Ambiente controllato Microfluidic per Dynamic Indagine Globulo rosso Aggregazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di quantificare direttamente gli aggregati di globuli rossi nel microcircolo, dinamicamente a velocità di taglio controllate e costanti. Ciò si ottiene con la prima sospensione di globuli rossi in allenamento, e un doppio microcanale a Y con una soluzione salina tampone fosfato, creando un allegria costante nello strato sanguigno. Il secondo passo consiste nel visualizzare e registrare il flusso con una telecamera ad alta velocità.

Successivamente, utilizzare le tecniche di elaborazione delle immagini per elaborare la registrazione e ottenere una dimensione media dell'aggregato e la distribuzione delle dimensioni dell'aggregato nel microcanale. Il passaggio finale consiste nel determinare la velocità del sangue seguendo lo spostamento delle particelle fluorescenti iniettate nel microcanale tra due fotogrammi consecutivi. In definitiva, la velocità di taglio nel microcanale viene calcolata in base alla velocità del sangue e allo spessore dello strato di sangue per mettere in relazione le dimensioni dell'aggregato con la corrispondente velocità di taglio locale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo di trasmissione della luce, è che gli aggregati di globuli rossi vengono analizzati dinamicamente nel flusso di condivisione microscopica rispetto a quelli statistici con altre tecniche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo emoradiologico, come la comprensione delle condizioni di formazione degli aggregati di globuli rossi e la ricerca del comportamento radiologico del sangue nella microcircolazione. Per iniziare a fabbricare micro canali, larghi 120 micron, alti 60 micron e lunghi sette millimetri secondo i metodi fotolitografici standard.

Successivamente, raccogliere le cellule del sangue da donatori volontari sani e preparare sospensioni di globuli rossi con livelli di ematocrito del cinque, 10 e 15% come descritto nel protocollo di testo allegato, combinare un millilitro di ciascuna sospensione di globuli rossi con 60 microlitri di una soluzione all'1% contenente particelle traccianti fluorescenti. Agitare delicatamente il tubo per mescolare la soluzione. Combina anche lo stesso volume di particelle traccianti con un millilitro di PBS a un pH di 7,4.

Caricare una siringa di vetro da 25 microlitri con la soluzione tracciante contenente globuli rossi e una siringa di vetro da 100 microlitri. Con la soluzione tracciante in PBS, assicurarsi che non siano presenti bolle nel sistema. Quindi posizionare il microcanale su un tavolino per microscopio invertito collegato a una fotocamera ad alta velocità in grado di registrare 18 fotogrammi al secondo o superiori e a un sistema di velocimetria dell'immagine a microparticelle.

Collegare ogni siringa tramite tubo a una delle porte di ingresso del canale microfluidico e quindi caricarle nel supporto della stessa pompa a siringa. Programmare la pompa a siringa in modo che eroghi la siringa da 25 microlitri a una velocità di due microlitri all'ora. In questo modo si eroga anche la siringa da 100 microlitri a una velocità quattro volte superiore a causa della differenza di dimensioni.

Modificare la portata tra gli esperimenti per testare diverse velocità di taglio. Usa una calibrazione ridicola con l'obiettivo 20x in posizione per calibrare la telecamera ad alta velocità. Quindi avviare la pompa per iniziare a erogare le due soluzioni nel microcanale.

Determinare un'esposizione ottimale della fotocamera. È il momento di ottenere immagini nitide degli aggregati. È importante attendere che il flusso raggiunga lo stato stazionario prima di acquisire qualsiasi misurazione.

Se lo stato stazionario è ora raggiungilo entro tre o cinque minuti. Riempire la siringa per educare la miscela e mantenere i globuli rossi in sospensione. Una volta raggiunto il flusso allo stato stazionario, iniziare a registrare il movimento dei globuli rossi.

Registra il flusso per sette secondi. Utilizzando un programma in grado di elaborare le immagini, migliorare il contrasto per ogni immagine in scala di grigi scattata utilizzando il metodo dell'equalizzatore dell'istogramma. Quindi, converti le immagini in scala di grigi in immagini binarie.

Impostare con attenzione il valore di soglia testando diversi valori e scegliendo il valore per il quale vengono rilevati correttamente tutti gli aggregati. Se necessario, riempire i fori corrispondenti agli spazi vuoti all'interno di un aggregato. Quindi rileva le celle determinando i pixel bianchi adiacenti nell'immagine binaria in modo che le celle adiacenti vengano considerate come aggregati.

Etichettare i diversi aggregati di globuli rossi rilevati, quindi convertire l'immagine binaria in un'immagine rossa, verde e blu per una migliore visualizzazione. Infine, sovrapponi l'immagine rossa, verde, blu all'immagine originale. Per verificare l'efficienza dell'elaborazione delle immagini, calcolare l'area di ciascun aggregato rilevato nel fotogramma in base al numero di pixel rilevati.

Elaborare tutti i fotogrammi nello stesso modo. Quindi, calcola la media delle dimensioni aggregate rilevate in ogni fotogramma e quindi dei risultati di tutti i fotogrammi. Per ottenere la dimensione media aggregata per ogni registrazione dei motori delle sospensioni di globuli rossi, convertire i risultati in micrometri quadrati utilizzando l'immagine ridicola.

Quindi calcola l'area di un globulo rosso per determinare un rappresentante. Numero stimato di globuli rossi all'interno di ciascun aggregato rilevato una volta acquisiti i dati. Utilizzando la fotocamera ad alta velocità, passare alla telecamera a doppio impulso utilizzata per il sistema di velocimetria a immagine di microparticelle.

Utilizzare un software di imaging come quello mostrato qui per l'acquisizione delle immagini del flusso e l'elaborazione delle immagini per la determinazione del campo di velocità. Assicurati di indossare occhiali protettivi e poi accendi il sistema laser e la fotocamera. Posizionare un micrometro sotto il microscopio e utilizzare l'immagine risultante per calibrare il sistema.

Quindi avviare il flusso del fluido e visualizzare le particelle in entrambi i fluidi. Trova il piano medio del microcanale concentrandoti sulle particelle più veloci e luminose nel flusso. Quindi, impostare l'intervallo di tempo tra i fotogrammi a circa due millisecondi in modo che le particelle più veloci si muovano da cinque a 10 pixel tra le due immagini e iniziare a registrare il flusso O.Impostare il software per acquisire 100 coppie di immagini per tutte le diverse sospensioni di globuli rossi e per diverse velocità di taglio.

Dopo la pre-elaborazione dell'immagine. Scegli la dimensione e la forma della finestra di correlazione, nonché la percentuale di immagini sovrapposte. Esprimi i risultati come campo di velocità media calcolato dalle 100 coppie di immagini e dall'errore quadratico medio di velocità.

Spegnere la fotocamera laser e il computer. Una volta eseguite tutte le misurazioni e l'elaborazione delle immagini, calcola il tasso di purezza rilevando e stimando prima lo spessore del sangue nel microcanale in base alla registrazione della telecamera ad alta velocità. A tale scopo, fare la media di tutti i fotogrammi nella registrazione specifica per ottenere un'immagine di sfondo del video.

Infine, elimina lo strato di sangue ispezionando visivamente l'immagine media di tutti i fotogrammi e rileva manualmente il bordo dello strato di sangue. Quindi ottenere manualmente il valore di velocità per lo spessore dello strato di sangue corrispondente dal profilo di velocità estratto e calcolare la velocità di taglio dividendo il valore di velocità per lo strato di sangue. Lo spessore mostrato qui sono i movimenti netti di quattro aggregati di globuli rossi che sono stati rilevati in tre fotogrammi consecutivi.

I grandi aggregati di oltre 30 celle sono mostrati in rosso. Gli aggregati medi compresi tra nove e 30 celle sono mostrati in verde, mentre gli aggregati piccoli con meno di nove celle sono mostrati in blu. La velocità di un aggregato varia in base alla sua posizione nel microcanale mostrato.

Ecco i profili di velocità dei globuli rossi sospesi al 5% di ematocrito, al 10% di ematocrito e al 15% di ematocrito a una velocità di flusso di 10 microlitri all'ora. Come previsto, la velocità si dirige verso lo zero su entrambi i bordi e il punto di inflessione tra i due flussi di flusso varia leggermente tra i livelli di ematocrito man mano che la velocità di taglio complessiva aumenta la dimensione degli aggregati in ciascun livello di ematocrito. Ciò è dovuto alla forza pura nel microcanale che supera la forza aggregante causando la disaggregazione dei globuli rossi.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di garantire una buona qualità dell'immagine del flusso nel microcanale e garantire un contrasto tra i globuli rossi che scorrono e lo sfondo dell'immagine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare qualitativamente e quantitativamente gli aggregati di globuli rossi in condizioni di flusso controllato.