Un metodo enzimatico per salvare cellule staminali mesenchimali da coagulata midollo osseo da analizzare

L'obiettivo generale di questa procedura è sfruttare i campioni di midollo osseo coagulato digerendo i coaguli con l'urochinasi. Questo viene ottenuto filtrando innanzitutto il campione di midollo osseo attraverso un filtro per cellule. Successivamente, il coagulo di midollo osseo viene tagliato in piccoli pezzi.

Quindi, il coagulo viene trasferito in una provetta Falcon e digerito utilizzando l'urochinasi. Infine, il materiale del coagulo digerito viene seminato per l'espansione delle cellule staminali mesenchimali o MSC. In ultima analisi, le piastre vengono confrontate con una piastra di controllo utilizzando em sustain per valutare l'efficacia della digestione.

Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia o la diagnosi con cellule staminali autologhe. Poiché il trapianto richiede l'espansione e la differenziazione di un elevato numero di cellule staminali. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando abbiamo notato che molti campioni di midollo osseo provenienti dal DOC erano coagulati al loro arrivo nel nostro laboratorio.

Non volevamo semplicemente gettare campioni così preziosi per ricostituire l'urochinasi. Iniettare 10 millilitri di PBS sterile nel flacone con ingresso settato e vortexare per sciogliere fino a una concentrazione di 50.000 unità per millilitro. Aliquotare 500 microlitri contenenti ciascuno 25.000 unità in provette sterili e conservare a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di sei mesi per eseguire una reazione di digestione. Scongelare un'aliquote di urochinasi per ogni campione di aspirato midollare torbido fino a 25 millilitri.

Riscaldare preventivamente un bagnomaria o un incubatore agitatore a 37 gradi Celsius sotto una cappa a flusso laminare. Indossando guanti, posizionare un filtro cellulare da 100 micrometri sulla sommità di un tubo da 50 millilitri. Versare con attenzione l'aspirato midollare attraverso il filtro cellulare, inclinando il filtro o muovendo il materiale coagulato.

Versare con attenzione l'aspirato del midollo osseo attraverso il filtro cellulare senza inclinare il filtro né muovere il materiale del coagulo. Utilizzare una pipetta sterile per favorire un migliore passaggio attraverso la maglia del filtro, insieme a pinze sterili. Trasferire il materiale del coagulo midollare in una piastra per colture cellulari vuota.

Quindi, utilizzare un bisturi sterile per tagliare i detriti in pezzi cubici di due millimetri. Successivamente, con una pipetta microlitrica da cinque millilitri, triturare il coagulo aspirando e dispensando cinque volte. Aggiungere quindi un'aliquote di urochinasi al campione e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti in un bagnomaria o in un incubatore agitato.

Dopo l'incubazione nell'armadio a sicurezza biologica, si esegue nuovamente la titolazione e si incuba per ulteriori 30 minuti. Successivamente si titola altre cinque volte e si fa passare il campione attraverso un nuovo filtro cellulare da 100 micrometri, raccogliendo il filtrato insieme a quello iniziale. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g e a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo aver eliminato il soprannatante, utilizzare 50 millilitri di mezzo basale per risospendere il pellet.

Utilizzando la soluzione di blu di trian, diluire un quadrante ALI di cellule ri-sospese di uno a 10 e aggiungere la sospensione a una camera di Neubauer per contarle. Dopo aver contato le cellule, seminarle in fiasche per colture cellulari a una densità di cinque per 10 alla sette cellule per centimetro cubo per la piastra di controllo del saggio CFU.

10 alla nona cellule in una piastra circolare per colture cellulari di 10 centimetri di diametro, incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius. Dopo tre giorni di coltura, le MSC si attaccheranno alla piastra per colture cellulari mentre le altre cellule rimarranno in sospensione. Utilizzare mezzo basale contenente cinque nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti di base per sostituire il mezzo sia nelle piastre sperimentali che in quelle di controllo.

Continuare la coltura per un totale di due settimane, cambiando il mezzo tre volte alla settimana. Se le cellule superano l'80% di confluenza, trattare la coltura con tripsina e suddividerla per eseguire il saggio CFU.

Preparare 10 millilitri di soluzione GSA per piastra utilizzando acqua sterile per diluire la soluzione madre. Da uno a 10. Rimuovere il mezzo dalla piastra di coltura cellulare e utilizzare PBS per lavare accuratamente le cellule con metanolo puro.

Fissare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, eliminare il metanolo e aggiungere la soluzione gemsa. Incubare in una camera umidificata a 37 gradi Celsius per 60 minuti dopo l'incubazione.

Usare PBS per lavare le cellule due volte. Quindi lasciare asciugare l'intera piastra all'aria. Appoggiarla per prima su un tovagliolo di carta con un pennarello sul retro della piastra.

Contare manualmente le colonie per la differenziazione adipogenica. Coltivare le MSC in monostrato a quattro volte 10 alla quinta cellule per centimetro quadrato. Alternare tra due diverse condizioni di coltura per la prima condizione.

Coltivare le cellule in un mezzo di mantenimento per l'adipogenesi e, per la seconda condizione, coltivare le cellule. Utilizzare un mezzo di induzione dell'adipogenesi insieme al mezzo di mantenimento secondo le ricette descritte nel protocollo testuale. Per visualizzare le goccioline lipidiche, fissare brevemente le cellule con formaldeide al 10%.

Quindi lavare le cellule con PBS prima di utilizzare l'Oil Red O allo 0,35% in isopropanolo per colorare le cellule destinate alla differenziazione osteogenica. Coltivare le MSC in monocstrato a una densità di sette volte 10 alla terza cellule per centimetro quadrato. Dopo aver stimolato le cellule utilizzando il mezzo descritto nel protocollo del testo, fissare brevemente le cellule con formaldeide al 10%. Una volta lavate le cellule con PBS, utilizzare la colorazione di Von Kossa per identificare i depositi minerali al fine di eseguire la differenziazione osteogenica da un dispositivo medico di forma spugnosa costituito da cubetti di collagene di tipo I liofilizzato, con lati di tre millimetri. Seminare le MSC sulla superficie dei cubetti a una concentrazione di quattro volte 10 alla ottava cellule per millilitro, dopo aver lasciato aderire le cellule ai cubetti per 30 minuti a temperatura ambiente.

Mantenere i costrutti di collagene MSC nel mezzo congenico come indicato nel protocollo testuale. Aggiungere la soluzione al 0,4% di Ian Blue alle sezioni e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, utilizzare DMSO al 40% e cloruro di magnesio 0,05 molare per lavare le cellule per 30 minuti prima di usare il rosso nucleare rapido per la colorazione di contrasto delle cellule, come qui dimostrato.

Una semplice colorazione con DAPI di una sezione del materiale del coagulo conferma la presenza di cellule nucleate ad alta densità, indicando che un numero considerevole di MSC è intrappolato all'interno dei coaguli. Utilizzando il protocollo descritto in questo video, il trattamento con urochinasi ha permesso la digestione di tutto tranne il 15% in peso dei coaguli di sangue canino e il 9% in peso dei coaguli umani, al fine di determinare l'efficacia della digestione con urochinasi. Le cellule provenienti dai filtrati del campione coagulato e dai coaguli digeriti sono state seminate separatamente e incubate per due settimane.

La coltura sostenuta delle cellule ha mostrato 3,8 volte più UFC nei campioni canini digeriti con urochinasi rispetto ai corrispondenti filtrati iniziali. I campioni umani digeriti hanno mostrato 1,6 volte più UFC rispetto ai filtrati non digeriti. In questo esperimento, le cellule staminali mesenchimali provenienti da coaguli di midollo osseo sono state confrontate con quelle derivate da campioni di midollo osseo coagulato dell'UNC per valutarne la capacità di differenziarsi in condizioni di coltura appropriate.

Dopo quattro settimane di coltura, è stato possibile differenziare le cellule staminali mesenchimali (MSC) da campioni digeriti in linee adipogeniche, osteogeniche e congeniche. Inoltre, le colorazioni con von Kossa, rosso O e blu di Sian indicavano assenza di differenze nel grado di differenziazione tra i gruppi. Una volta acquisita padronanza, Mr.Nick può essere eseguito in circa un'ora e mezza se effettuato correttamente.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare cellule staminali ematiche me per la coltura di espansione, anche se i tuoi campioni sono coagulati invece di scartare il campione. Il nostro protocollo utilizza l'enzima chinasi per digerire il coagulo e le cellule staminali ES per la coltura di espansione.