mineralizzazione di macchia Von Kossa (5% AgNO 3). In breve, fissare le cellule con il 10% di formaldeide, lavare con PBS e macchia con 5% AgNO 3 in acqua distillata. </li></ol></li><li> Differenziazione condrogeniche <ol><li> Cubi Cut (3 mm per lato) da un dispositivo medico a forma di spugna, costituite da liofilizzato collagene di tipo I, e utilizzati come materiale scaffold per sostenere le cellule 17. </li><li> MSC seme sulla sommità dei cubetti alla concentrazione di 4 x 10 6 cellule / ml (~ 70.000 cellule / cubo). </li><li> Prima dell&#39;aggiunta di supporto, permettono alle cellule di aderire ai cubi per 30 min. </li><li> Mantenere costrutti MSC-collagene nei media condrogenica comprensivi di DMEM / F12 + Glutamax, 2,5% FBS, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 2,5 mg / ml di amfotericina B, 40 ng / desametasone ml, 50 mg / ml ascorbico acido 2-fosfato,50 mg / ml L-prolina, 1x Insulin-transferrina-Selenio X, e 10 ng / ml fattore di crescita trasformante-β1. </li><li> Utilizzare Alcian colorazione blu di visualizzare l&#39;accumulo di proteoglicani in costrutti sezioni. In breve, macchiare sezioni O / N con 0,4% blu Alcian sciolta in 0,01% H 2 SO 4 e 0,5 M guanidina cloridrato. Avanti, lavare le sezioni sono state lavate per 30 minuti nel 40% DMSO e 0,05M MgCl 2. Le cellule sono state di contrasto con rosso veloce nucleare. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ordinariamente campioniamo midollo osseo mentre il paziente sta subendo chirurgia (nel nostro caso principalmente chirurgia della colonna vertebrale), con il vantaggio che solo il lavoro poco aggiuntiva deve essere effettuata da personale della sala operatoria. Anche se i campioni vengono mescolati con citrato di sodio immediatamente dopo il ritiro, molti campioni sono stati parzialmente coagulato quando sono arrivati ​​in laboratorio per l&#39;elaborazione. In questa fase, ricampionamento per sostituire i campioni coag...

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) svolgono un ruolo importante nella medicina rigenerativa e dell&#39;ingegneria dei tessuti. Essi possono migrare, differenziarsi in vari tipi di cellule 1 e innestare, che li rende i candidati ideali per terapie autologhe 2,3. Ultimamente, gli studi clinici che utilizzano cellule staminali mesenchimali per la riparazione delle ossa e della cartilagine, graft versus host disease o malattia cardiaca sono stati lanciati 4. Questi MSC possono essere raccolte dal tessuto adiposo o cordone ombelicale, ma i risultati più promettenti sono stati ottenuti da midollo osseo cellule staminali derivate 5. La cresta iliaca permette di raccogliere una notevole quantità di midollo osseo e serve quindi come sito principale di aspirazione 6. Tuttavia, la qualità del aspirato diminuisce con l&#39;aumento del volume di midollo osseo prelevato. Mentre i primi 5 ml di midollo osseo contengono cellule staminali mesenchimali di alta qualità, ritiro delle maggiori volumi porta alla diluizione del aspirato con sangue periferico fROM l&#39;osso altamente vascolarizzato 7. A causa delle attuali megacariociti e piastrine, aspirati di midollo osseo sono inclini a coagulazione, a meno di utilizzare anticoagulanti. Ma anche con anticoagulanti, possono verificarsi la formazione di coaguli. Nel midollo osseo, cellule staminali mesenchimali rappresentano solo una piccola parte del pool di cellule totale 8 e devono essere espansa in coltura per più ingegneria dei tessuti o applicazioni terapeutiche 4. La qualità di una tale cultura dipende in gran parte la piscina cellula iniziale, vale a dire., La diversità e un alto numero di partenza 9. Basso numero di cellule staminali mesenchimali da prelievi possono essere in parte spiegati dalla variabilità dei donatori. D&#39;altra parte, MSC da campioni bassa qualità richiedono tempo maggiore di cultura e passaging esteso a raggiungere il numero desiderato di celle. In entrambi i casi, passaging esteso è fonte di senescenza cellulare e può portare alla perdita di differenziazione potenziale 10. Pertanto, i protocolli in grado di massimizzare cellulare y ottimizzatoield ed evitare effetti nocivi devono essere sviluppati 11,12. Quando abbiamo cominciato a lavorare con MSC canina, siamo stati sorpresi di vedere che circa tre su quattro campioni di midollo osseo canini contenuti coaguli, mentre i campioni umani fortunatamente coagulato (uno su dieci) erano meno frequenti. D&#39;altra parte è stata una sorpresa, che abbiamo osservato rendimenti molto più bassi di cellule staminali mesenchimali da campioni coagulati. Per risolvere il problema ricorrente dei campioni coagulati, abbiamo sviluppato il protocollo con il urokinase droga trombolitico invece di ricampionamento. Terapie trombolitici possono contrastare in pericolo di vita situazioni come l&#39;occlusione dei vasi sanguigni, causando un attacco di cuore, ictus o embolie a causa di coagulazione indesiderati. Funzionano degradazione dei coaguli attraverso taglio enzimatico di fibrina da plasmina e del plasminogeno attivatori enzimatici. Nonostante l&#39;ampio uso per il trattamento di pazienti, solo pochissime pubblicazioni esistono che le attività trombolitici utilizzate, c&#39;eper applicazioni di laboratorio per salvare campioni coagulati, soprattutto concentrandosi su linfociti. Nel 1987, Niku et al. descritto l&#39;uso di streptochinasi per dissolvere i coaguli di sangue con conseguente linfociti funzionali 13 e quattro anni dopo, De Vis et al. esteso l&#39;uso di streptochinasi per isolare cellule leucemiche dal sangue e del midollo osseo per le applicazioni di citometria a flusso 14. Una pubblicazione più recente suggerisce l&#39;uso di Alteplase per la diagnostica del cancro 15. Mentre si utilizza lo stesso approccio enzimatico, il nostro protocollo si concentra su l&#39;isolamento di cellule staminali mesenchimali multipotenti forma di midollo osseo per fornire uno strumento per i ricercatori nel campo delle cellule staminali.

<table><tbody><tr>Componenti <td></td><td></td><td></td><td>medi basali</td></tr><tr><td>PenStrep 100X</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>umano FGF-base</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha con nucleoside, con glutammina stabile</td><td>Amimed</td><td>1-23S50-I</td><td></td></tr><tr><td>FBS Amimed inattivato a caldo</td><td></td><td>2-01F36-I</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Applichem</td><td>A1907</td><td></td></tr><tr>Componenti <td></td><td></td><td></td><td>medi adipogenici</td></tr><tr><td>DMEM-HAM F12 + GlutaMAX</td><td>Amimed</td><td>1-26F09-I</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>Siero di coniglio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>16120099</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Applichem</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Biotina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>Pantotenato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>Olio Rosso-O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Componenti medi osteogenici Acido</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato d'argento (AgNO3)</td><td>Sigma</td><td>S6506</td><td></td></tr><tr><td>Componenti</td><td></td><td></td><td></td> medi condrogenici</tr><tr><td>Biopad - dispositivo medico a forma di spugna&nbsp;</td><td>Euroresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma</td><td>P5607</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita trasformante umano-&beta; 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Nucleare veloce rosso</td><td>Sigma</td><td>N8002</td><td></td></tr><tr><td>Generico</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodium citrato diidrato</td><td>Applichem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Applichem</td><td>964.9100</td><td></td></tr><tr><td>Urochinasi</td><td>Medac</td><td>1976826</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Colorazione di Giemsa</td><td>Applichem</td><td>A0885</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Applichem</td><td>A0877</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico (H2SO4)</td><td>Applichem</td><td>A0655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Applichem</td><td>A3618</td><td></td></tr><tr><td>Guanidina cloridrato</td><td>Applichem</td><td>A1499</td><td></td></tr><tr><td>Materiali di consumo Provetta</td><td></td><td></td><td></td></tr> di <tr><td>reazione da 50 ml</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Ago Sterican (22G)</td><td>Braun</td><td>4657624</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette da 1,7 ml</td><td>Brunschwig</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; filtro cellulare m</td><td>Falcon</td><td>6.05935</td><td></td></tr><tr><td>pinza sterile</td><td>Bastos Viegas, SA</td><td>489-001</td><td></td></tr><tr><td>bisturi sterile</td><td>Braun</td><td>5518059</td><td></td></tr><tr><td>Primaria piatto di coltura cellulare</td><td>Falcon</td><td>353803</td><td></td></tr><tr><td>C-Chip Neubauer Improved</td><td>Bioswisstech</td><td>505050</td><td></td></tr><tr><td>pallone per colture cellulari - Flask T300</td><td>TPP</td><td>90301</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cabina di biosicurezza microbiologica classe II</td><td>Skan</td><td>82011500</td><td></td></tr><tr><td>bagnomaria</td><td>Memmert</td><td>1305.0377</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes Pipetta sierologica 5ml</td><td>Corning</td><td>4487-200ea</td><td></td></tr><tr><td>microscopio</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>incubatore umidificato Heracells 240</td><td>Thermo 51026331</td><td></td><td></td>scientifico</tr><tr><td>Heraeus Multifuge 1S-R</td><td>Thermo scientific</td><td>75004331</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) - solitamente ottenute dal midollo osseo - richiedono spesso una coltura di espansione. Il nostro protocollo utilizza l'urochinasi di grado clinico per degradare i coaguli nel midollo osseo e rilasciare MSC per un ulteriore utilizzo. Questo protocollo fornisce un'alternativa rapida ed economica al ricampionamento del midollo osseo. Il midollo osseo è una delle principali fonti di MSC, che sono interessanti per l'ingegneria tissutale e le terapie con cellule staminali autologhe. Dopo la sospensione, il midollo osseo può coagulare, poiché comprende tutto il sistema ematopoietico. I coaguli risultanti contengono anche MSC che vengono perse per la coltura di espansione o la terapia diretta con cellule staminali. Abbiamo sperimentato che il 74% dei campioni di midollo osseo canino conteneva coaguli e produceva meno della metà del numero di cellule staminali previsto dai campioni non coagulati. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo per la digestione enzimatica di quei coaguli per evitare il ricampionamento del midollo osseo intenso e costoso. L'urochinasi, un farmaco trombolitico clinicamente approvato e prontamente disponibile, elimina quasi completamente i coaguli del midollo osseo. Di conseguenza, gli aspirati di midollo osseo trattati producono un numero di MSC simile a quello dei campioni non coagulati. Inoltre, dopo il trattamento con urochinasi, le cellule hanno mantenuto la loro attività metabolica e la capacità di differenziarsi in linee condrogeniche, osteogeniche e adipogeniche. Il nostro protocollo recupera campioni di sangue coagulato e midollo osseo senza compromettere la qualità delle cellule. Questo ricampionamento obsoleto, riduce notevolmente i costi di campionamento e consente l'uso di campioni coagulati per la ricerca o la terapia.

I fatti che il 74% dei campioni di midollo osseo canino (n = 54) conteneva coaguli quando sono arrivati ​​nel nostro laboratorio (Figura 1A) insieme con diminuzione dei rendimenti MSC da questi campioni, ci ha fatto credere che un numero considerevole di MSC era intrappolato all&#39;interno dei coaguli . Infatti, un semplice DAPI-macchia di materiale coagulo sezionata conferma la presenza di cellule nucleate in alta densità (Figura 1B). Questo conduce infine a un basso numero di cellule...

Le cellule staminali mesenchimali sono solitamente ottenute dal midollo osseo e richiedono una coltura di espansione. Quando i campioni coagulano prima dell'elaborazione, è possibile applicare un protocollo che utilizza il farmaco trombolitico (enzimatico) urochinasi per degradare il coagulo. In questo modo, le cellule vengono rilasciate e disponibili per la coltura di espansione. Questo protocollo fornisce un'alternativa rapida ed economica al ricampionamento.

Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

L'obiettivo generale di questa procedura è sfruttare i campioni di midollo osseo coagulato digerendo i coaguli con l'urochinasi. Questo viene ottenuto filtrando innanzitutto il campione di midollo osseo attraverso un filtro per cellule. Successivamente, il coagulo di midollo osseo viene tagliato in piccoli pezzi.Quindi, il coagulo viene trasferito in una provetta Falcon e digerito utilizzando l'urochinasi. Infine, il materiale del coagulo digerito viene seminato per l'espansione delle cellule staminali mesenchimali o MSC. In ultima analisi, le piastre vengono confrontate con una piastra di controllo utilizzando em sustain per valutare l'efficacia della digestione.Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia o la diagnosi con cellule staminali autologhe. Poiché il trapianto richiede l'espansione e la differenziazione di un elevato numero di cellule staminali. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che molti campioni di midollo osseo provenienti dal DOC erano coagulati al loro arrivo nel nostro laboratorio.Non volevamo semplicemente gettare campioni così preziosi per ricostituire l'urochinasi. Iniettare 10 millilitri di PBS sterile nel flacone con ingresso settato e vortexare per sciogliere fino a una concentrazione di 50.000 unità per millilitro. Aliquotare 500 microlitri contenenti ciascuno 25.000 unità in provette sterili e conservare a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di sei mesi per eseguire una reazione di digestione. Scongelare un'aliquote di urochinasi per ogni campione di aspirato midollare torbido fino a 25 millilitri.Riscaldare preventivamente un bagnomaria o un incubatore agitatore a 37 gradi Celsius sotto una cappa a flusso laminare. Indossando guanti, posizionare un filtro cellulare da 100 micrometri sulla sommità di un tubo da 50 millilitri. Versare con attenzione l'aspirato midollare attraverso il filtro cellulare, inclinando il filtro o muovendo il materiale coagulato.Versare con attenzione l'aspirato del midollo osseo attraverso il filtro cellulare senza inclinare il filtro né muovere il materiale del coagulo. Utilizzare una pipetta sterile per favorire un migliore passaggio attraverso la maglia del filtro, insieme a pinze sterili. Trasferire il materiale del coagulo midollare in una piastra per colture cellulari vuota.Quindi, utilizzare un bisturi sterile per tagliare i detriti in pezzi cubici di due millimetri. Successivamente, con una pipetta microlitrica da cinque millilitri, triturare il coagulo aspirando e dispensando cinque volte. Aggiungere quindi un'aliquote di urochinasi al campione e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un bagnomaria o in un incubatore agitato.Dopo l'incubazione nell'armadio a sicurezza biologica, si esegue nuovamente la titolazione e si incuba per ulteriori 30 minuti. Successivamente si titola altre cinque volte e si fa passare il campione attraverso un nuovo filtro cellulare da 100 micrometri, raccogliendo il filtrato insieme a quello iniziale. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g e a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver eliminato il soprannatante, utilizzare 50 millilitri di mezzo basale per risospendere il pellet.Utilizzando la soluzione di blu di trian, diluire un quadrante ALI di cellule ri-sospese di uno a 10 e aggiungere la sospensione a una camera di Neubauer per contarle. Dopo aver contato le cellule, seminarle in fiasche per colture cellulari a una densità di cinque per 10 alla sette cellule per centimetro cubo per la piastra di controllo del saggio CFU.10 alla nona cellule in una piastra circolare per colture cellulari di 10 centimetri di diametro, incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius. Dopo tre giorni di coltura, le MSC si attaccheranno alla piastra per colture cellulari mentre le altre cellule rimarranno in sospensione. Utilizzare mezzo basale contenente cinque nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti di base per sostituire il mezzo sia nelle piastre sperimentali che in quelle di controllo.Continuare la coltura per un totale di due settimane, cambiando il mezzo tre volte alla settimana. Se le cellule superano l'80% di confluenza, trattare la coltura con tripsina e suddividerla per eseguire il saggio CFU.Preparare 10 millilitri di soluzione GSA per piastra utilizzando acqua sterile per diluire la soluzione madre. Da uno a 10. Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura cellulare e utilizzare PBS per lavare accuratamente le cellule con metanolo puro.Fissare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, eliminare il metanolo e aggiungere la soluzione gemsa. Incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 60 minuti dopo l'incubazione.Usare PBS per lavare le cellule due volte. Quindi lasciare asciugare l'intera piastra all'aria. Appoggiarla per prima su un tovagliolo di carta con un pennarello sul retro della piastra.Contare manualmente le colonie per la differenziazione adipogenica. Coltivare le MSC in monostrato a quattro volte 10 alla quinta cellule per centimetro quadrato. Alternare tra due diverse condizioni di coltura per la prima condizione.Coltivare le cellule in un mezzo di mantenimento per l'adipogenesi e, per la seconda condizione, coltivare le cellule. Utilizzare un mezzo di induzione dell'adipogenesi insieme al mezzo di mantenimento secondo le ricette descritte nel protocollo testuale. Per visualizzare le goccioline lipidiche, fissare brevemente le cellule con formaldeide al 10%.Quindi lavare le cellule con PBS prima di utilizzare l'Oil Red O allo 0,35% in isopropanolo per colorare le cellule destinate alla differenziazione osteogenica. Coltivare le MSC in monocstrato a una densità di sette volte 10 alla terza cellule per centimetro quadrato. Dopo aver stimolato le cellule utilizzando il mezzo descritto nel protocollo del testo, fissare brevemente le cellule con formaldeide al 10%. Una volta lavate le cellule con PBS, utilizzare la colorazione di Von Kossa per identificare i depositi minerali al fine di eseguire la differenziazione osteogenica da un dispositivo medico di forma spugnosa costituito da cubetti di collagene di tipo I liofilizzato, con lati di tre millimetri. Seminare le MSC sulla superficie dei cubetti a una concentrazione di quattro volte 10 alla ottava cellule per millilitro, dopo aver lasciato aderire le cellule ai cubetti per 30 minuti a temperatura ambiente.Mantenere i costrutti di collagene MSC nel mezzo congenico come indicato nel protocollo testuale. Aggiungere la soluzione al 0,4% di Ian Blue alle sezioni e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, utilizzare DMSO al 40% e cloruro di magnesio 0,05 molare per lavare le cellule per 30 minuti prima di usare il rosso nucleare rapido per la colorazione di contrasto delle cellule, come qui dimostrato.Una semplice colorazione con DAPI di una sezione del materiale del coagulo conferma la presenza di cellule nucleate ad alta densità, indicando che un numero considerevole di MSC è intrappolato all'interno dei coaguli. Utilizzando il protocollo descritto in questo video, il trattamento con urochinasi ha permesso la digestione di tutto tranne il 15% in peso dei coaguli di sangue canino e il 9% in peso dei coaguli umani, al fine di determinare l'efficacia della digestione con urochinasi. Le cellule provenienti dai filtrati del campione coagulato e dai coaguli digeriti sono state seminate separatamente e incubate per due settimane.La coltura sostenuta delle cellule ha mostrato 3,8 volte più UFC nei campioni canini digeriti con urochinasi rispetto ai corrispondenti filtrati iniziali. I campioni umani digeriti hanno mostrato 1,6 volte più UFC rispetto ai filtrati non digeriti. In questo esperimento, le cellule staminali mesenchimali provenienti da coaguli di midollo osseo sono state confrontate con quelle derivate da campioni di midollo osseo coagulato dell'UNC per valutarne la capacità di differenziarsi in condizioni di coltura appropriate.Dopo quattro settimane di coltura, è stato possibile differenziare le cellule staminali mesenchimali (MSC) da campioni digeriti in linee adipogeniche, osteogeniche e congeniche. Inoltre, le colorazioni con von Kossa, rosso O e blu di Sian indicavano assenza di differenze nel grado di differenziazione tra i gruppi. Una volta acquisita padronanza, Mr.Nick può essere eseguito in circa un'ora e mezza se effettuato correttamente.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule staminali ematiche me per la coltura di espansione, anche se i tuoi campioni sono coagulati invece di scartare il campione. Il nostro protocollo utilizza l'enzima chinasi per digerire il coagulo e le cellule staminali ES per la coltura di espansione.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.

L&#39;isolamento e l&#39;arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate

Un metodo per analizzare la distribuzione di progenitori midollari ematopoietiche citometria di flusso e per isolare in modo efficiente altamente purificate cellule staminali ematopoietiche (CSE) è descritto. La procedura di isolamento è essenzialmente basata su un arricchimento magnetico di c-kit + e le cellule di separazione delle cellule per purificare CSE per studi cellulari e molecolari.

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) hanno un potenziale di differenziazione verso la linea osteoblastica quando vengono stimolate con fattori solubili o biomateriali specifici. Questo lavoro presenta una nuova opzione per la somministrazione di MSC dalla membrana amniotica umana (AM-hMSCs) che impiega la matrice ossea bovina Nukbone (NKB) come scaffold.

Isolamento di cellule staminali mesenchimali umane e la loro coltivazione in poroso Bone Matrix

Coltura umane cellule mesenchimali stromali (hMSCs) con siero autologo, riduce i rischi di rigetto di materiale xenogenico e altri effetti negativi. Esso permette inoltre il recupero di un sottoinsieme di progenitori mesodermici, che può trasportare hMSCs freschi. Incorporare hMSCs in un coagulo di fibrina autologa consente una facile maneggevolezza ed efficace impianto chirurgico.

Mesenchimali stromali coltura cellulare e la consegna in autologhi Condizioni: un approccio intelligente per applicazioni ortopediche

Questo protocollo viene illustrata una procedura sicura ed efficace per modificare CD133+ cellule staminali ematopoietiche. L'approccio non-virale, magnetico presentato basato su polyplex può fornire una base per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali anche per quanto riguarda il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica.

Protocollo per il trasferimento di MicroRNA in adulto cellule staminali emopoietiche derivate da midollo osseo per abilitare ingegneria cellulare combinata con il Targeting magnetico

Questo protocollo fornisce un metodo privo di enzimi per isolare le cellule staminali mesenchymal da campioni di abdominoplastica e lipoaspirati utilizzando un metodo explant. L'assenza di enzimi duri o passaggi di centrifugazione prevede cellule staminali clinicamente rilevanti che possono essere utilizzate per studi in vitro o trasferite di nuovo alla clinica.

Un metodo privo di enzimi per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali mesenchimale derivate dall'Adipo

Questo protocollo descrive l'uso della selezione cellulare attivata dalla fluorescenza di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando il metodo di selezione a singola cellula. In particolare, l'uso del sorting a singola cellula può raggiungere una purezza del 99% delle cellule immunofenotipizzate da una popolazione eterogenea se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica.

Ordinamento a singola cellula di cellule staminali mesenchimali immunofenotipizzate da denti decidui esfoliati umani

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Il presente protocollo descrive un metodo economico per purificare, espandere e caratterizzare cellule staminali mesenchimali (BMSC) altamente omogenee del midollo osseo dai topi. Questo approccio facilita l'acquisizione di grandi quantità di BMSC con un elevato potenziale di proliferazione e differenziazione, supportando i modelli murini e facendo progredire la ricerca preclinica.

Fenotipizzazione basata sulla purificazione, espansione e citometria a flusso di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo derivate dal topo

Questo protocollo descrive un metodo di selezione basato su perle magnetiche che utilizza anticorpi di citometria di flusso marcati con ficoeritrina (PE) e microsfere anti-PE per isolare specifiche sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali con alta positività dei marker target postsort e attività proliferativa/metabolica basata su CCK-8 nelle condizioni testate, senza richiedere costosi selezionatori cellulari o perle personalizzate specifiche per target.

Isolamento e validazione delle sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali positive a Podoplanina utilizzando una strategia di perle magnetiche indirette

Scopri un metodo enzimatico per isolare cellule staminali mesenchimali da coaguli di midollo osseo usando l'urochinasi. Questa tecnica rapida ed economica consente di recuperare campioni altrimenti scartati per la ricerca rigenerativa.

Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

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