Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le vescicole extracellulari utilizzando una piattaforma cartacea. Ciò si ottiene laminando prima con due fogli di polistirene con cellulosa circolare, ritagli di carta allineati su una serie di fori passanti registrati. Il secondo passo consiste nel coniugare chimicamente le molecole che legherebbero le vescicole extracellulari alla zona di test della carta.

Successivamente, il campione biologico può essere pipettato direttamente sulla zona del test di carta e le vescicole extracellulari vengono isolate dopo la fase di risciacquo. Il passo finale consiste nel caratterizzare le vescicole extracellulari catturate utilizzando la microscopia elettronica, Eliza o l'analisi trascrittomica. In definitiva, è possibile purificare e concentrare sottogruppi di vescicole extracellulari provenienti da campioni di siero di soli 10 microlitri.

Quindi il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'ultra educazione è che è molto delicata da assemblare ed è semplice da eseguire. A dimostrare la procedura sarà uno studente laureato, lo farai. Partendo da due fogli di polistirolo, crea una serie di ritagli circolari.

Ciascuno presenta un diametro inferiore a cinque millimetri con un perforatore manuale o un plotter da taglio automatizzato cad. Inoltre, ritagliare una serie di cromatografia di cinque millimetri di diametro, dischi di carta con un perforatore. Posiziona un foglio di polistirolo sul banco e sovrapponi un singolo disco di carta sopra ogni foro passante corrispondente.

Sandwich i dischi di carta registrando e sovrapponendo il secondo foglio di polistirolo. Controllare l'allineamento generale prima di incollare il sandwich in una laminatrice termica. Successivamente, inizia le modifiche chimiche della superficie sui dischi di carta inserendo il dispositivo laminato in una camera al plasma.

Attivare brevemente la superficie della carta con il plasma di ossigeno al rilascio del vuoto della camera, trasferire immediatamente il dispositivo di carta nella soluzione di cylin e incubare per 30 minuti. Impostare la temperatura ambiente. Rimuovere le corsie di ghiaccio in eccesso risciacquando il dispositivo con cinque millilitri di etanolo a 200 gradi.

Quindi incubare il dispositivo con la soluzione linker A-G-M-B-S per 15 minuti. Impostare la temperatura ambiente. Rimuovere la molecola di linker in eccesso con abbondanti quantità di risciacqui con etanolo.

Quindi, incubare il dispositivo con avadon per un'ora a quattro gradi Celsius e rimuovere l'avadon non legato con un lavaggio PBS da cinque millilitri. Il dispositivo può quindi procedere alla fase di legame degli anticorpi o essere conservato a quattro gradi Celsius per quattro settimane, se necessario. Dopo l'attacco Aden, pipettare 10 microlitri di soluzione bloccante sulle regioni esposte del disco di carta e incubare la carta per 10 minuti.

A temperatura ambiente, ripetere l'aggiunta di 10 microlitri di soluzione bloccante e l'incubazione a temperatura ambiente di 10 minuti. Altre due volte per completare la biofunzionalizzazione del substrato di carta esposto, pipettare 10 microlitri di molecole di cattura biotinilate sui dischi e incubare per 10 minuti A temperatura ambiente per le vescicole extracellulari, le molecole di cattura di scelta possono essere anticorpi anti CD 63 o xin cinque. Ripetere il pipettaggio da 10 microlitri e i processi di incubazione di 10 minuti.

Altre due volte dopo l'attacco della molecola di cattura. Lavare via le frazioni in eccesso mediante pipettaggio. 10 microlitri del tampone di lavaggio appropriato su ogni disco di carta.

Incubare il lavaggio per un minuto a temperatura ambiente e ripetere le fasi di lavaggio da 10 microlitri e di incubazione di un minuto altre due volte. Il dispositivo di carta completamente funzionalizzato è ora pronto per isolare vescicole extracellulari dal siero o dall'umore acqueo per l'elaborazione del siero. Raccogliere 10 millilitri di sangue periferico in una provetta vacutainer e capovolgere delicatamente la provetta cinque volte.

Posizionare il tubo in posizione verticale e attendere 30 minuti. Impostare la temperatura ambiente, centrifugare il campione di sangue per 15 minuti. Impostare la temperatura ambiente.

Trasferire lo strato superiore di siero trasparente in una provetta di plastica pulita e scartare la fase semisolida inferiore. Chiarificare il siero a una velocità di centrifugazione più elevata per 30 minuti. Impostare la temperatura ambiente.

Trasferire il surnatante in una provetta nuova e rimuovere il particolato fine passando il surnatante attraverso un filtro da 0,8 micrometri. Il siero filtrato risultante può essere utilizzato immediatamente o conservato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Se le vescicole extracellulari devono essere estratte dall'umore, raccogliere l'umore acqueo dai pazienti direttamente attraverso procedure invasive e conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Fino all'uso, non sono necessarie fasi di filtrazione o chiarificazione per i campioni di umor vitreo. Per isolare le vescicole extracellulari dal siero o dall'umore acqueo, pipettare cinque microlitri del campione biologico su ciascun disco di substrato di carta bio-funzionalizzata. Incubare lo spot per un minuto a temperatura ambiente e ripetere i processi di pipettaggio da cinque microlitri e di incubazione di un minuto.

Altre due volte Dopo il legame di affinità, risciacquare le vescicole non legate pipettando prima 10 microlitri del tampone di lavaggio appropriato. Incubare il tampone per un minuto a temperatura ambiente e ripetere il lavaggio da 10 microlitri e la successiva incubazione. Passaggio altre due volte.

Le vescicole extracellulari catturate sono ora pronte per i successivi saggi a valle per fissare le vescicole catturate sulla pipetta di supporto di carta funzionalizzata 10 microlitri di fissativo karnofsky 0,5 x su ciascun disco di carta. Lasciare procedere la reazione di reticolazione a temperatura ambiente per 10 minuti e sciacquare tutti i dischi con abbondanti quantità di PBS per cinque minuti. Successivamente, disidratare i substrati di carta applicando i seguenti lavaggi in ordine.

Un'incubazione con etanolo al 35%, due incubazioni con etanolo al 50%, due incubazioni con etanolo al 70%, due incubazioni con etanolo al 95% e quattro incubazioni con etanolo al 100%. Per ogni singolo lavaggio, lasciare incubare la soluzione di etanolo sopra i dischi di carta a temperatura ambiente per 10 minuti. Quando il dispositivo di carta è a secco, rivestire i campioni con uno strato di 18 nanometri di oro palladio in uno sputtering metallico.

Inserire il campione in un microscopio elettronico a scansione ed eseguire la microscopia a cinque kilovolt per evitare una carica eccessiva del campione biologico per rilevare le vescicole catturate tramite saggi immunologici. Iniziare aggiungendo cinque microlitri di anticorpi primari anti CD nove su ciascun disco di carta e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Rimuovere tutti gli anticorpi non legati lavando il dispositivo di carta con 30 millilitri di PBS a temperatura ambiente tramite agitazione meccanica.

Quindi pipettare cinque microlitri di anticorpo secondario coniugato perossidasi di rafano su ciascun foglio. Disco e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Lavare il dispositivo con 30 millilitri di PBS tramite agitazione meccanica per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Infine, aggiungere cinque microlitri di colore e una miscela metrica di substrato su ogni carta.Disco. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 20-30 minuti e scansionare la variazione risultante nell'intensità del colore spot utilizzando uno scanner da tavolo. Per iniziare, isolare i singoli dischi di carta dal dispositivo di massa tagliando via le regioni di laminato di polistirene in eccesso usando le forbici o una lama di rasoio.

Mettere ogni disco di carta in una microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Due lisi le vescicole catturate aggiungendo 265 microlitri di tampone di lisi. E 35 microlitri di supporto per la rimozione dei polisaccaridi a base di PVP in ogni vortice vigoroso del tubo.

Per garantire la completa vescicola, la lisi e la rimozione delle molecole di RNA liberate, aggiungere 30 microlitri di soluzione di omogeneizzato al vortice di lisato per mescolare e incubare la provetta su ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, aggiungere 330 microlitri di miscela di cloroformio fenolico acido al lisato per garantire una corretta separazione fase specifica dell'RNA sia dalle proteine che dal vortice del DNA vigorosamente per almeno 15 secondi per provetta. Centrifugare la provetta alla massima velocità per cinque minuti.

A temperatura ambiente, trasferire l'RNA contenente la fase acquosa superiore in una provetta fresca da 1,5 millilitri e scartare la fase organica inferiore. Aggiungere 1,25 volumi acquosi di etanolo al 100% all'RNA e agitare brevemente per mescolare. Quindi applicare la miscela su una colonna di estrazione solida di RNA commerciale.

Centrifugare la provetta per 15 secondi a temperatura ambiente ed eliminare la frazione di flusso passante. Lavare la colonna aggiungendo 700 microlitri di soluzione di lavoro. Numero uno, centrifugare la provetta per cinque-10 secondi e scartare il flusso.

Successivamente, lavare la colonna con 500 microlitri di soluzione di lavoro. Numero due, centrifugare la provetta per cinque-10 secondi. Eliminare il flusso e ripetere il lavaggio ancora una volta.

Rimuovere l'etanolo residuo con un'ultima centrifuga di un minuto a temperatura ambiente e trasferire la colonna di estrazione essiccata in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Aggiungere 100 microlitri di acqua preriscaldata priva di R RNA. Centrifugare la provetta alla massima velocità per cinque-10 secondi e, se necessario, gettare la colonna di estrazione superiore.

Concentrare e purificare ulteriormente l'RNA EIT utilizzando un kit di pulizia dell'RNA commerciale che utilizza biotina marcata in fluorescenza. Come reporter per la mobilitazione di superficie. L'efficacia e la specificità del protocollo di funzionalizzazione della carta possono essere viste confrontando l'elevata fluorescenza subita sulla superficie modificata con reticolante rispetto alle superfici di carta non funzionalizzate.

Inoltre, quando la molecola reporter viene sostituita da un anticorpo biotinilato anti CD 63, il substrato di carta correttamente funzionalizzato faciliterà un tasso di cattura delle vescicole extracellulari più elevato rispetto a un substrato di carta di controllo negativo. Quando diverse molecole di cattura vengono immobilizzate su substrati di carta, diversi sottogruppi di vescicole extracellulari sembrano mostrare diverse distribuzioni dimensionali utilizzando il dispositivo di carta. Si può anche analizzare sia il contenuto di RNA intravescicale che l'abbondanza di proteine di superficie specifiche della vescicola.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare e soddisfare l'aumento delle cellule extracellulari utilizzando un dispositivo cartaceo.