Name: Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri come generare preparazioni geniche chimere del circuito ippocampo ventrale-accumbens per l'imaging in vivo. Questo metodo consente l'analisi dei meccanismi presinaptici e postsinaptici della trasmissione sinaptica.

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Ringraziamo Yehui Qin e Mallory Myers per il supporto tecnico. Ringraziamo anche il Dr. Sigismund Huck per averci fornito l'anticorpo anti-α4-ECD. Questo lavoro è supportato dal National Institutes of Health grant NS22061 a L. W. R.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (NIH Publications No. 80-23, riveduta 2012) e gli studi sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Uso delle commissioni di ricerca alla Stony Brook University (# 1618 e # 1792). 1. vHipp-NACC sinaptiche co-culture <ol><li> Topi Sacrifice (postnatale giorno 0-3, da wild-type (WT) o nAChR α7 linea di topo transgenico) con emissioni di CO 2. Decapitare ogni cucciolo e salvare la coda in una provetta da 1,5 ml centrifugare per post facto genotipizzazione. Effettuare le seguenti operazioni in una cappa sterile. </li><li> Togliere la parte superiore del cranio con le forbici e pinze per esporre tutto il cervello. Partendo dalla congiunzione dove le cortecce cerebrali parte una dall&#39;altra caudalmente, ottenere una sezione coronale che contiene le cortecce posteriori che includono la vHipp 5,21 sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Sezionare vStrisce di tessuto Hipp contenenti regione CA1-subiculum secondo un atlante sviluppo cerebrale del mouse 22 (Figura 1A). Trasferimento a un piatto di coltura 35 millimetri contenente terreni di coltura freddo (4 ° C), tagliato a fettine sottili (circa 100 micron × 100 micron microslices). </li><li> Pre-incubazione 12 millimetri poli-D-lisina / vetrini laminina rivestite all&#39;interno di 24 pozzetti di coltura tissutale con terreni di coltura (~ 500 microlitri) per almeno 30 minuti in incubatrice a 37 ° C. Rimuovere i supporti prima di placcatura microslices. </li><li> Piatto con una pipetta Pasteur lucidati a fuoco al centro del vetrino con minima quantità di supporti (~ 50 microlitri, contenente ~ 20 pezzi di microslices) per facilitare il fissaggio degli espianti. Piatto microslices vHipp provenienti da un singolo animale (sia il + / + o il - / - genotipo della linea α7 transgenica) su ogni vetrino. </li><li> Dopo gli espianti depositano sul vetrino, aggiungere delicatamente multimediale aggiuntivo (~ 100 ml) di the parete in modo che il livello dei media è sufficientemente alto per coprire completamente le espianti sulla periferia, ma non quelli al centro del vetrino. </li><li> Dopo un / N incubazione O a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, disperdere i neuroni NACC da giorni embrionali 18 di post-natale giorno 1 topi WT e aggiungere gli espianti. <ol><li> Sezionare tessuti NACC secondo un sviluppo atlante cervello di topo 20 (Figura 1B). </li><li> Tagliare a piccoli pezzi (circa 500 micron × 500 micron microslices) e trasferimento in una provetta da 15 ml. </li><li> Trattare con 0,25% tripsina (2 ml) per 15 min a 37 ° C. Lavare pezzi di tessuto tre volte con mezzi di lavaggio a freddo (5 ml, 4 ° C) seguito da un lavaggio in mezzi di coltura fredda (5 ml, 4 ° C). Lasciare riposare la sospensione per 5 minuti in ogni fase di lavaggio, e poi versare con cautela il surnatante. </li><li> Separa celle di dolce triturazione in 2 ml di coltura con un leggermente incendio lucidato pipetta Pasteur. </li><li> Transsospensione cellulare fer ad un&#39;altra provetta da 15 ml e centrifugare a 2.000 x rpm per 5 min. Rimuovere il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in coltura a 1 ml per 6 cuccioli. Disperdere le cellule pipettando delicatamente in mezzi più volte con un fuoco lucidato pipetta Pasteur. </li><li> Aggiungere 0,25 ml di cellule NACC dispersi ad ogni vetrino con espianti vHipp. </li><li> Mantenere le culture in un umidificata 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. Mettere piastre di coltura su inumidite garze sterili per stabilizzare meccanicamente e mantenere l&#39;umidità, favorendo la formazione di sinapsi. </li></ol></li></ol> 2. Immunocitochimica <ol><li> Fissare culture (5-7 giorni in vitro) nel 4% paraformaldeide / 4% di saccarosio / PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 20 min, RT). </li><li> Culture permeabilize con 0,25% Triton X-100 / PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 5 min, RT). </li><li> Culture di blocco con il 10% di siero asino normale in PBS (~ 500 microlitri per vetrino, 30 min, RT) prima gli anticorpiy colorazione. Incubare con anticorpi primari O / N a 4 ° C. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: nAChRs anti- (α 4 -ECD 1: 500; anti-α 5 subunità, 1: 500), anti-vescicolare trasportatore del glutammato 1 (1: 250), anti-GAD65 (1: 100). </li><li> Lavare anticorpi primari con PBS (3 volte / ~ 500 microlitri per vetrino, 5 min) e poi incubare culture anticorpi secondari coniugati Alexa 488 (~ 500 ml per vetrino, 1: 500) o Alexa 594 (~ 500 microlitri per coprioggetto , 1: 500) per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Incubare culture in αBgTx coniugati Alexa 594 (~ 500 ml per vetrino, 1: 1.000 in coltura) per 45 minuti a 37 ° C prima della fissazione per l&#39;etichettatura superficie α7 * nAChR. </li><li> Inserire e tenuta coprioggetto. </li><li> Catturare le immagini con un microscopio a fluorescenza dotato di obiettivi Plan-Apocromatici (20X con 0,8 NA o 63X olio con 1.4 NA) e una fotocamera CCD. </li></ol> 3. FM1-43 Based vescicolare Fusion <ol><li> Mantenere culture (5-7 giorni in vitro) in un camera di imaging, montare la camera su disco rotante microscopio confocale. Continuously profumato (1 ml / min) con HBS cocktail RT. </li><li> Smettere di culture di perfusione e di carico con 10 micron FM1-43 in 56 mm K + ACSF (~ 500 microlitri) per 90 secondi (colorazione), lavare tintura esterno via per 15 minuti con Ca2 + HBS gratuito contenente ADVASEP-7 (0,1 mm) per pulire FM1-43 legato alla membrana. </li><li> Stimolare le culture con 56 mm K + ACSF (~ 500 microlitri) senza FM1-43 per 120 sec (decolorazione), ricaricare le culture con FM1-43 utilizzando le stesse condizioni, e lavare di nuovo con Ca2 + HBS gratuito contenente ADVASEP-7 per 15 min. </li><li> Acquisire FM1-43 immagini a fluorescenza con disco rotante microscopio confocale equipaggiato con un obiettivo Plan-Apochromat (60X acqua con 1.4 NA, di eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e catturare immagini con una telecamera CCD. </li><li> Raccogliere immagini FM1-43 fluorescenza di base (ogni 2 s per 1 min) Il controllo pre-nicotina; applicare nicotina (1 mM) di perfusione rapida (2 ml / min) per 1 min, e poi lavare la nicotina con HBS cocktail. Tenere time-lapse immagini cattura prima, durante e dopo l&#39;applicazione di nicotina ogni 2 secondi per 5 min. </li><li> Quantificare FM1-43 intensità di fluorescenza prima (F colorazione) e dopo (F decolorante) applicazione nicotina ad ogni bouton sinaptica. </li><li> Calcola importo complessivo di rilasciabile fluorescenza FM1-43 lungo gli assoni vHipp quantificando la differenza di FM1-43 fluorescenza prima e dopo l&#39;applicazione della nicotina (Af = F colorazione -F decolorazione). Analizzare frazione della diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza dopo nicotina con la seguente equazione: diminuzione F% = Af / F colorazione. </li></ol> 4. Imaging di calcio <ol><li> Sciacquare culture (5-7 giorni in vitro) rapidamente con normale HBS, quindi caricare le culture con 5 Indicatore mM Fluo-4 Ca 2+ (AM estere) e 0,02% Pluronic F-127 in HBS (2 ml) per 30 min a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lavare Fluo-4 soluzione HBS (3 volte / 5 min). Culture Ritorno a incubatore (37 ° C / 5% di CO 2) per almeno 30 minuti. </li><li> Mantenere le culture nella stessa camera di imaging e stesse condizioni descritte nella sezione FM1-43 fusione vescicolare base (vedi punto 3.1). </li><li> Raccogliere le immagini Fluo-4 di fluorescenza di proiezioni assonale dai vHipp micro-fette con un obiettivo Plan-Apochromat (60X acqua con 1.4 NA, di eccitazione 488 nm, emissione 530 nm) e una fotocamera CCD. </li><li> Raccogliere basali Fluo-4 fluorescenza (ogni 10 sec per 2 min) il controllo pre-nicotina, applicare nicotina (1 micron) di perfusione rapido (2 ml / min) per 1 min, e poi lavare la nicotina con HBS cocktail. Tenere time-lapse immagini cattura prima, durante e dopo l&#39;applicazione di nicotina ogni 10 sec per 30 min. </li><li> Salvare tutti i fotogrammi dei fluo-4 fluorescenza prime, l&#39;esportazione come una serie diLe immagini in formato TIFF per ulteriori analisi. </li><li> Raccogliere l&#39;intensità integrata di fluo-4 fluorescenza lungo gli assoni vHipp prima e dopo l&#39;applicazione di nicotina. </li><li> Normalizzare intensità di fluorescenza integrato con la seguente equazione: Af / F 0 = (0 FF) / F 0, dove F 0 è il pre-nicotina intensità di fluorescenza integrato fondo corretto e F è l&#39;intensità di fluorescenza integrato lungo gli assoni vHipp ad ogni tempo dopo l&#39;applicazione di nicotina. Analizzare e tracciare normalizzato intensità di fluorescenza integrato. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La preparazione co-coltura descritto ri-capitola ventrale circuiti dell&#39;ippocampo-accumbens in vitro. Questo esame permette di preparazione relativamente semplice e affidabile dei profili spazio-temporali per cui l&#39;attivazione di nAChR pre-sinaptici suscitare esaltata trasmissione glutamatergica 5, 21. Co-colture sono definite come la crescita di diversi tipi cellulari specifici in un piatto che può fornire condizioni fisiologiche in vitro per dimostrare ...

Modulazione colinergica circuito eccitabilità contribuisce ad aspetti fondamentali della cognizione, e modulazione colinergici alterato è una caratteristica di malattie neurodegenerative e neuropsichiatrici tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la schizofrenia e la dipendenza 1-4. Un meccanismo stabilito di facilitazione colinergici della trasmissione sinaptica nel sistema nervoso centrale è attraverso l&#39;attivazione diretta di nAChR localizzati nei siti pre-sinaptici. L&#39;attivazione di questi recettori presinaptici porta ad un aumento intracellulare Ca 2+ ([Ca 2+] i) nei terminali presinaptici - sia direttamente, a causa della relativamente alta conduttanza di calcio di alcuni sottotipi di nAChR, e indirettamente, tramite intracellulari cascate di segnalazione 5, rafforzando in tal modo il rilascio di neurotrasmettitore. Infatti, l&#39;attivazione del nAChR pre-sinaptici è stato collegato con i cambiamenti nel rilascio di un&#39;ampia varietà di neurotrasmettitori compresi glutammato, GABA, ACh, unnd dopamina 6-10. Sebbene questo processo è stato studiato indirettamente utilizzando metodi elettrofisiologici a vari sinapsi, reporter ottiche di [Ca 2+] i e riciclo delle vescicole sinaptiche permettono misura più diretta e temporalmente precisa dei fenomeni pre-sinaptici. Localizzazione pre-sinaptica dei nAChR è stata dimostrata in modo convincente con etichettatura immuno-oro diretto della nAChR al microscopio elettronico (EM) il livello 11,12. Diverse altre tecniche sono state utilizzate anche per affrontare la localizzazione nAChR indirettamente, anche rilevando posizioni di nAChRs subunit- fluorescenti chimere proteine ​​in neuroni in coltura 13,14, registrazione elettrofisiologica delle correnti nAChR nei terminali sinaptici 15,16, il monitoraggio nicotina indotto cambiamenti in [Ca 2 +] i in terminazioni nervose sinaptiche di immagini dal vivo delle cellule 17, e monitoraggio indiretto del rilascio di neurotrasmettitore al terminale sinaptico datecniche di imaging cellulare dal vivo con indicatori fluorescenti, tra cui esocitosi delle vescicole sinaptiche visti da stirilici coloranti anfipatiche FM (FM1-43 e FM4-64) e / o Synapto-pHluorin e da specifici neurotrasmettitori reporter fluorescenti, come CNiFERs per ACh e iGluSnFr per il glutammato 18-20. Nel complesso, questi approcci attuali per identificare la localizzazione pre-sinaptica di nAChR sono complicate e richiedono sistemi e tecniche speciali per permettere l&#39;identificazione affidabile e monitoraggio fisiologico di attività pre-sinaptica. Qui si descrive protocolli e attrezzature per un sistema di co-coltura in vitro di un ippocampo ventrale (vHipp) - nucleus accumbens (NACC) circuito che fornisce accesso diretto a identificare e analizzare i due componenti pre e post-sinaptici della trasmissione sinaptica. Mostriamo esempi di localizzazione pre-sinaptica di nAChR e imaging cellulare dal vivo di nAChR mediata Ca 2+ di segnalazione e di rilascio dei neurotrasmettitori aloassoni ng vHipp. Una naturale estensione (e semplice) del protocollo presentato qui è la preparazione di contatti pre e post-sinaptiche composti da neuroni provenienti da diversi genotipi. In questo modo il contributo di un particolare prodotto genico al pre e / o meccanismi di post-sinaptici di modulazione può essere valutata direttamente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Terreni di coltura (50 ml)</td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10888022</td><td>48 ml</td></tr><tr><td>Integratori B-27</td><td>GIBCO</td><td>0080085-SA</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>10908-010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>GlutaMAX Integratore</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td colspan="4">2. mezzi di lavaggio (HBSS, 100 ml)</td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo.</td><td>GIBCO</td><td>14175-095</td><td>99 ml</td></tr><tr><td>HEPES ( 1M)</td><td>GIBCO</td><td>15630-130</td><td>1 ml</td></tr><tr><td colspan="4">3. Soluzione salina tamponata HEPES&nbsp; (HBS)&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">4. Cocktail HBS per imaging dal vivo pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>CaCl2,</td> <td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>tetrodotossina&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1078</td><td>2 &micro; M</td></tr><tr><td>bicucullina</td><td>Tocris</td><td>131</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>D-AP-5</td><td>Tocris</td><td>105</td><td>50 &micro; M</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>1045</td><td>20 &micro; M</td></tr><tr><td>LY341495</td><td>Tocris</td><td>1209</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td colspan="4">5. Senza calcio&nbsp; HBS&nbsp; &nbsp; pH=7.3</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888&nbsp;</td><td>135 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333&nbsp;</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td colspan="4">6. 56 mM Potassio ACSF pH=7.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>119 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>56 mM</td></tr><tr><td>MgSO4.7H</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td>1.3 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>2.5 mM</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>26.2 mM</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G0350500&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr></tbody></table>

immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione calcio e neurotrasmettitori uscita lungo ventrali hippocampal assoni

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Il miglioramento sostenuto della segnalazione assonale e l'aumento del rilascio di neurotrasmettitori attraverso l'attivazione dei recettori nicotinici pre-sinaptici dell'acetilcolina (nAChR) è un importante meccanismo per la neuromodulazione da parte dell'acetilcolina (ACh). La difficoltà di sondare i meccanismi di segnalazione all'interno degli assoni intatti e alle terminazioni nervose sia in vitro che in vivo ha limitato i progressi nello studio delle componenti presinaptiche della plasticità sinaptica. Qui introduciamo una preparazione gene-chimerica del circuito dell'ippocampo ventrale (vHipp)-accumbens (nAcc) in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare sia le componenti pre- che post-sinaptiche della trasmissione, variando selettivamente il profilo genetico dei neuroni pre- vs post-sinaptici. Dimostriamo che le proiezioni delle microfette di vHipp, come input assonale pre-sinaptico, formano sinapsi glutammatergiche multiple e affidabili con bersagli post-sinaptici, i neuroni dispersi dal nAcc. La localizzazione pre-sinaptica di vari sottotipi di nAChR viene rilevata e la trasmissione sinaptica mediata dal segnale nicotinico pre-sinaptico viene monitorata mediante registrazione elettrofisiologica concomitante e imaging di cellule vive. Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica glutammatergica in vitro.

La preparazione impiegato consiste gene chimerico co-colture di circuiti vHipp-NACC in vitro. Le proiezioni provenienti da microslices vHipp, come input assonale pre-sinaptica, possono prendere contatti sinaptici con obiettivi post-sinaptici, i neuroni dispersi da NACC. La nicotina ha indotto una sostenuta (≥ 30 min) la facilitazione della trasmissione glutammatergica dai neuroni NACC innervati dal vHipp assoni 21 e prolungata di calcio di segnalazione lungo gli assoni vHipp 5 via α7 pre-s...

Abbiamo sviluppato una preparazione gene-chimerica del circuito ventrale ippocampale – accumbens in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare i meccanismi presinaptici della trasmissione sinaptica mediata dai recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR). Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una preparazione chimera genica del circuito ippocampale ventrale-accumbens in vitro che consenta l'imaging diretto in tempo reale per identificare e analizzare sia i componenti presinaptici che postsinaptici della trasmissione sinaptica. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando strisce di tessuto ippocampale ventrale contenenti la regione CA1 CIC. Il secondo passaggio consiste nel tagliare le strisce di ippocampo ventrale in fettine sottili e piccole, quindi piastrarle al centro del coverslip all'interno della piastra per colture cellulari a 24 pozzetti per tutta la notte.Successivamente, dissezionare il nucleo accumbens dai tessuti cerebrali. L'ultimo passaggio consiste nel dissociare le strisce del nucleo accumbens in neuroni isolati mediante tripsina e aggiungere i neuroni del nucleo accumbens sulle cover slip precedentemente piastrate con innesti dell'ippocampo ventrale, quindi incubare per cinque o sette giorni. Infine, localizzazione presinaptica dei recettori nicotinici per l'acetilcolina e segnalazione del calcio mediata dai recettori nicotinici per l'acetilcolina nonché rilascio del neurotrasmettitore.Lungo gli assoni ippocampali ventrali possono essere identificati e monitorati mediante imaging confocale a disco rotante su cellule vive. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la preparazione di colture neuronali dissociate in microfette permette un facile riconoscimento dei loro esoni pre-sinaptici e delle strutture post-sinaptiche bersaglio. In vitro, la preparazione di co-coltura ricrea il circuito dall'ippocampo ventrale all'accumbens in vitro.Questo consente un'immagine diretta in tempo reale di entrambi i compartimenti, pre- e postsinaptico, o di uno soltanto. Questo preparato sinaptico in vitro permette di ottenere immagini ad alta risoluzione degli effetti spaziali e temporali dell'attivazione dei recettori presinaptici sulla trasmissione sinaptica glutammatergica. Di conseguenza, è possibile ottenere informazioni sui meccanismi sia presinaptici che postsinaptici che contribuiscono alla plasticità sinaptica glutammatergica prima del prelievo del tessuto.Preincubare almeno per 30 minuti a 37 gradi Celsius 500 microlitri di mezzo di coltura contenente coprioggetti circolari in vetro rivestiti con poli-D-lisina laminata, posizionati in piastre per colture cellulari a 24 pozzetti. Successivamente, rimuovere il mezzo prima di seminare le microfette per raccogliere il tessuto da coltivare. Rimuovere la parte superiore del cranio per esporre l'intero cervello di ciascun animale sacrificato al microscopio stereoscopico.Partendo dal punto di giunzione in cui le cortecce cerebrali si separano l'una dall'altra, cauley, ottenere una sezione coronale contenente le cortecce posteriori, inclusi i ventrali hippo.Campi. Successivamente, dissezionare i tessuti ippocampali ventrali contenenti le regioni del ca uno seum. Dopodiché, trasferire i tessuti in una piastra di coltura da 35 millimetri contenente mezzo di coltura freddo.Successivamente tagliare ulteriormente i tessuti in piccole fette sottili. Piastrare le fette al centro del coperchio utilizzando una pipetta Pasteur lucidata a fuoco. Aggiungere 50 microlitri di mezzo per facilitare l'adesione degli espianti x.Quindi piastrare le microfette ippocampali ventrali sul vetrino dopo che gli espianti X si sono depositati delicatamente sul vetrino aggiungere 100 microlitri di mezzo aggiuntivo lungo la parete in modo che il livello del mezzo sia sufficientemente alto da coprire completamente gli espianti alla periferia, ma non quelli al centro del vetrino. Successivamente, incubare gli espianti durante la notte in un’atmosfera di 5%CO2 a 37 gradi Celsius prima della dispersione dei neuroni del nucleo accumbens. Ora ottenere i tessuti del nucleo accumbens dal giorno embrionale 18 al primo giorno postnatale da topi di tipo selvatico, tagliarli in piccoli pezzi, quindi trasferirli in un tubo da 15 millilitri.Trattare i tessuti con due millilitri di tripsina allo 0,25% per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare i tessuti tre volte con cinque millilitri di mezzo di lavaggio a 4 gradi Celsius e lasciare riposare la sospensione per cinque minuti a ogni passaggio di lavaggio. Quindi lavare i tessuti con cinque millilitri di mezzo di coltura a 4 gradi Celsius.Successivamente, dissociare le cellule mediante agitazione delicata in due millilitri di mezzo di coltura utilizzando una pipetta Pasteur leggermente flamestirata. Dopo, trasferire la sospensione cellulare in un altro tubo da 15 millilitri e centrifugare a 2000 giri al minuto per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, rimuovere il soprannatante e risospendere le cellule nel mezzo di coltura a un millilitro per ogni sei cuccioli, quindi disperdere le cellule pipettando delicatamente il mezzo diverse volte con una pipetta Pasteur flamestirata.Alla fine, aggiungere 25 millilitri di cellule disperse del nucleo accumbens su ciascun coverslip contenente gli espianti dell'ippocampo ventrale. Posizionare le piastre colturali su tamponi sterili in garza umida per stabilizzare meccanicamente e mantenere l'umidità, favorendo così la formazione delle sinapsi. Successivamente, incubare le piastre a 5% di CO2 e a 37 gradi Celsius.In questa procedura, trasferire i colture in una camera di imaging una alla volta. Montare la camera sul microscopio confocale a disco rotante. Perfundere continuamente il campione con il cocktail HBS a un millilitro al minuto a temperatura ambiente.Successivamente, interrompere la perfusione e colorare la coltura con 10 micromolar FM 1 43 in 56 millimolar potassio A CSF per 90 secondi. Poi lavare via il colorante esterno per 15 minuti con HBS privo di calcio contenente 0,1 millimolar di A-D-V-A-S-E-P sette. Dopodiché, stimolare la coltura con 56 millimolar potassio A CSF senza FM 1 43 per 120 secondi.Per il trattenimento. Ricaricare la coltura con FM 1 43 nelle stesse condizioni e lavare nuovamente con HBS privo di calcio contenente A-D-V-A-S-E-P sette per 15 minuti. Acquisire ora le immagini fluorescenti di FM 1 43 mediante un microscopio confocale a disco rotante dotato di obiettivo planapocromatico e acquisire le immagini con una telecamera CCD.Acquisire le immagini fluorescenti di base con FM 1-43 ogni due secondi per un minuto come controllo pre-nicotina. Quindi applicare un micromolare di nicotina mediante perfusione rapida a due millilitri al minuto per un minuto, prima di rimuovere la nicotina con il cocktail HBS. Continuare ad acquisire le immagini a intervalli di tempo prima, durante e dopo l'applicazione della nicotina ogni due secondi per cinque minuti.In questo passaggio, risciacquare rapidamente le colture con HBS normale. Quindi caricare le colture con un indicatore del calcio fluo-4 a cinque micromolari e F127 allo 0,02% in due millilitri di HBS per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Successivamente, lavare via la soluzione di fluo-4 con HBS, tre volte, ogni lavaggio della durata di cinque minuti.Riportare le colture nell'incubatrice per almeno 30 minuti. Successivamente, trasferire le colture una alla volta nella camera di imaging. In condizioni identiche a quelle descritte nelle procedure di fusione vescicolare basate su FM 1-43.Raccogliere le immagini fluorescenti di base di proiezioni assoniche da fette microscopiche ventrali dell'ippocampo come controllo pre-nicotina. Successivamente, applicare un micromolare di nicotina mediante perfusione rapida a due millilitri al minuto per un minuto, quindi rimuovere la nicotina lavando con il cocktail HBS. Continuare a acquisire le immagini a intervalli di tempo prima, durante e dopo l'applicazione della nicotina ogni 10 secondi per 30 minuti.Questa figura dimostra direttamente che le proiezioni provenienti dalle microfette ventrali dell'ippocampo sono glutamatergiche e che i contatti avvengono con neuroni GABAergici dispersi. Nei neuroni a spina media del nucleo accumbens, sia recettori nicotinici per l'acetilcolina alfa sette che non alfa sette sono stati individuati lungo gli assoni ippocampali ventrali, in particolare nei siti in cui le proiezioni ippocampali ventrali contattano i neuroni del nucleo accumbens. Va notato che i neuroni dispersi del nucleo accumbens non esprimono recettori nicotinici per l'acetilcolina alfa sette, il che significa che gli aggregati recettoriali nei punti di contatto sono strettamente presinaptici.Le immagini in time-lapse della fluorescenza calcica di flu oh four lungo gli assoni ippocampali ventrali sono state acquisite con un obiettivo ad immersione in acqua da 60x ogni 10 secondi per 30 minuti mediante un microscopio confocale a disco rotante. Le immagini acquisite sono state rappresentate su una scala di pseudocolore e riprodotte come video a due fotogrammi al secondo. Questo video mostra un'attività sostenuta della fluorescenza calcica di flu oh four indotta dall'applicazione di nicotina lungo assoni ippocampali ventrali vitali di tipo selvatico.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di piastrare i microdischi ippocampali ventrali in un volume minimo di mezzo e mantenere le piastre di coltura su percorsi di crescita stereo umidi. Questi passaggi sono fondamentali per l'adesione dei microdischi, per l'espansione delle proiezioni e per la formazione delle sinapsi. Questa coltura in co-coltura consente quindi di variare separatamente i genotipi degli input presinaptici rispetto ai loro bersagli postsinaptici.Inoltre, consente l'espressione selettiva di geni esogeni in ciascun compartimento in modo indipendente. Questo approccio ha un notevole potenziale per analizzare i meccanismi pre e post-sinaptici della plasticità sinaptica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe comprendere come generare colture sinaptiche co-cultura chimeriche per geni che riproducono il circuito dal comparto ventrale dell'ippocampo al nucleo accumbens.Dovresti quindi essere in grado di utilizzare tecniche di imaging in tempo reale per analizzare sia i neuroni pre- che post-sinaptici.

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Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina cambiamenti all'interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

Questo video dimostra il processo di preparazione dei tessuti ventrali dell'ippocampo e del nucleo accumbens da cervelli di topo per la co-coltura. I neuroni estendono le proiezioni per formare connessioni sinaptiche tra i tessuti ventrali, ippocampali e nucleus accumbens. Questo metodo consente di studiare le interazioni neuronali tra queste due regioni del cervello, offrendo approfondimenti sulla cognizione, sul comportamento e sui disturbi neurologici.

Co-coltura dell'ippocampo ventrale e del nucleo accumbens

Questo video dimostra come l'attivazione mediata dalla nicotina dei recettori nicotinici dell'acetilcolina nell'ippocampo ventrale del topo si traduca in una segnalazione sostenuta del calcio lungo gli assoni.

Imaging della segnalazione del calcio indotta dalla nicotina lungo gli assoni dell'ippocampo ventrale in co-colture sinaptiche

Fonte: Bancroft, E. A., et al. Quantificare spontaneamente Ca2+ flussi e i loro effetti a valle nei neuroni primari del mesencefalo del topo. J. Vis. Exp. (2020) Questo video dimostra la visualizzazione in tempo reale dell'afflusso di calcio nei neuroni mesencefalici ventrali derivati da embrioni di topo. Utilizzando un vettore virale per esprimere un indicatore di calcio, i neuroni vengono ripresi al microscopio confocale per tracciare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza durante...

Visualizzazione dell'afflusso di calcio nei neuroni ventrali del mesencefalo derivati da embrioni di topo

&lt;p style='altezza-linea:1.38;margine-fondo:0pt;margine-superiore:0pt;' dir='ltr'&gt;Fonte: Lark, A. R., et. al., approccio di imaging cerebrale funzionale in vivo basato sull'indicatore di calcio bioluminescente GFP-aequorina. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'imaging in tempo reale della dinamica del calcio utilizzando la bioluminescenza fluorescente della proteina-equorina verde in Drosophila'sstrutture cerebrali profonde.

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Funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

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Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Qui presentiamo un protocollo con il quale il calcio pre e/o postsinaptico può essere visualizzato nel contesto dell'apprendimento e della memoria della Drosophila. L'imaging di calcio in vivo che utilizza sensori di calcio localizzati sinapricamente viene combinato con un classico paradigma di condizionamento olfattivo in modo tale che la plasticità sinaptica alla base di questo tipo di apprendimento associativo può essere determinata.

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L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

Questo articolo dimostra la preparazione di una finestra di imaging su misura integrata con cannula per infusione e il suo impianto sulla regione CA1 dell'ippocampo nei topi.

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Scopri come generare preparazioni geniche chimere del circuito ippocampo ventrale-accumbens per l'imaging in vivo. Questo metodo consente l'analisi dei meccanismi presinaptici e postsinaptici della trasmissione sinaptica.

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