In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare la dinamica delle microglia in un modello murino di glaucoma cronico mediante imaging confocale in vivo della retina. Questo viene ottenuto tramite ophthalmoscopia confocale mensile non invasiva, o CSLO, per visualizzare le microglia fluorescenti sulla retina e sulla testa del nervo ottico. L'analisi delle immagini in tempo reale, mediante segmentazione del soma cellulare basata su soglia e analisi morfologica, quantifica le variazioni nel numero di cellule microgliali e nel loro stato di attivazione.

I risultati mostrano che l'imaging mensile mediante CSLO in topi vivi può essere utilizzato per monitorare la cinetica della distribuzione della densità cellulare microgliale e dell'attivazione morfologica durante la fase iniziale della neurodegenerazione cronica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging confocale a due fotoni del cervello di topi con microglia positiva per GFP, è che l'imaging CSLO della retina consente l'osservazione diretta e il monitoraggio delle cellule microgliali durante tutta la progressione dei disturbi neurodegenerativi legati all'età nell'organismo integro. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo dopo aver dimostrato ex vivo che le microglia mostravano un'intensa attivazione e aggregazione nella regione centrale dei topi giovani DBA/2J a età precedenti alla neurodegenerazione rilevabile.

Per verificare se questi precoci cambiamenti immunitari innati, che precedevano il glaucoma rilevabile, avessero causato la sua neurodegenerazione, dovevamo stabilire un approccio in vivo per monitorare le variazioni dei microglia. A dimostrare la procedura per l'acquisizione di immagini in tempo reale sarà Caesar Romero, un tecnico del mio laboratorio. Per iniziare le operazioni, avviare il sistema CSLO e inserire le informazioni della sessione. Successivamente, prepararsi in sicurezza per l'imaging.

Montare un obiettivo pulito con campo ampio di 55 gradi. Posizionare un topo sulla piattaforma di imaging due minuti dopo l'amministrazione dell'anestetico e dilatare entrambe le pupille utilizzando colliri midriatici. Cinque minuti dopo, verificare che il topo sia anestetizzato.

Successivamente, utilizzando una pressione minima, coprire ciascun occhio con lenti a contatto. Orientare il topo in modo che l'occhio destro sia in corrispondenza della lente obiettiva e l'orbita sia parallela alla lente. L'animale non necessita di essere immobilizzato, ma deve essere mantenuto a una distanza costante dalla lente obiettiva.

Allineare l'occhio e, nei successivi 10-15 minuti, il topo non si muoverà né lampeggerà mentre i movimenti oculari verranno tracciati dal sistema di imaging in tempo reale CSLO. Avviare la sessione di imaging acquisendo una vista del fondo dell'occhio della retina interna. A tale scopo.

Selezionare la modalità a infrarossi, che corrisponde a una lunghezza d'onda di eccitazione di 820 nanometri. Successivamente, regolare la potenza del laser al 100% e la sensibilità tra il 40 e il 60%. Quindi, lavorando ad alta velocità, individuare l'occhio utilizzando il joystick per orientare l'oftalmoscopio e prepararsi a raccogliere una vista del fondo oculare del disco ottico e della vascolarizzazione retinica. Ispezionare la cornea e il cristallino per verificare la presenza di lesioni o opacità.

Escludere dallo studio occhi con difetti o lesioni che potrebbero influire sull'acquisizione delle immagini. Avvicinando ora l'obiettivo all'occhio, individuare l'area del disco ottico, ovvero la superficie della testa del nervo ottico o ONH. Successivamente, centrare l'immagine sull'ONH.

Posizionare correttamente il colletto ottico (ONH) è fondamentale per ottenere una messa a fuoco uniforme e una distribuzione regolare della luce nell'immagine. Il passo successivo consiste nel visualizzare i piani interni della retina insieme al colletto ottico. Come riferimento per il piano focale, utilizzare i vasi sanguigni principali situati sulla superficie vitreale della retina, corrispondenti a 59 e 60 diottrie, oppure anche più in profondità, a 55 diottrie nelle aree del disco ottico escavato.

Successivamente, regolare la saturazione dell'immagine utilizzando la manopola sul pannello touch finché un alone bianco di illuminazione non si estende sulla maggior parte del fondo oculare intorno al disco ottico. Quindi selezionare la saturazione più bassa che produca un alone uniforme, indicativo di un contrasto ottimale per quell'occhio. Potrebbe essere necessario riallineare la fotocamera se persistono aree scure.

Ora, acquisire un'immagine del fondo oculare ad alta risoluzione della retina centrale mediante l'acquisizione di 30 fotogrammi in tempo reale e la loro media per migliorare il rapporto segnale-rumore. Ciò corrisponde a 4,7 fotogrammi al secondo, normalizzati immediatamente e nella stessa posizione predisposta per acquisire un'immagine di fluorescenza delle cellule positive per GFP. Passare alla modalità di acquisizione in fluorescenza tramite il pannello touch screen, che seleziona il laser blu con eccitazione laser a 488 nanometri e un filtro passa-banda compreso tra 460 e 490 nanometri, e impostare l'acquisizione su potenza del laser al 100% e sensibilità tra il 100% e il 125%.

Ora acquisire una singola immagine fluorescente bidimensionale in un punto XY del colletto ottico (ONH), mediando 100 scansioni. Successivamente, catturare un'immagine multipunto della retina intorno al colletto ottico: selezionare la modalità composita nel pannello di controllo, quindi spostarsi con l'oftalmoscopio lungo l'asse naso-temporale. Il software media automaticamente le nuove aree scansionate e le unisce in tempo reale.

Se la qualità dell'immagine delle aree della retina non è sufficiente per consentire la mediazione, il cerchio verde che identifica un'area in fase di scansione diventerà rosso. L'immagine composita risultante copre un'area fino a 1,7 per quattro millimetri. È necessario prestare attenzione durante l'acquisizione dell'immagine composita.

Le immagini ad alta risoluzione possono andare perdute se si sposta troppo velocemente l'obiettivo prima del completamento della media delle scansioni e dell'assemblaggio dell'immagine. Quando l'anestesia comincia a svanire, la sessione di imaging deve terminare perché il topo inizia a respirare pesantemente e l'imaging diventa impraticabile. Iniziare allineando in sequenza le immagini del fondo oculare per una serie temporale, utilizzando la vascolarizzazione e il disco ottico come punti di riferimento.

Utilizzando un software convenzionale di elaborazione delle immagini, allineare tutte le immagini finché gli O hs non si sovrappongono. L'immagine superiore sarà semitrasparente durante lo spostamento. Ruotare quindi ogni immagine nella sequenza finché i suoi vasi sanguigni principali non si sovrappongono alla vascolarizzazione dell'immagine precedente e salvare l'organizzazione per riferimento futuro.

Registrare l'angolo corretto per ogni immagine e applicarlo alla corrispondente immagine di fluorescenza con singolo punto XY. Ora è possibile identificare singole cellule microgliali positive per GFP localizzate nella retina centrale aprendo i file TIFF allineati in Fluor render. Per visualizzare tutte le cellule, riempire lo schermo con l'immagine e definire la vista di rendering come composita, ortogonale e interpolata.

Quindi definire le proprietà: gamma 0,58, punto di saturazione 255, luminanza 195, alfa a 1,00 di ombreggiatura. Completare le selezioni scegliendo entrambi i canali RG come visibili. Nascondere il canale B facendo doppio clic su di esso nel riquadro dell'area di lavoro per segmentare le singole cellule.

Selezionare e sogliare il canale rosso aumentando la soglia inferiore fino a quando la maggior parte delle cellule è mascherata con un minimo di sovrapposizione, escludendo nel contempo i prolungamenti cellulari, mantenendo costante la soglia superiore. Infine, salvare il file con le cellule mascherate utilizzando il comando di acquisizione. Aprire l'immagine con le cellule mascherate nell'editor grafico raster.

Inverti la scala di grigi per l'osservazione diretta e regola la risoluzione a 300 DPI o superiore. L'immagine RGB viene salvata come file TIF. Il passaggio successivo dell'analisi dell'immagine in tempo reale riguarda la microglia, quindi la segmentazione e la morfologia per identificare SATA finalizzata alla quantificazione dell'area.

Utilizzare un software in grado di effettuare misurazioni dell'intensità e conteggi degli oggetti in base alla soglia. Aprire il file TIFF con le cellule segmentate e selezionare la ridimensionamento spline per una risoluzione massima e il canale rosso in bianco e nero per una migliore visualizzazione. Successivamente, calibrare l'immagine definendo il suo diametro orizzontale compreso tra 1,4 e 1,7 millimetri, a seconda dell'età, al fine di segmentare le singole cellule.

Quindi MA, applicare la sogliatura di intensità sul canale rosso. Aprire la funzione di sogliatura dell'intensità nel comando di aggiornamento del conteggio degli oggetti. Utilizzare questa funzione per tracciare i parametri bidimensionali per ogni soglia della regione di interesse rappresentante il singolo individuo.

Quindi, definire la soglia di intensità nell'istogramma di intensità. Selezionare il 50-60% più basso dei 255 livelli e affinare il valore finale della soglia per le singole cellule. Valutare visivamente l'overlap tra la maschera di colore di soglia in blu e il perimetro del soma cellulare in grigio, utilizzando i controlli della barra degli strumenti binaria o il catalogo degli oggetti.

Identificare manualmente le regioni di interesse somatiche contenenti più cellule. Separare questi elementi isolando le regioni di interesse. Durante questa operazione, utilizzare l'interruttore per visualizzare direttamente le cellule mediante la restrizione dell'area.

Classificare le cellule microgliali come attivate se le loro aree somatiche sono superiori a 50-60 micrometri quadrati. Classificare la microglia come disattivata se presenta somata più piccoli.

Infine, verificare il processo e valutare la complessità delle ramificazioni in ogni cellula microgliale attivata sovrapponendo la maschera somatica all'immagine del singolo punto XY con il contrasto aumentato del 50%. Il protocollo descritto è stato utilizzato per visualizzare le cellule microgliali in un'ampia area della retina centrale. In topi giovani DBA/2J eterozigoti che esprimono CX3CR1-GFP, l'elevata risoluzione cellulare combinata con l'immagine in diretta, la sogliatura e l'analisi morfometrica hanno permesso la segmentazione automatica delle singole cellule positive al GFP, consentendo così la discriminazione delle cellule in base all'area. Il modello di topi DBA/2J sviluppa un glaucoma cronico ed è stato sottoposto a imaging mensile per monitorare l'insorgenza di microgliosi locale e l'attivazione della microglia in età precedenti alla neurodegenerazione rilevabile, coerentemente con la progressione variabile della neurodegenerazione nei singoli occhi. Questa analisi ha rivelato modifiche nell'attivazione della microglia retinica e nella microgliosi nel tempo.

L'analisi ha inoltre rilevato cambiamenti dinamici nella densità di microglia totale e attivata all'interno delle singole retine. La densità della popolazione di microglia non era correlata alle variazioni della densità di cellule esprimenti GFP, in accordo con altri risultati. Pertanto, l'analisi mediante CSLO potrebbe essere utilizzata come indicatore di una precoce progressione della malattia.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare con attenzione i livelli di saturazione dell'immagine fluorescente di GFP più microglia, localizzata nella retina interna; infatti, la riproducibilità delle immagini CSLO della retina centrale, così come il dettaglio cellulare costante rilevato attraverso la retina centrale, dipende criticamente da questo passaggio dopo il suo sviluppo. Questo protocollo di imaging in tempo reale viene applicato nel nostro laboratorio per esaminare attentamente il potenziale legame tra le alterazioni precoci della microglia nella retina e nel nervo ottico e la successiva progressione del glaucoma nei modelli DBA/2J e in altri modelli di degenerazione retinica cronica. Questa strategia di imaging in tempo reale potrebbe inoltre consentire la diagnosi precoce di altre patologie croniche che interessano la retina e il nervo ottico causandone la degenerazione, come la sclerosi multipla, la malattia di Alzheimer e la malattia di Parkinson.