Name: Paw-trascinamento: un romanzo, analisi sensibile del cilindro di prova del mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Scopri l'analisi del comportamento di trascinamento della zampa nel test del cilindro per valutare i deficit motori nei topi dopo ictus ischemico focale. Questo metodo offre una misura più sensibile rispetto all'analisi tradizionale dell'asimmetria degli arti.

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Ringraziamo il Sig John Crowell e il signor Terry Upshall per la loro esperienza e assistenza tecnica con la fotografia e videografia. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a JLV dal Canadian Institutes of Health Research e la ricerca e sviluppo Corporation di Terranova e un cuore e Stroke Foundation of Canada Canadian partnership operativa per Stroke Recovery Catalyst sovvenzione. RBR era destinatario di un Keith Griffiths Memorial Heart &amp; Stroke Foundation Graduate Scholarship.

Dichiarazione etica: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Memorial University of Animal Care Comitato Etico di Terranova secondo le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali. 1. Mice <ol><li> Utilizzare topi adulti. In questo studio, sono stati utilizzati topi maschi adulti FVBN (n = 10) tra 2-4 mesi. Topi di casa su un 12:12 ora inversione del ciclo luce-buio e forniscono chow roditore standard ed acqua ad libitum. </li></ol> 2. I materiali richiesti per il Test cilindro <ol><li> Ottenere un tavolo con un top trasparente per filmare il test del cilindro. Le dimensioni della tabella sono irrilevanti, il superiore deve essere plexiglass o vetro, e ci deve essere abbastanza spazio per posizionare uno specchio in calce. Questo permette il mouse per essere videoregistrate dal basso. Usare uno specchio calce per riflettere l&#39;immagine attraverso il cilindro. In alternativa, utilizzare una telecamera capovolta se disponibile. Le dimensioni del tavolo utilizzati in questo protocollo sono 54 x 56 x 66,5 centimetri (WxLxH) con un 51 x 51 centimetri superiore (axl). </li><li> Ottenere uno specchio. Le dimensioni dello specchio utilizzati nel presente protocollo sono 34 x 58cm (axl). </li><li> Ottenere un cilindro trasparente / plexiglass per il mouse per eseguire in. Le dimensioni del cilindro utilizzati in questo protocollo sono 17,5 centimetri alto, 8,8 centimetri ID, 9,5 centimetri diametro con uno spessore di 0,35 centimetri. Un cilindro più alto può essere richiesto per i ceppi più attivi del mouse. </li><li> Posizionare il cilindro sul tavolo e filmare il riflesso nello specchio di seguito. </li><li> Sono necessarie una videocamera e cavalletto. Registrare video a circa 650KB / s, che è di circa 190 MB per ogni 5 minuti di video di cilindro. Assicurarsi che la fotocamera ha una funzionalità di zoom per garantire che il cilindro abbraccia l&#39;intero campo visivo. NOTA: La videocamera utilizzata in questo protocollo è una Sony DCR-SR42, zoom ottico 40x, zoom digitale 2,000x, 680kpix che utilizza la definizione standard, NTSC video interlacciato). </li><li> Ottenere software per l&#39;analisi - un pl multimedialeayer con supporto video e modulazione della velocità di riproduzione. Il lettore multimediale utilizzata in questo protocollo è la v2.1.2 VLC Media Player. </li><li> Ottenere un computer con un sistema operativo in grado di eseguire il lettore multimediale e un monitor. </li><li> Per una conservazione elettronica per i video. Scaricare video da un disco rigido esterno o copiarlo su DVD per la conservazione a lungo termine. NOTA: A 190MB per video, 84 sessioni di stare su una scheda SD da 16 GB e 168 sessioni di stare su una scheda SD da 32 GB. A causa della relativa economicità dei media SD, e l&#39;incertezza in quanto tempo alcuni topi richiedono di completare 20 gomme posteriori, si consiglia una scheda da 32 GB. In questo studio, i video sono stati copiati dalla fotocamera a un hard disk esterno da 2 TB e poi ricopiati su DVD come backup. </li></ol> 3. Setup sperimentale della prova Cilindro <ol><li> Fissare mirror qui sotto il tavolo in un angolo di 45 gradi al piano del tavolo. Farlo utilizzando due staffe di supporto attaccati alle gambe del tavolo a support la parte superiore e inferiore dello specchio, rispettivamente. Località staffe sono noti in una vista laterale della tabella (Figura 1A) e una vista faccia sul tavolo (Figura 1B). </li><li> Posizionare cilindro sul centro del tavolo. Disegnare quattro linee equidistanti cui il cilindro si siede sul tavolo con un pennarello nero (Sharpie) in modo che il cilindro può essere sollevato e restituito alla stessa posizione (figura 2). Li disegno sul lato inferiore del tavolo trasparente permette il tavolo da pulire tra sperimentazione animale senza dissolvere l&#39;inchiostro indicatore. </li><li> Fissare la macchina fotografica e cavalletto. Puntare la fotocamera a specchio in modo che l&#39;immagine guarda direttamente attraverso la canna del cilindro. Assicurarsi che la parete interna del cilindro pieno è visibile e ostruita dalla base (Figura 3). Vedere una vista laterale-on della configurazione, compreso l&#39;angolo relativo della configurazione della telecamera e specchio, dall&#39;alto (figura 4A) e dallivello della falda, compreso un allevamento mouse (Figura 4B). </li><li> Preparare le carte cue per identificare ogni mouse prima delle riprese. Assicurarsi che le carte includono tipicamente un numero di identificazione per ciascun topo, il time-point della prova (ad es., 3 giorni dopo il trattamento) e la data della sessione riprese. Non includere il gruppo di trattamento sulla carta spunto per garantire lo sperimentatore è accecato. </li><li> Film in condizioni di illuminazione interna standard come questo livello di luce è necessaria per vedere chiaramente i movimenti del mouse intorno al cilindro. NOTA: Se disponibile riprese al buio con una fotocamera luce rossa può essere sufficiente, ma ci si deve prima verificare se tocchi zampa e trascina sono chiaramente visibili per la quantificazione. </li></ol> 4. Esecuzione <ol><li> Iniziare le riprese. Visualizza la scheda spunto del mouse adeguato davanti all&#39;obiettivo della fotocamera. </li><li> Abbassare il mouse nel cilindro dall&#39;alto aperto subito dopo aver girato la scheda cue. </li><li> Iniziate le riprese del mouse. Ridurre al minimo il rumore durante questo periodo, come i topi potrebbero perdere interesse ad esplorare se spaventato. </li><li> Osservare la parte posteriore topi di esplorare il cilindro. Cattura il video fino a quando il mouse esegue un minimo di venti posteriori. NOTA: A posteriori si verifica quando entrambi zampe anteriori perdono contatto con il pavimento e il mouse si erge sulle zampe posteriori. </li><li> Pulire tavolo e cilindro con una soluzione di pulizia adeguato tra ogni mouse per igienizzare ed eliminare profumi del mouse. </li><li> Il congelamento è quando i topi smettere di esplorare e rimanere tranquillamente seduto a quattro zampe per circa 5 minuti. Se topi congelare prima che si verifichino venti retri, può essere necessario rimuoverli dal cilindro per 10-20 minuti prima di riprendere la prova. Se i topi non eseguono venti posteriori, vengono rimossi dallo studio. NOTA: Nella nostra esperienza, i topi hanno mai avuto bisogno di essere esclusi a causa di mancanza di esplorare il cilindro. </li></ol> 5. Valutazione del Test Cilindro con Paw-trascinamentoAnalisi <ol><li> Riprodurre il video a un tasso compreso tra 0,25x e 0.67x velocità normale a seconda di quanto velocemente il mouse esplora il cilindro. Utilizzare un lettore multimediale che offre una velocità di riproduzione lenta. </li><li> Quantificare il numero totale di tocchi zampa. Tocchi Paw si verificano quando le ruote posteriori del mouse (Figura 5A), tocca il lato del cilindro (Figura 5B), poi smonta con entrambe le zampe contemporaneamente (Figura 5C) e terre (Figura 5D). La zampa può o non può contattare la parete del cilindro con una palma piena, ma qualche contatto con la parete del cilindro deve avvenire. Valutare tocchi zampa contando il numero di volte che il mouse entra in contatto (per quanto breve) con la parete del cilindro con una o entrambe le zampe anteriori mentre permanente sulle sue arti posteriori durante una posteriore. Si noti che il contatto con la parete del cilindro viene conteggiato solo come &quot;touch paw&quot; o &quot;zampa trascinare&quot; se il mouse è in posizione arretrata - piedisui suoi arti posteriori con entrambe le zampe anteriori fuori del piano del tavolo. Se il mouse rimane in una posizione di 3 punti - entrambi gli arti posteriori e una zampa sul tavolo e comincia a toccare il muro con la zampa libera - questo non viene conteggiato come un tocco zampa. I topi possono posteriore e toccare la parete del cilindro con una sola zampa anteriore e questo viene considerato come un tocco di zampa. Nota: un mouse può spostare il proprio corpo intorno al cilindro durante una posteriore, rendendo più di due contatti. Questi contatti sono conteggiati - uno per ogni tocco di zampa anteriore sinistra e uno per ogni tocco zampa anteriore destra. </li><li> Quantificare il numero di zampa-trascina. Comportamento trascinando Paw è distinta dalle normali tocchi zampa. <ol><li> Se i contatti zampa parete del cilindro con un pieno palma aperta (Figura 6B), che cadrà lentamente dalla parete, spesso con un leggero tremore. Il movimento inizia con le cifre trascinamento contro la parete del cilindro sia in direzione mediale o verso il basso, (Figura 6C) prima allontanamento completely (Figura 6D). Il mouse sarà quindi smontare con la sua zampa inalterato (Figura 6E) prima di atterrare a quattro zampe (Figura 6F). Questo è considerato una zampa-resistenza e dovrebbe essere considerata in un conteggio. </li><li> Se il paw non tocchi la parete del cilindro con una palma completamente aperta, esso sfiorare la parete del cilindro con le cifre prima allontanamento dalla parete del cilindro. Allo stesso modo, un mouse può trascinare la zampa contro la parete del cilindro, ma non rilasciarlo completamente prima di scendere. Questi sono entrambi considerati zampa-trascina così come tocchi e dovrebbe essere considerato come sia in un conteggio. </li><li> La zampa può anche trascinare lungo la parete del cilindro, mentre un mouse esplora il cilindro. In questo caso, la zampa seguirà la torsione del busto del mouse come esplora sinistra oa destra della sua posizione originale (Figura 7A-D) prima di smontaggio (Figura 7E). Questo non è considerato una zampa-trascinamento, in quanto dipende mouse scelta casualeuna direzione di esplorare e non dipende da quale emisfero corticale è stato danneggiato. </li></ol></li><li> Paw-trascina sono espressi in percentuale di zampa trascina per numero totale di tocchi zampa durante una sessione. Esprimere il numero di zampa-trascina come percentuale di contatti totali zampa per ogni zampa anteriore separatamente. </li><li> Tocchi conseguente una zampa trascinare contano come una zampa trascinare e un tocco contemporaneamente. Così, se un mouse trascina la zampa ogni volta i contatti zampa la parete del cilindro, la percentuale paw trascinamento è espressa come 100%. </li></ol> 6. Ulteriori design sperimentale Suggerimenti <ol><li> Per ridurre al minimo le variabili estranee: <ol><li> Testare i topi allo stesso tempo ogni giorno test. Testare i topi durante il loro ciclo di veglia. Mantenere topi su un ciclo di luce retromarcia 12 ore facilita la prestazione. </li><li> I topi possono essere riluttanti a esplorare il cilindro se ha sottolineato sia da rumore o un ambiente nuovo. Test topi nella loro camera di conservazione animale o di una stanza che abbiano ieen confidenza con riduce lo stress. Ciò si può verificare se la stanza è rumorosa, se il mouse è stato spintonato prima di entrare nel cilindro o per assuefazione. NOTA: Il test dovrebbe essere effettuato una volta prima di manipolazione sperimentale di servire come una lettura di base. Dopo manipolazione, giorni di test sono a discrezione dello sperimentatore, se si consiglia di evitare un eccessivo numero di esposizioni al cilindro in un breve periodo di tempo. </li><li> Topi può diventare riluttanti a posteriori dopo 6-7 esposizioni verso il cilindro. Per questo studio, i topi sono stati testati nel cilindro per un totale di sette volte, prima di ischemia e nei giorni 1, 3, 7, 14, 21 e 28 post-intervento chirurgico. NOTA: In questo studio abbiamo utilizzato il ceppo FVBN mouse. Abbiamo precedentemente testato topi C57BL / 6 nel cilindro e comportamento paw trascinando osservati dopo un ET-1 danno ischemico (dati non mostrati). C57BL / 6 topi sono stati più attivi che FVBN topi quando allevamento e spesso saltato sul bordo del cilindroprima di salire fuori. Cilindri Taller dovrebbero essere usati se i topi cercano di fuggire saltando. </li></ol></li></ol> 7. L&#39;endotelina-1 Chirurgia e infarto misurazioni del volume <ol><li> Eseguire endotelina-1 chirurgia e misurazioni del volume dell&#39;infarto secondo protocolli precedentemente pubblicati 4. Per indirizzare anteriore corteccia motoria degli arti anteriori, ogni mouse dovrebbe ricevere tre ET-1 iniezioni alle seguenti coordinate: (i) +0,7 anteriorposterior (AP) /1.5 medio-laterale (ml) / - 1.2 dorso-ventrale (DV), ( ii) +0.4 AP / 1,25 ml / - 1.2 DV e (iii) +0,1 AP / 1,75 ml / -1.2 DV 4. </li></ol> 8. Analisi statistica <ol><li> Si raccomanda un due vie misure ripetute analisi della varianza (ANOVA) per analizzare la percentuale di zampa trascinamento per le zampe affetti e non tra i diversi punti di tempo. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

I punti chiave per stabilire quando quantificazione comportamento zampa trascinando nella prova del cilindro sono i seguenti: i) quantificare il numero di zampa trascina contro tocchi zampa totali per ogni zampa prima di lesioni cerebrali per stabilire una linea di base; ii) quantificare il numero di zampa-trascina contro tocchi zampa totali per ogni zampa dopo l&#39;infortunio ischemico; e iii) di discriminare tra una zampa-resistenza e il movimento laterale della zampa lungo la parete del cilindro durante la rotazione...

L&#39;obiettivo di strategie di risanamento neurali è quello di dimostrare sia la riparazione dei tessuti e recupero funzionale. Il recupero funzionale è in genere valutata con test comportamentali che misurano deficit funzionali, in questo caso che coinvolge le abilità motorie che sono associati con danni alle regioni specifiche del cervello. Lesione cerebrale traumatica o danno ischemico all&#39;area forelimb sensomotoria della corteccia possono essere dimostrati da una serie di test comportamentali. Uno di questi test, il test del cilindro è ampiamente utilizzata nei ratti per valutare deficit funzionali all&#39;attività degli arti anteriori 1. Il test ha un basso costo di set-up che richiede solo un cilindro, fotocamera e tavolino con trasparente. E &#39;facile da gestire in quanto si basa sul comportamento esplorativo naturale dei roditori, quindi non sono necessari pre-allenamento e privazione di cibo o ricompense. Nonostante questi numerosi vantaggi, il test cilindro è sottoutilizzato per valutare i deficit degli arti anteriori nei topi dopo lesioni focali alla zampa anteriore sensorimotor corteccia, che si attribuisce all&#39;analisi del comportamento topo nel test del cilindro. Asimmetria forelimb è la misura classica di analisi per il test del cilindro. Quando è inserito nel cilindro, roditori naturalmente esplorare le pareti del cilindro da allevamento sui loro arti posteriori e toccando le pareti del cilindro con le zampe degli arti anteriori per l&#39;equilibrio posturale. Il numero di tocchi zampa muro con ogni zampa anteriore è facilmente quantificato riprese roditori durante questa esplorazione del cilindro. Asimmetria zampa anteriore si verifica quando la zampa zampa anteriore colpita rende meno tocchi con la parete che la zampa anteriore zampa inalterato ed è indicativa di un danno alla corteccia sensomotoria controlaterale. Nei ratti, le iniezioni intra-corticali dell&#39;agente vasocostrittiva, endotelina (ET-1), nella corteccia sensomotoria forelimb provoca una lesione ischemica focale che si traduce in deficit comportamentali nella zampa anteriore controlaterale. Deficit in uso forelimb controlaterale sono facilmente rilevati come variazioni di forelimb asimmetria nel test del cilindro in ratti 1-3. A differenza di ratti però, i cambiamenti nella zampa anteriore asimmetria sono variabili e meno consistente nei topi dopo comparabili ET-1 iniezioni 4-6. Qui mostriamo una nuova analisi del comportamento degli arti anteriori nel test del cilindro - analisi del comportamento-zampa di trascinamento. Abbiamo precedentemente dimostrato che l&#39;analisi zampa trascinamento è una misura più sensibile di danno al forelimb sensorimotor corteccia nei topi rispetto all&#39;analisi forelimb asimmetria classica e quindi è applicabile ad una varietà di modelli di lesioni focali corticali. L&#39;esame di come i contatti delle zampe anteriori la parete del cilindro seguente danno ischemico alla corteccia sensomotoria forelimb rivelato un comportamento romanzo nei topi - zampa-trascinamento 4. Una zampa-trascinamento si verifica quando il mouse si trova sulle zampe posteriori per esplorare la parete del cilindro poi trascina il suo affetto zampa (contra-lesionale) lungo la parete del cilindro verso la sua linea mediana o verso il basso il tempo murola sua zampa inalterato fornisce supporto posturale contro il muro. Paw-trascina raramente si verificano nei topi incolumi dunque l&#39;aspetto di una zampa-resistenza è un indicatore positivo di lesioni alla corteccia sensomotoria forelimb 4. Abbiamo già quantificato comportamento zampa trascinando nei topi dopo ET-1 danno ischemico al forelimb sensomotorio corteccia e abbiamo dimostrato il comportamento-zampa trascinando sostenuta nei topi fino a due settimane post-ictus 4. Qui mostriamo che il comportamento-zampa trascinamento è sostenuta fino a quattro settimane post-ictus. Analisi del comportamento della zampa trascinando fornisce uno strumento nuovo e sensibile per la valutazione danno ischemico focale alla corteccia sensomotoria arti anteriori nei topi. Il suo basso costo di set-up, la facilità di amministrazione e segnando fanno di questo uno strumento semplice, ma utile per valutare rapidamente deficit comportamentali degli arti anteriori nei topi.

<table><tbody><tr>Cilindro <td></td><td></td><td>in plexiglass</td><td>alto 17,5 cm, diametro esterno 9,5 cm, diametro interno 8,8 cm, spessore parete 0,35 cm (o 3,5 mm)</td></tr><tr><td>tavolo</td><td></td><td></td> di visualizzazione <td>54x56x66,5 cm (larghezza x lunghezza x altezza), il piano del tavolo è una lastra di plexiglass 51x51 cm.</td></tr><tr><td>specchio</td><td></td><td></td><td>34x58 cm</td></tr><tr><td>specchio videocamera</td><td>Sony</td><td>DCR-SR42</td><td>Videocamera con memoria integrata, funzionalità SD, zoom ottico 40x</td></tr><tr><td>computer</td><td>Dell</td><td>Optiplex 760</td><td>Processore: Intel, 3,0 GHz, memoria 4,00 GB (RAM)&nbsp;</td></tr><tr><td>monitor per computer</td><td>Samsung</td><td>S22C350H</td><td></td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office Professional Plus)</td><td>Microsoft</td><td>v14.0.7106.5003</td><td></td></tr><tr><td>VLC Media Player</td><td>Video LAN</td><td>v2.1.2</td><td>Lettore multimediale con modulazione della velocità di riproduzione e supporto video</td></tr><tr><td>Disco rigido esterno</td><td>Western Digital</td><td>WDBAAU0020HBK-01</td><td>2 TB</td></tr></tbody></table>

paw-trascinamento: un romanzo, analisi sensibile del cilindro di prova del mouse

Paw-Dragging: a Novel, Sensitive Analysis of the Mouse Cylinder Test

Il test del cilindro è abitualmente utilizzato per prevedere il danno ischemico focale alla corteccia motoria degli arti anteriori nei roditori. Quando è inserito nel cilindro, roditori esplorano da allevamento e toccando le pareti del cilindro con le zampe degli arti anteriori per il supporto posturale. A seguito di danno ischemico alla corteccia sensomotoria zampa anteriore, i ratti si affidano maggiormente alle loro arti anteriori zampa inalterata per il supporto posturale conseguente minor numero di tocchi con la zampa interessata che è chiamato arti anteriori asimmetria. Al contrario, danno ischemico focale nel cervello di topo non riesce a portare a deficit consistenti simili in forelimb asimmetria. Mentre i deficit forelimb asimmetria sono raramente osservati, i topi non mostrano un romanzo comportamento post ictus chiamato &quot;zampa-trascinamento&quot;. Paw-trascinamento è la tendenza per un mouse per trascinare la zampa interessata lungo la parete del cilindro, piuttosto che spingere direttamente fuori dal muro quando smontando da un posteriore per una presa di posizione a quattro zampe. Abbiamo già dimostrato checomportamento trascinando la zampa è molto sensibile alle piccole lesioni ischemiche corticali alla corteccia motoria degli arti anteriori. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;analisi-zampa di trascinamento. Definiamo cosa una zampa-resistenza è e dimostrare come quantificare il comportamento-zampa di trascinamento. Il test del cilindro è un test semplice ed economico da gestire e non richiede pre-formazione o strategie privazione alimentare. Utilizzando analisi-zampa trascinando al test del cilindro, si riempie una nicchia per predire le lesioni ischemiche corticali, come photothrombosis e endotelina-1 (ET-1) ischemia indotta - due modelli che sono sempre più in popolarità e producono lesioni focali più piccoli di occlusione dell&#39;arteria cerebrale media. Infine, misurando il comportamento-zampa trascinando nel test del cilindro permetterà studi di recupero funzionale dopo lesione corticale utilizzando una vasta coorte di ceppi di topi transgenici in cui precedente analisi forelimb asimmetria non è riuscita a rilevare i deficit consistenti.

Abbiamo già dimostrato che il comportamento-zampa trascinando appare a seguito di una focale danno ischemico al forelimb sensomotorio corteccia ed è un indicatore positivo di danni 4. Iniezioni intra-corticali di ET-1 nella corteccia forelimb sensorimotor stati usati per indurre una lesione ischemica (Figura 8A, B). Questo studio ha esaminato se il comportamento-zampa trascinando prorogato per più di 14 giorni post-infortunio per il suo uso potenziale per valutare il recupero funzionale. I to...

Classica analisi forelimb asimmetria del test del cilindro viene normalmente utilizzato per valutare deficit comportamentali nei ratti seguenti lesione cerebrale o ictus; tuttavia, esso non riesce a rilevare deficit consistenti in topi. Questo studio dimostra che quantificare il comportamento zampa-trascinamento è un&#39;analisi più sensibile di lesioni cerebrali nei topi.

Paw-trascinamento: un romanzo, analisi sensibile del cilindro di prova del mouse

The cylinder test is routinely used to predict focal ischemic damage to the forelimb motor cortex in rodents. When placed in the cylinder, rodents explore ...

Ciao, sono la dottoressa Jackie Vander Loot. Salve, il mio nome è Brian Room. Oggi discuteremo un'analisi sensibile del test del cilindro relativo al trascinamento della zampa.Il test del cilindro è un test della funzione motoria delle quattro zampe nei roditori. In questo test, i topi esplorano un cilindro in plexiglass sollevandosi sulle zampe posteriori e appoggiandosi al muro del cilindro con le quattro zampe. L'osservazione dell'utilizzo delle quattro zampe durante l'esplorazione del cilindro permette di determinare se il topo presenta deficit motori.In particolare, confrontiamo l'utilizzo di ciascuna delle quattro zampe prima e dopo l'ictus. Dopo un ictus, la zampa contralaterale all'emisfero lesionato viene utilizzata meno frequentemente. Questo cambiamento nell'uso della zampa affetta rispetto alla zampa non affetta costituisce una misura dell'asimmetria degli arti. Attualmente, l'analisi dell'asimmetria degli arti viene utilizzata nei topi e nei ratti dopo lesioni ischemiche estese, come l'occlusione dell'arteria cerebrale media, come parametro comportamentale dell'ictus. A differenza delle lesioni estese, l'asimmetria degli arti non viene osservata nei topi con piccole lesioni ischemiche focali. Ciò potrebbe dipendere dal fatto che l'analisi dell'asimmetria degli arti nel test del cilindro è sensibile a lesioni di grandi dimensioni, ma non è utile per rilevare lesioni più piccole.Lesioni ischemiche focali di piccole dimensioni, come la foto-trombosi e l'ischemia indotta dall'endotelio, stanno diventando sempre più comuni nella maggior parte dei modelli. Ciò sottolinea la necessità di test comportamentali funzionali per valutare questi danni corticali di entità ridotta. Nel mio laboratorio, Brian Room ha sviluppato un'analisi innovativa del test del cilindro che chiamiamo «paw dragging».Esaminando in che modo le quattro zampe del topo entrano in contatto con la parete del cilindro dopo un'influenza ischemica all'endotelio, abbiamo osservato un nuovo comportamento della zampa colpita. Nei topi non feriti, una zampa trascinata entrerà in contatto con la parete del cilindro con una o entrambe le zampe anteriori mentre il topo si solleva, appoggiando saldamente le sue quattro zampe contro la parete per sostenersi durante l'esplorazione, per poi usare le zampe per spingersi via dalla parete stessa. Quando il topo ritorna alla posizione su tutte e quattro le zampe, dopo un'influenza ischemica all'endotelio, la zampa colpita non fornisce un sostegno saldo nonostante entri in contatto con la parete del cilindro.Invece di seguire il contatto, il palmo si stacca e le dita strisciano lungo la parete del cilindro prima di rilasciarsi completamente. Questo movimento di trascinamento della zampa si verifica sia quando la zampa si muove in direzione orizzontale verso la linea mediana del corpo, sia in direzione verticale verso il pavimento. In precedenza abbiamo quantificato il comportamento di trascinamento podalico nei topi dopo un'injury ischemica e dimostrato un aumento del comportamento di trascinamento podalico dell'arto interessato fino a due settimane dopo l'ischemia.Inoltre, i nostri dati hanno mostrato che il comportamento di trascinamento della zampa è correlato a lesioni della corteccia motoria. In questo video, illustreremo come impostare il test del cilindro e analizzare il comportamento di trascinamento della zampa in video registrati. Il test del cilindro è semplice da allestire e da eseguire e presenta costi ridotti.È necessario disporre di un tavolo con un centro cavo, coperto da un foglio di plexiglass. Questo ci permette di riprendere il più possibile dal basso. Il cilindro di plexiglass viene posizionato sopra il piano del tavolo.Sul fondo del piano del tavolo, quattro linee nere sono disegnate per indicare la posizione del cilindro. Queste linee fungono da guida in modo che il cilindro possa essere rimosso e riposizionato tra un tentativo e l'altro senza alterarne la posizione. Nel video, inoltre, i segni sono posizionati sul lato inferiore del tavolo, in modo che la pulizia del piano con etanolo al 70% non cancelli l'inchiostro.Per riprendere il topo dal basso utilizzando una telecamera e un treppiede, posizioniamo uno specchio a un angolo di circa 45 gradi al di sotto del piano del tavolo. Questo ci permette di evitare le complicazioni legate alla costruzione di un apparato separato per mantenere la telecamera in posizione al di sotto del piano del tavolo. Lo specchio viene fissato in posizione mediante staffe di sostegno come mostrato qui e qui.Le dimensioni delle staffe e dello specchio dipenderanno dalle misure dello spazio tra le gambe del tavolo. La fotocamera e il treppiede vengono posizionati a una distanza tale per cui tutta la superficie laterale del cilindro sia visibile nel campo visivo. Questa distanza è tipicamente non superiore a qualche piede, ma può variare a seconda dell'angolo dello specchio, dell'altezza del treppiede e delle capacità di zoom della fotocamera.Per eseguire il test, i topi vengono inseriti dall'alto nel cilindro prima della ripresa. Vengono utilizzate schede indicatore per identificare quale topo sta effettuando il test. Queste possono includere il numero del topo o un nome in codice, in modo che la persona che valuta i video del cilindro non conosca il trattamento ricevuto.La data della ripresa e il numero della prova possono essere inclusi anche sulla scheda. I topi vengono filmati fino a quando non hanno effettuato 20 sollevamenti sulle zampe posteriori. Per essere conteggiati in questo modo, entrambe le zampe anteriori devono staccarsi dal pavimento; i sollevamenti in cui ciò non avviene non vengono conteggiati.Se il topo tocca il muro con una zampa mentre l'altra rimane a terra, i video del cilindro vengono analizzati utilizzando il lettore multimediale VLC. Sebbene qualsiasi lettore multimediale con modulazione della velocità di riproduzione possa essere utilizzato, i trascinamenti delle zampe possono essere conteggiati mediante contatori meccanici o scrivendo i conteggi su carta. Registriamo i conteggi su carta e successivamente trasferiamo i dati in un foglio elettronico.Riproduzione video a 0,5 volte la velocità normale. Questa velocità è raccomandata per poter effettuare un conteggio efficace. A volte potrebbe essere necessario mettere in pausa e riprodurre nuovamente a una velocità inferiore.Si noti che un topo può anche muovere il corpo attorno al cilindro durante un appoggio, effettuando più di due contatti. Questi contatti vengono conteggiati singolarmente, uno per ogni contatto con la zampa anteriore sinistra e uno per ogni contatto con la zampa anteriore destra. I trascinamenti delle zampe vengono calcolati come percentuale del numero totale di contatti delle zampe con la parete del cilindro. Per ciascuna zampa, i contatti sono valutati contando il numero di volte in cui il topo entra in contatto con la parete del cilindro con una o entrambe le zampe anteriori.Si noti che un mouse può anche muovere il corpo attorno al cilindro durante un sollevamento, effettuando più di due contatti. Questi contatti vengono conteggiati singolarmente, uno per ogni tocco della zampa anteriore sinistra e uno per ogni tocco della zampa anteriore destra. La quantificazione del comportamento di trascinamento della zampa è distinta dalla quantificazione dei normali contatti della zampa; il trascinamento può avvenire con un movimento verticale o orizzontale della zampa.Il trascinamento spesso comporta un lieve tremore nella zampa interessata mentre si stacca dalla parete del cilindro, segno di debolezza e mancanza di controllo motorio. Si osservano spesso variazioni rispetto al tipico trascinamento della zampa nella zampa colpita. Un esempio è un trascinamento incompleto, in cui il palmo si solleva ma le dita strisciano contro il cilindro, anche se entrambe le zampe alla fine interrompono il contatto con la parete nello stesso momento. Quando si valuta il comportamento di trascinamento delle zampe, è importante non confondere il movimento esplorativo laterale del topo attorno al cilindro con un deficit della funzione motoria degli arti anteriori e posteriori.Durante l'esplorazione laterale, il topo si muove lateralmente attorno al cilindro e gli ultimi quattro artigli vengono trascinati seguendo la direzione del tronco del topo. Ad esempio, il topo si alza sulle zampe posteriori e tocca la parete con entrambe le zampe anteriori, riposiziona una delle sue zampe e poi si muove lateralmente verso la zampa riposizionata. Quando ciò accade, le zampe posteriori vengono quindi trascinate lungo la parete finché non vengono nuovamente appoggiate per il sostegno.La torsione del tronco del topo è un altro indicatore del comportamento esplorativo laterale. Questo comportamento è chiaramente diverso dal trascinamento della zampa, poiché il trascinamento della zampa non comporta movimenti laterali attorno alla parete del cilindro durante o immediatamente prima del trascinamento. I nostri studi hanno esaminato il trascinamento della zampa dopo una piccola lesione ischemica focale nella corteccia motoria degli arti anteriori.Qui mostriamo che il comportamento di trascinamento della zampa con i quattro picchi P interessati raggiunge un massimo a un giorno dall'ictus e diminuisce fino a sette giorni dopo l'ictus, momento in cui si stabilizza e rimane elevato fino a quattro settimane dopo l'ictus, poiché il deficit sembra protrarsi nel tempo. Questo permetterà ai ricercatori di studiare gli effetti dell'ictus cronico dopo una piccola lesione corticale. Inoltre, i trattamenti per l'ictus possono essere studiati a breve o a lungo termine in topi con lesioni corticali di piccole dimensioni.La nostra nuova analisi del trascinamento PO del test cellulare ha un potenziale come saggio comportamentale per l'ictus ischemico focale nei topi, come quelli indotti da foto-trombosi o endofilina. Uno nei topi con lesioni come l'occlusione dell'arteria cerebrale media, in cui l'asimmetria lam viene osservata nella maggior parte dei casi. Il trascinamento POD può essere utilizzato per determinare l'entità di lesioni più piccole e simili.Gli esperimenti con il test del trascinamento del piede possono essere effettuati fino a 28 giorni dopo l'ictus. Questo test ha un potenziale utilizzo in vari studi sul trattamento dell'ictus a breve e lungo termine.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

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Comportamento

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