Name: Lossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come In Vitro Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri il modello di deprivazione di ossigeno-glucosio e riossigenazione per studiare la disfunzione della barriera ematoencefalica. Questo metodo utilizza cellule endoteliali cerebrali e immunofluorescenza per analizzare i meccanismi di danno da ischemia-riperfusione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Riconosciamo Scott and White Hospital Assegni di Ricerca Programma per il sostegno finanziario e Texas A &amp; M Health Science Center College of Medicine Laboratorio Integrato Imaging per l&#39;utilizzo del microscopio laser confocale. Riconosciamo Mr. Glen Cryer per un aiuto con la modifica del manoscritto.

1. Semina delle cellule endoteliali <ol><li> Ottenere colture primarie di RBMEC di da adulti Sprague Dawley (o ottenerle in commercio). </li><li> Coltivare RBMECs a 100 centimetri fibronectina (50 mg / ml) capsule di Petri rivestita utilizzando il mezzo di crescita delle cellule endoteliali del cervello di ratto. Cambia il mezzo ogni due giorni, fino al raggiungimento di confluenza. </li><li> Giunti 80-90% di confluenza, lavare delicatamente le cellule in 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) agitando. Le cellule sono poi staccate esponendoli a 1 ml di soluzione calda 0,25% trypsin- acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), equilibrati a 37 ° C. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 2-5 minuti fino a quando le cellule vengono staccate e dispersi. NOTA: Toccare il piatto cultura per staccare le cellule. Vista cellule al microscopio per confermare completo distacco di cellule dalla superficie del piatto. </li><li> Aggiungere 5 ml completo supporto alla scatola Petri per neutralizzare tripsina.Pipettare il terreno contenente le cellule staccate e raccogliere in una provetta da centrifuga da 15 ml. . </li><li> Centrifugare il supporto contenente cellule endoteliali a 220 g per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e conservare il pellet contenente cells.Suspend il pellet in 3-5 ml fresco cervello di ratto mezzo di crescita delle cellule endoteliali delicatamente mescolando su e giù con celle pipetta sarà quindi essere conteggiati con contatore di cellule automatico o un emocitometro. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in fibronectina (50 ug / ml) prerivestita 8 sistema di scorrimento camera ben sterile, 0.7 cm 2 / pozzetto con una densità di semina compreso tra 10.000-15.000 cellule per pozzetto. Far crescere le cellule a 37 ° C fino a confluenza NOTA: per l&#39;esecuzione di macchie occidentali o altri esperimenti, le cellule possono essere coltivate in 10 centimetri piatti di coltura di cellule o piatti speciali, come richiesto dal esperimento. </li></ol> 2. ossigeno e glucosio privazione-riossigenazione in vitroModello NOTA: Il seguente protocollo è stato adattato da Zulueta et al. 1997; Zhu H et al. 2012 8,9. <ol><li> Utilizza il sistema di coltura cellulare all&#39;ipossia per studiare gli effetti di di OGD-R RBMECs in (vedi Figura 1). Setup e calibrare il sistema di coltura cellulare ipossia prima di iniziare l&#39;esperimento, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Rimuovere i vetrini camera confluent (passo 1,8) dalla C incubatore 37 °. Sostituire il terreno completo nella diapositiva da camera con deossigenato, senza glucosio, Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) e posto in camera di ipossia con il 95%, N 2 e 5% di CO 2 per 2 ore a 37 ° C, per rappresentare condizioni OGD. </li><li> Spostare le cellule indietro per l&#39;incubatore con 95% O 2, 5% CO 2 a 37 ° C e provvisto di fresco cervello di ratto cellule endoteliali terreno completo e incubare per un altro 1 ora a 37 ° C. NOTA: Questo passo rappresenta una situazione riossigenazione. </li><li> Utilizzare le diapositive da camera per la localizzazione e l&#39;etichettatura immunofluorescenza rodamina phalloidin (vedi sezione 3). </li></ol> 3. immunofluorescenza Localizzazione di ZO-1 e f Etichettatura actina Utilizzando Rhodamine falloidina <ol><li> Esporre le diapositive da camera contenenti monostrati RBMEC a 100 ml di Opti-MEM / siero ridotta media / bene per 1 ora. Lavare le diapositive camera 3 volte con 100 pl di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.0-7.2). </li><li> Fissare le cellule con 100 ml di 4% paraformaldeide in PBS (pH 7.0-7.2) per 15 minuti e lavare i vetrini camera per 3 volte in PBS (pH 7.0-7.2). </li><li> Permeabilize le cellule utilizzando 100 ml di 0,5% Triton X-100 in PBS, pH (7.0-7.2) per altri 15 min. Blocco con 100 ml di 2% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS per un&#39;ora. Dopo questo passaggio sia cellule macchia / etichetta sia per ZO-1 o f- actina. <ol><li> Per immunofluorescenza staining Incubare le cellule con un anticorpo anti-coniglio primaria contro ZO-1 a 1: 150, preparata in 2% BSA-PBS per O / N a 4 ° C. Lavare le cellule per 3 volte in PBS, (pH 7.0-7.2). Incubare con 100 ml di fluoresceina isotiocianato (FITC) -tagged anticorpo secondario anti-coniglio per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Per l&#39;etichettatura Rodamina falloidina, dopo il blocco, esporre le cellule a 100 ml di rhodamine falloidina in diluizione 1:50, preparato nel 2% BSA-PBS, per 20 min. </li><li> Lavare le cellule da immunofluorescenza e l&#39;etichettatura rodamina falloidina in PBS, (pH 7.0-7.2). Montare le camere di utilizzo dei supporti di montaggio contenenti reagenti anti-dissolvenza con DAPI. </li></ol></li><li> Visualizzare le cellule utilizzando una lente immersione in acqua 60 X e le cellule sono scansionati in un unico piano ottico al microscopio confocale. </li></ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Kalogeris, T., Baines, C. P., Krenz, M., Korthuis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of ischemia/reperfusion injury.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 298, 229-317 (2012).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycium+barbarum+polysaccharides+reduce+intestinal+ischemia%2Freperfusion+injuries+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Lycium barbarum polysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats.</a> Chem Biol Interact. 204 (3), 166-172 (2013).</li>
<li>Kaur, C., Ling, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+in+hypoxic-ischemic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier in hypoxic-ischemic conditions.</a> Curr Neurovasc Res. 5 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Khatri, R., McKinney, A. M., Swenson, B., Janardhan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier%2C+reperfusion+injury%2C+and+hemorrhagic+transformation+in+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier, reperfusion injury, and hemorrhagic transformation in acute ischemic stroke.</a> Neurology. 79 Suppl 1. (13), S52-S57 (2012).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+investigation+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the investigation of brain ischemia.</a> Cardiovasc Res. 39, 106-120 (1998).</li>
<li>Ogawa, S., Gerlach, H., Esposito, C., Pasagian-Macaulay, A., Brett, J., Stern, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+modulates+the+barrier+and+coagulant+function+of+cultured+bovineendothelium.+Increased+monolayer+permeability+and+induction+of+procoagulant+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxia modulates the barrier and coagulant function of cultured bovineendothelium. Increased monolayer permeability and induction of procoagulant properties.</a> J Clin Invest. 85 (4), 1090-108 (1990).</li>
<li>Zulueta, J. J., Sawhney, R., Yu, F. S., Cote, C. C., Hassoun, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+generation+of+reactive+oxygen+species+in+endothelial+cellsexposed+to+anoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular generation of reactive oxygen species in endothelial cellsexposed to anoxia-reoxygenation.</a> Am J Physiol. 272 (5 Pt 1), L897-L902 (1997).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baicalin+reduces+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+during+hypoxia+in+vitro+by+increasing+the+expression+of+tight+junction+proteins+in+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Baicalin reduces the permeability of the blood-brain barrier during hypoxia in vitro by increasing the expression of tight junction proteins in brain microvascular endothelial cells.</a> J Ethnopharmacol. 141 (2), 714-720 (2012).</li>
<li>Abramov, A. Y., Scorziello, A., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+mechanisms+generate+oxygen+free+radicals+in+neurons+and+contribute+to+cell+death+during+anoxia+and+reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation.</a> J Neurosci. 27 (5), 1129-1138 (2007).</li>
<li>Gundimeda, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+polyphenols+precondition+against+cell+death+induced+by+oxygen-glucose+deprivation+via+stimulation+of+laminin+receptor%2C+generation+of+reactive+oxygen+species%2C+and+activation+of+protein+kinase+Cepsilon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Green tea polyphenols precondition against cell death induced by oxygen-glucose deprivation via stimulation of laminin receptor, generation of reactive oxygen species, and activation of protein kinase Cepsilon.</a> J Biol Chem. 287 (41), 34694-34708 (2012).</li>
<li>Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+targets+in+cerebral+ischemia+for+developing+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics.</a> Brain Res Rev. 54 (1), 34-66 (2007).</li>
<li>Alluri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species-Caspase-3+Relationship+in+Mediating+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cell+Hyperpermeability+Following+Oxygen-Glucose+Deprivation+and+Reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species-Caspase-3 Relationship in Mediating Blood-Brain Barrier Endothelial Cell Hyperpermeability Following Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation.</a> Microcirculation. 21 (2), 187-195 (1111).</li>
<li>Sun, H., Breslin, J. W., Zhu, J., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+and+ROCK+signaling+in+VEGF-induced+microvascular+endothelial+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Rho and ROCK signaling in VEGF-induced microvascular endothelial hyperpermeability.</a> Microcirculation. 13 (3), 237-247 (2006).</li>
<li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP actin.</a> J Vis Exp. (57), (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

OGD-R come un modello in vitro per danno da ischemia-riperfusione è stato ben definito per studiare i neuroni 10,11. Ci sono anche studi che dimostrano l&#39;effetto di OGD sulle cellule endoteliali cerebrali e alterazioni nella permeabilità e TJ integrità 9. Tuttavia, il nostro studio mostra l&#39;effetto di OGD nonché reoxygenation, che è una rappresentazione più stretta di riperfusione ischemica in condizioni in vivo che si verificano ictus ischemico seguente. <p class="jov...

Ischemia-riperfusione (IR) ferita si trova ad essere la causa frequente di varie complicazioni debilitanti e decessi associati a ictus, infarto miocardico, trauma, malattia vascolare periferica e traumi cerebrali 1,2. Lesioni IR in vasi cerebrali è uno dei primi lesione secondaria che porta a infiammazione ed edema 3. Una delle complicazioni gravi che si verifica a causa di stress ossidativo e metabolico seguito infiammazione è la perdita di equilibrio omeostatico che porta alla formazione di radicali liberi, alterazioni della barriera emato-encefalica (BBB) ​​giunzioni strette (TJs) e la permeabilità microvascolare 4,5. Attualmente, in modelli in vivo utilizzati per studiare gli effetti di lesioni IR sul BBB includere mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale (MCAO), microembolia, e transgenici o knockout animali. Tuttavia, ognuno ha i suoi svantaggi e limitazioni come discusso da Hossmann 6. Modello MCAO viene utilizzato per studiare il effects di stress redox, i cambiamenti nella comunicazione giunzionale della BBB e le interazioni tra il cervello e le cellule del sistema immunitario. Tuttavia, essi presentano vari problemi tecnici quali la necessità di precise procedure microchirurgia e le difficoltà in esso. Microembolia rompe istantaneamente lungo la BBB, mentre l&#39;uso di transgenici o knockout animali per studiare ischemia cerebrale può avere sfide come influenze gene-dipendente molecolari sulla formazione infarto, cambiamenti di anatomia vascolare e vari peso corporeo 6. Quindi, modelli in vitro di ischemia hanno trovato un crescente interesse negli ultimi tempi soprattutto a causa della loro applicabilità in esecuzione di studi meccanicistici per i farmaci. Tuttavia, i risultati degli studi in vitro non possono rappresentare appieno uno studio in vivo e devono essere interpretati con cautela 6. Effetto counteractive di basse concentrazioni di ossigeno su monostrati di cellule endoteliali e la permeabilità microvascolare sono statistudiato da Ogawa 7. Cellule endoteliali Rat microvascolari cerebrali (RBMECs) sono stati utilizzati per sviluppare in vitro BBB. La deprivazione di ossigeno e glucosio e riossigenazione (OGD-R) tecnica presentata in questo protocollo è stato adattato da studi di Zulueta et al e Zhu et al 8,9. Abbiamo esposto le cellule endoteliali cerebrali a OGD-R mettendoli in una camera di ipossia / anossia contenente 0% O 2, 5% di CO 2 e il 95% N 2. Le cellule sono state poi valutate per alterazioni TJ integrità e lo stress formazione fibra con localizzazione immunofluorescenza e l&#39;etichettatura falloidina rodamina rispettivamente. Immunofluorescenza colorazione per zonula occludere-1 (ZO-1) viene eseguita per determinare l&#39;integrità TJ, come ZO-1 è un importante membrana ponteggio legato proteina TJ. Etichettatura Rhodamine falloidina determina l&#39;actina filamentosa (f actina) nel citoscheletro cellulare ed è una chiara indicazione di formazione fibra sforzo actina in cellule endoteliali. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di fornire una conoscenza di sviluppo OGD-R come un modello in vitro IR per lo studio BBB cellule endoteliali integrità TJ e la formazione di fibre di stress f-actina. I risultati forniranno informazioni sulla sorte di proteine ​​TJ, ZO-1 e la formazione di fibre di stress dopo OGD-R. La comprensione di queste relazioni sarà l&#39;occasione per determinare i meccanismi molecolari alla base che vengono attivati ​​seguendo OGD-R e sviluppare potenziali strategie terapeutiche per migliorare la perturbazione BBB in seguito al trattamento OGD-R.

<table><tbody><tr><td>Proox modello 110</td><td>Biospherix</td><td>modello 110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, senza glucosio</td><td>Gibco, Life technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Falloidina</td><td>Life technologies</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Rabbit Polyclonal Antibody</td><td>Life technologies</td><td>617300</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab Tek II-CC 8&nbsp; ben sterile, vetro&nbsp; diapositive&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo secondario anti-coniglio marcato FITC&nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>sc-2090</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Thermo scientific</td><td>SH 30028.03</td><td>Qualsiasi altro PBS disponibile può essere utilizzato</td></tr></tbody></table>

l&#39;ossigeno-glucosio deprivazione e riossigenazione come<em&gt; in vitro</em&gt; ischemia-riperfusione injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello erettile

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-riperfusione (IR) infortunio è noto per contribuire in modo significativo la morbilità e la mortalità associata con ictus ischemico. Accidenti cerebrovascolari ischemiche rappresentano l&#39;80% di tutti i colpi. Una causa comune di lesioni IR è il rapido afflusso di liquidi dopo occlusione acuta / cronica di sangue, nutrienti, ossigeno al tessuto innescando la formazione di radicali liberi. Ictus ischemico è seguito da barriera emato-encefalica (BBB) ​​erettile e edema cerebrale vasogenico. Strutturalmente, giunzioni strette (TJS) tra le cellule endoteliali svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell&#39;integrità della barriera ematoencefalica (BBB). Lesioni IR è uno dei primi lesione secondaria che conduce a un non specifico, la risposta infiammatoria. Ossidativo e stress metabolico seguente infiammazione innesca un danno cerebrale secondario compresi BBB permeabilità e la rottura di giunzione a tenuta (TJ) integrità. Il nostro protocollo presenta in vitro &lt;/ Em&gt; esempio di deprivazione di ossigeno e glucosio e riossigenazione (OGD-R) su cellule endoteliali cervello di ratto TJ integrità e la formazione di fibre di stress. Attualmente, molti sperimentale in modelli in vivo vengono utilizzati per studiare gli effetti di lesioni IR; ma hanno alcune limitazioni, come le difficoltà tecniche per l&#39;esecuzione di interventi chirurgici, le influenze genetiche e molecolari dipendenti difficoltà di studiare le relazioni meccanicistiche. Tuttavia, i modelli in vitro possono aiutare a superare molti di questi limiti. Il protocollo presentato può essere usato per studiare i vari meccanismi molecolari e relazioni meccanicistici di fornire potenziali strategie terapeutiche. Tuttavia, i risultati degli studi in vitro possono essere diverse dallo standard studi in vivo e devono essere interpretati con cautela.

Le cellule coltivate su fibronectina pretrattata camera di diapositive Nunc II sono stati sottoposti ad OGD-R mettendo in un modello Biospherix ProOx 110 camera. Dopo aver sottoposto celle a OGD-R, sono stati trattati per ZO-1 giunzionale colorazione utilizzando la tecnica di immunofluorescenza come mostrato in figura 2 e l&#39;assemblaggio del citoscheletro indicando fibra formazione di stress F-actina usando label macchia rodamina falloidina come mostrato in figura 3. Le cellule di co...

'Il danno da ischemia-riperfusione (IR) è associato a un alto tasso di morbilità e mortalità. L'obiettivo del modello in vitro di deprivazione e riossigenazione di ossigeno-glucosio (OGD-R) qui descritto è valutare gli effetti del danno da riperfusione ischemica su una varietà di cellule, in particolare nelle cellule endoteliali della barriera emato-encefalica (BBB).

L&#39;ossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come<em&gt; In Vitro</em&gt; Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare il ruolo della privazione di ossigeno e glucosio come modello in vitro di danno da ischemia-riperfusione per lo studio della disfunzione della barriera ematoencefalica. Questo viene ottenuto esponendo cellule endoteliali cerebrali coltivate su camere portaoggetti alla privazione di ossigeno e glucosio, sostituendo il mezzo di coltura con un mezzo desossigenato e privo di glucosio ed esponendole a un ambiente da ipossia per due ore; successivamente, le cellule vengono riportate alle condizioni normali per un'ora al fine di ottenere la riossigenazione. Dopo l'elaborazione delle cellule, viene eseguita una colorazione immunofluorescente per Zona Occludens-1 e Occludina, e una marcatura con Rodamina F-actina per l'actina filamentosa.Le cellule vengono quindi immagine mediante un obiettivo ad immersione in acqua da 60x su un microscopio confocale per ottenere singole sezioni ottiche da analizzare. A dimostrare la procedura sarà Hem Nega, uno studente laureato nel mio laboratorio. Per iniziare la procedura, si devono avere a disposizione colture primarie di RBM eecs ottenute da ratti adulti Spra dolly. Sono accettabili anche linee disponibili in commercio.Coltivare le R BM EECS in piatti da 100 centimetri rivestiti con fibronectina, coltivarle in mezzo di crescita per cellule endoteliali cerebrali di ratto e cambiare il mezzo ogni due giorni. Far crescere le cellule fino a quando non raggiungono una confluenza dell'80-90%. Quindi lavare delicatamente le cellule con cinque millilitri di PBS.Successivamente, staccare le cellule dalla piastra aggiungendo prima un millilitro di soluzione di tripsina al 0,25% EDTA calda e agitando delicatamente la piastra. Incubare quindi le cellule per due-cinque minuti. Toccare il lato della piastra per favorire il distacco delle cellule e osservarle al microscopio per confermare il distacco.Per interrompere la tripsinizzazione, aggiungere cinque millilitri di mezzo completo, quindi pipettare il mezzo con le cellule staccate e raccoglierlo in un tubo da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare il mezzo con le cellule a 220 ×g per cinque minuti, aspirare e scartare il soprannatante. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in tre-cinque millilitri di mezzo fresco facendo passare delicatamente le cellule attraverso una pipetta da cinque millilitri.Ora contare le cellule e trasferirne da 20 a 30.000 in ciascun pozzetto di una camera a otto pozzetti rivestita con fibrina e actina. Naturalmente, potrebbero anche essere coltivate in modo diverso per altre applicazioni. Quindi incubare la camera a pozzetti fino a quando le cellule non diventano confluenti, in preparazione.Configurare e calibrare il sistema di coltura cellulare in condizioni di ipossia. Secondo le istruzioni del produttore, l'ambiente della camera deve essere al 95% di azoto, al 5% di anidride carbonica e a 37 gradi Celsius. Ora desossigenare il DMEM privo di glucosio ponendolo nella camera di ipossia per quattro-sei ore.Iniziare a sottoporre le cellule a stress sostituendo il mezzo con DMEM privo di glucosio e deossigenato, quindi posizionare le cellule nella camera di ipossia per due ore. Dopo due ore, rimettere le cellule nel mezzo completo per cellule endoteliali cerebrali di ratto. Successivamente, ri-ossigenare le cellule riportandole a condizioni normali per un'ora.Iniziare esponendo ogni pozzetto di monocapato di R-B-M-E-C a 100-200 microlitri di mezzo con siero ridotto ottimale e proseguire l'incubazione per un'ora. Quindi lavare le camere per tre volte utilizzando 100-200 microlitri di PBS per pozzetto ad ogni lavaggio. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS e incubare i vetrini per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il fissativo lavando le cellule tre volte con PBS come in precedenza.Ora permeabilizzare le cellule aggiungendo da 100 a 200 microlitri di Triton X-100 0,5% in PBS in ogni pozzetto e lasciare che la piastra incubi per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo che le cellule sono state rese permeabili, applicare la soluzione di blocco e lasciarla agire sulle cellule per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire l'immunofluorescenza per la proteina ZO-1 o etichettare l'actina F.Per eseguire l'immunofluorescenza delle cellule per ZO-1, incubarle con l'anticorpo primario tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le cellule tre volte in PBS, ad esempio quando si rimuove il fissativo. Successivamente, incubare le cellule in 100-200 microlitri di anticorpo secondario anti-coniglio marcato con fitzina per un'ora a temperatura ambiente per etichettare le cellule con r Domine Phin.Dopo aver applicato la soluzione di blocco per un'ora, esporre le cellule a 100-200 microlitri di R domine Phin in una diluizione da uno a 50 con 2% B-S-A-P-B-S per 20 minuti. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario o con R domine Phin, lavare le cellule con PB S tre volte come in precedenza. Successivamente, rimuovere le camere staccando l'anello elastico.Procedere con il montaggio dei vetrini utilizzando un mezzo contenente anti fade e immagine DPI. Le cellule vengono analizzate mediante microscopia confocale in un singolo piano con un obiettivo da 60 x. Cellule coltivate in una camera rivestita con fibronectina.I vetrini sono stati sottoposti a OGDR posizionandoli in una camera da ipossia. Come descritto. Le cellule sono quindi state trattate per la giunzione ZO-1.Le cellule di controllo colorate hanno mostrato un'integrità giunzionale continua, mentre le cellule prive di ossigeno e glucosio presentavano giunzioni discontinue. Inoltre, sono state osservate alterazioni del citoscheletro mediante l'utilizzo di aero domine foid con etichetta per evidenziare l'actina F da stress. Le cellule di controllo nella formazione delle fibre di stress non mostravano o mostravano una minima formazione di fibre di stress di actina F, mentre le cellule sottoposte a deprivazione di ossigeno e glucosio avevano un aumento della formazione delle fibre di stress.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la privazione di ossigeno e glucosio e la successiva reossigenazione. Questo modello può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione, la barriera emato-encefalica, l'integrità delle giunzioni strette e lo stress. Formazione delle fibre.

oxygen-glucose-deprivation-reoxygenation-as-an-vitro-ischemia

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Alluri, H., et.al. Deprivazione e riossigenazione di ossigeno-glucosio come modello di lesione da ischemia-riperfusione in vitro per lo studio della disfunzione della barriera emato-encefalica. J. Vis. Exp. (2015).Il video dimostra l'impatto della privazione di ossigeno-glucosio e della successiva riossigenazione sulle cellule endoteliali microvascolari del cervello di ratto (RBMEC) simulando condizioni ipossiche e prive di nutrienti. Queste condizioni provocano la deplezione dell'ATP,...

Impatto della privazione e della riossigenazione ossigeno-glucosio sulle interazioni cellula-cellula

Occlusione carotidea bilaterale accoppiato con ipotensione sistemica produce ischemia cerebrale globale nel ratto, con conseguenti danni al dell'ippocampo con severità riproducibile. Soggetti animali sono compromesse con modelli prevedibili di danni cerebrali, si riprendono speditamente, ed i tassi di mortalità sono relativamente bassi.

2-occlusione di vasi / Ipotensione: un modello di ratto di Global Ischemia cerebrale

In vitro modelli di lesioni cerebrali traumatiche sono state sviluppate per riprodurre in deformazione del cervello in vivo. Lesioni Stretch indotta è stato impiegato per gli astrociti, neuroni, cellule gliali, aortica, e le cellule endoteliali cerebrali. Tuttavia, il nostro sistema utilizza una barriera emato-encefalica (BBB), modello che possiede le proprietà che costituiscono un modello legittimo della BBB di stabilire un modello in vitro TBI.

Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come<em&gt; In Vitro</em&gt; Trauma cranico modello della barriera ematoencefalica

Un protocollo per culture fetta organotipica entorhino-ippocampale, che permette di riprodurre molti aspetti della lesione cerebrale ischemico, è presentato. Studiando cambiamenti del neurovasculature in aggiunta ai cambiamenti nei neuroni, questo protocollo è uno strumento versatile per studiare i cambiamenti plastici in tessuto neurale dopo l'infortunio.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Questo protocollo descrive il precondizionamento ipossico ripetitivo, o brevi esposizioni all'ipossia sistemica che riducono i volumi di infarto e l'interruzione della barriera emato-encefalica a seguito di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei topi. Descrive inoltre la doppia quantificazione del volume dell'infarto e dell'interruzione della barriera emato-encefalica dopo l'ictus per valutare l'efficacia della protezione neurovascolare.

Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nei topi

Ictus ischemico è un evento complesso in cui il contributo specifico degli astrociti nella regione colpite del cervello esposto alla privazione di ossigeno glucosio (OGD) è difficile da studiare. Questo articolo introduce una metodologia per ottenere gli astrociti isolati e studiare la loro reattività e la proliferazione in condizioni OGD.

Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

L'obiettivo del protocollo è di presentare una procedura ottimizzata per la creazione di un modello in vitro barriera ematomeningea (BBB) basato sulle cellule endoteliali cerebrali primari porcina (pBECs). Il modello mostra un'elevata riproducibilità, alta tenuta ed è adatto per studi di trasporto e traffico intracellulare nella scoperta della droga.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una tecnica altamente riproducibile per la valutazione in vivo della perturbazione barriera emato - encefalica nei modelli del ratto del colpo ischemico.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Qui, presentiamo un approccio semplice utilizzando specifici mezzi di coltura che permettono la creazione di colture arricchite di neuroni e astrociti, o colture neurone-glia dalla corteccia embrionale, con alto rendimento e riproducibilità.

Un modello di coltura cellulare per studiare il ruolo delle interazioni Neuron-Glia in Ischemia

Qui, descriviamo il metodo per stabilire un modello di coltura cellulare tripla della barriera emato-encefalica basato su cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello umano, astrociti e periciti. Questo modello multicellulare è adatto per studi di disfunzione delle unità neurovascolari durante l'ictus ischemico in vitro o per lo screening di farmaci candidati.

Un triplo modello di coltura cellulare primaria della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro

La barriera emato-encefalica (BBB) ha un ruolo cruciale nel sostenere un ambiente cerebrale stabile e sano. La disfunzione della BBB è associata a molte malattie neurologiche. Abbiamo sviluppato un modello 3D derivato da cellule staminali della BBB per studiare la patologia cerebrovascolare, l'integrità della BBB e il modo in cui la BBB viene alterata dalla genetica e dalla malattia.

Ricostruzione della barriera emato-encefalica in vitro per modellare e colpire terapeuticamente la malattia neurologica

Scopri il modello di deprivazione di ossigeno-glucosio e riossigenazione per studiare la disfunzione della barriera ematoencefalica. Questo metodo utilizza cellule endoteliali cerebrali e immunofluorescenza per analizzare i meccanismi di danno da ischemia-riperfusione.

Lossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come In Vitro Ischemia-riperfusione Injury modello per lo studio barriera sanguigna del cervello Erettile (Video) | JoVE Journal

L'ossigeno-glucosio Deprivazione e riossigenazione come

Esplora altri video