Isolamento di cellule mononucleate dal Sistema Nervoso Centrale di ratti con EAE

Ok. Salve, sono Christine Beaton. Sono un ricercatore assistente nel laboratorio di George Chen del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California di Irvine. Oggi vi mostrerò come isolare le cellule mononucleate dal sistema nervoso centrale dei ratti.

Questa procedura prevede l'anestesia profonda del ratto per eseguire una perfusione cardiaca, in modo da non avere sangue contaminante nel sistema nervoso centrale. Una volta rimosso, preleveremo il cervello e il midollo spinale, prepareremo una sospensione di singole cellule utilizzando un filtro cellulare e quindi, mediante un gradiente a doppio strato di percoll, isoleremo le cellule mononucleate. Cominciamo dunque.

Ora sono pronto per eseguire la perfusione cardiaca, quindi mostrerò tutti i materiali necessari. La prima cosa di cui abbiamo bisogno è un barattolo di Bel, e qui sotto abbiamo messo dei fazzoletti di carta inzuppati con anestetico volatile. È possibile utilizzare halane o iso fluorine.

La prossima cosa di cui abbiamo bisogno è qualcosa per trattenere il ratto e qualcosa per raccogliere il sangue. Abbiamo quindi questa apparecchiatura improvvisata per perfondere i ratti. Userete un ago da 21 gauge e procederete con una soluzione salina somministrata per gravità attraverso un sistema di perfusione endovenosa.

Se non si ha accesso a uno di questi sistemi, è possibile riempire manualmente diverse siringhe con soluzione salina ed eseguire la perfusione a mano. Ma questo metodo è molto più semplice. Inoltre, abbiamo bisogno di un cilindro di siringa da 10 ml in cui abbiamo inserito salviette Kim.

E ora metterò l'anestetico, una parte dell'anestetico, sulla punta del naso del ratto per assicurarmi che rimanga profondamente anestetizzato durante l'intervento. E poi, ovviamente, servono gli strumenti. Oggi non eseguirò una procedura sterile perché non metterò le cellule in coltura.

Quindi, tutti gli strumenti che sto utilizzando non sono sterili. Ma ovviamente, se si desidera coltivare le cellule, sarà necessario usare strumenti sterili. Ai fini di questo video, userò un ratto che è effettivamente morto.

Pertanto, posso eseguire la procedura lentamente per mostrarvela, passo dopo passo. Naturalmente, in una procedura reale, avreste bisogno di un ratto profondamente anestetizzato, ma non morto. Vorreste che il cuore continuasse a battere.

Cominciamo con questo ratto. Ho posizionato il ratto supino, con la schiena rivolta lontano da me, e ho posto delle salviette imbevute sopra il suo naso. La prima cosa che farò sarà verificare che il ratto sia profondamente anestetizzato.

È quindi necessario farlo prima di ciascuna di queste procedure. Prendo quindi le pinzette e pizzico il ratto, e non c'è alcuna reazione. Se si verifica una qualsiasi reazione, è necessario rimettere il ratto nel belger per assicurarsi che sia profondamente anestetizzato.

Successivamente, utilizzerò etanolo al 70% per inumidire la metà superiore del ratto. Poi aprirò la cavità toracica. Per prima cosa, taglierò la pelle e l'aprirò lateralmente.

Poi aprirò la cavità stessa. Questa massa qui è il cuore. Qui potete vedere l'atrio destro.

È qui che taglierò per permettere al sangue di defluire. E poi, per perfondere l'intero corpo, devo inserire l'ago nel ventricolo sinistro. Quindi inserirò l'ago proprio qui.

E una volta inserito l'ago, aprirò il tubo endovenoso per far scorrere la soluzione salina, e lo lascerò agire per cinque-dieci minuti. Se la perfusione è buona, osserverete una decolorazione del polso rosso, del naso rosso e degli occhi del ratto, ovviamente, a indicare che il sangue sta abbandonando il corpo del ratto. Ciò significa che la perfusione dovrebbe essere adeguata.

Ecco il topo dopo la perfusione cardiaca. Come potete vedere, il naso, le orecchie e gli occhi di questo topo non sono più rosa o rossi. Sono completamente bianchi, il che dimostra che la perfusione ha funzionato correttamente.

Tutto o la maggior parte del sangue ha abbandonato le macchie del ratto. Ora che il ratto è stato sottoposto a perfusione cardiaca, devo tagliargli la testa. Devo decapitare il ratto.

E per questo userò attrezzatura da laboratorio standard. Ora procederò a rimuovere il cervello dal ratto. Imbiberò tutto il pelo con etanolo al 70% per evitare che i peli si disperdano nell'ambiente.

Poi procederò a rimuovere innanzitutto la cute. E poiché non intendo utilizzare il cervello per l'istologia e lo taglierò in piccoli pezzi, non faccio troppa attenzione a estrarlo in modo pulito. In un unico pezzo, inserirò le forbici alla base del cranio, nel punto in cui il cervello si collega al midollo spinale, proprio qui.

E ora taglierò l'osso su ciascun lato e poi rimuoverò la parte superiore. E ripeterò questo procedimento più volte. Ecco qui il cervello completamente esposto.

E come potete vedere, la perfusione ha funzionato bene perché il cervello è completamente limpido. In un animale non perfuso, si noterebbe che lo strato superiore del cervello sarebbe completamente coperto da capillari rossi, capillari sanguigni rossi, mentre qui non si vedono affatto, il che indica che la perfusione è stata efficace. Ora procederò a estrarre il cervello, assicurandomi di non lasciare indietro il bulbo olfattivo, e lo metterò in un tubo contenente una soluzione fredda chiamata PBS.

Ora, ancora, senza stare troppo attento a mantenerlo intatto, metterò il cervello nel tubo contenente PBS e taglierò i nervi ottici; quindi, utilizzando una spatola, uscirà abbastanza facilmente. Ora rimuoverò il midollo spinale dallo stesso ratto. E anche in questo caso, poiché lo taglieremo in piccoli pezzi, non starò troppo attento a estrarlo in modo particolarmente pulito, purché riesca a rimuoverlo completamente.

Ho prima tagliato la pelle lungo tutta la colonna vertebrale e qui la colonna vertebrale è visibile. Successivamente, rimuoverò la carne in modo che la colonna vertebrale sia completamente esposta. E proprio qui potete vedere il midollo spinale.

In un topo, puoi tagliare entrambe le estremità e iniettare PBS con la siringa, e il midollo spinale uscirà quasi intero. Ma nei ratti non è così semplice. Devo aprirlo e rimuovere il midollo spinale con una spatola.

Ora taglio su entrambi i lati e, come ho fatto per il cervello, taglio e rimuovo l'osso in modo da esporre il midollo spinale. Come per il cervello, il midollo spinale è completamente bianco, il che dimostra che la perfusione cardiaca ha funzionato correttamente. E procederò così lungo tutta la colonna vertebrale.

Scendo fino al livello dell'anca destra, proprio qui. Poi uso semplicemente una pinzetta, non è un'operazione molto elegante, ma estraggo il midollo spinale e lo metto nel mio tubo insieme al cervello. Ora nel mio tubo ho sia il cervello che il midollo spinale del ratto, e sono pronto a preparare la mia sospensione cellulare singola.

Ora sono pronto a preparare una sospensione di singole cellule dal mio sistema nervoso centrale. Per fare ciò, avrò bisogno di una piastra di Petri da 10 centimetri in cui posizionerò un filtro cellulare da 70 micron. Userò anche lo stantuffo di una siringa da un millilitro, oltre a pinzette e forbici.

Quindi inserirò il mio campione nel filtro cellulare e verificherò che non rimanga nulla nel tubo. Poi lo taglierò in piccoli pezzi, mescolando sia il cervello che il midollo spinale. Quando tutto sarà ben tritato, userò lo stantuffo della siringa di O'Neill e lo spingerò attraverso il filtro.

E vedrai progressivamente che il PBS all'esterno del dispositivo per cellule andrà via via intorbidandosi man mano che le cellule singole lo attraversano. Se volessi ottenere una sospensione cellulare sterile, ovviamente procederei all'interno di una cappa a flusso laminare e non inserirei le dita al suo interno. Ora che il PBS è torbido, lo raccoglierò per la prima volta e lo trasferirò in una provetta da 50 ml.

Ma terrò anche d'occhio e aggiungerò altro PBS al mio cell trainer, quindi procederò a schiacciare il campione. Poiché il SNC contiene una grande quantità di grasso, è uno degli organi che trovo più difficili da preparare come sospensione cellulare con questa tecnica. Ho quindi fatto passare tutto il mio SNC attraverso il cell trainer più volte, raccogliendo l'intera sospensione di cellule singole.

Ecco il tubo che ho riempito fino a 50 ml con PBS contenente la mia sospensione di singole cellule preparata dal SNC a destra. Ora, centrifugerò questo tubo per prepararlo per il gradiente; le cellule hanno terminato la centrifugazione. Abbiamo ora un pellet, quindi eliminerò il soprannatante e risospendo le mie cellule in 20 millilitri di percoll al 30% in PBS.

E sovrapporrò questo a 10 mil di Perkol al 70% in PBS per indurre la migrazione. Quindi scarto il sopranatante. Rompo il pallet per assicurarmi che le cellule siano in sospensione singola e non raggruppate nel pellet.

Ora ho la mia sospensione di cellule del sistema nervoso centrale in sospensione singola. Sospenderò queste cellule in 20 ml di percoll al 30% in PBS e sovrapporrò questi 20 ml su 10 ml di percoll al 70% in PBS. Successivamente, centrifugerò il campione.

Ora prenderò i miei 20 ml di sospensione del SNC e li sovrapporrò lentamente sullo strato di percol al 70% per facilitare l'operazione. È possibile aggiungere anche un colorante come il rosso fenolo in uno degli strati, ma non sono del tutto sicuro di quale effetto possa avere sulle cellule, ammesso che ne abbia. Pertanto, cerco di evitarlo.

È necessario procedere abbastanza lentamente in modo che i due strati non si mescolino, evitando quindi turbolenze significative nel tuo strato inferiore. Man mano che lo strato superiore diventa più spesso, è possibile aumentare la velocità. Ora ho aggiunto le mie cellule al gradiente.

Quindi lo strato chiaro qui in basso è lo strato di percoll al 70%, e lo strato torbido in alto è uno strato di percoll al 30% che contiene la mia sospensione di cellule singole. Ora metterò questa provetta nella centrifuga per 20 minuti e, se avrò lavorato bene, sarò in grado di visualizzare lo strato di cellule monocle. A questo punto abbiamo terminato la centrifugazione del gradiente.

Come sempre, dopo aver centrifugato un gradiente, fare molta attenzione a disinserire il freno per evitare che rallenti troppo velocemente e comprometta il gradiente. A questo punto abbiamo i nostri strati. Sopra il gradiente è presente uno strato di grasso che rimuoverò per evitare di contaminare la mia sospensione cellulare.

E all'interfaccia tra i due strati di percol al 30 e al 70%, si nota che l'interfaccia non è netta, ma sfumata, ed è proprio lì che si trovano le cellule. Una volta rimosse le cellule, vedrete che l'interfaccia diventerà molto più definita. Quindi, rimuoverò semplicemente la maggior parte del grasso presente nello strato superiore e lo getterò nel cestino.

Non ho bisogno di rimuoverne tutto, ma voglio eliminarne una quantità sufficiente da evitare che ricopra completamente la mia pipetta quando scendo a prelevare le cellule monocle. Ora utilizzerò un'altra pipetta di trasferimento per raggiungere il livello dell'interfaccia e raccogliere le mie cellule. In questo momento ho raccolto diversi millilitri all'interfaccia.

Quindi probabilmente ho ottenuto tutte le cellule disponibili. Il numero di cellule monocitarie nel SNC era davvero ridotto. Ora ho le mie cellule mononucleate nel tubo.

Aggiungerò PBS fino a raggiungere un volume di 50 ml in quel tubo e centrifugerò le cellule per raccoglierle in pellet, in modo da eliminare il perle. Consiglio di lavarle almeno un paio di volte con un volume completo di PBS per assicurarsi di rimuovere tutto il perle. A questo punto, le cellule sono pronte per qualsiasi procedura si desideri eseguire con esse.

Oggi vi ho mostrato come isolare cellule mononucleate dal sistema nervoso centrale di ratti. Una volta ottenute queste cellule, è possibile purificarle ulteriormente per isolare, ad esempio, linfociti T dalla popolazione. Quello che farò con queste cellule è eseguire un'analisi mediante citometria a flusso per rilevare le popolazioni cellulari presenti nel mio campione cerebrale.

In bocca al lupo per la vostra isolazione cellulare.