In Vivo Dynamics of Retinal microglia attivazione durante neurodegenerazione: confocale oftalmoscopico Imaging e Morfometria cellulare in mouse Glaucoma

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di caratterizzare la dinamica microgliale in un modello murino di glaucoma cronico mediante imaging confocale in vivo della retina. Ciò si ottiene mediante oftalmoscopia confocale mensile non invasiva o CSLO per visualizzare la microglia fluorescente sulla retina e sulla testa del nervo ottico. L'analisi delle immagini dal vivo utilizzando la segmentazione SOMA cellulare basata su soglia e il morfo quantifica i cambiamenti nel numero e nell'attivazione delle cellule microgliali.

I risultati mostrano che l'imaging CSLO mensile in topi vivi può essere utilizzato per monitorare la cinetica della distribuzione della densità cellulare microgliale e l'attivazione morfologica durante la progressione precoce della neurodegenerazione cronica. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging confocale a due fotoni del cervello di topo microglia GFP positivo è che l'imaging CSLO della retina consente l'osservazione diretta e il monitoraggio delle cellule microgliali durante la progressione dei disturbi neurodegenerativi dell'invecchiamento nell'organismo intatto. Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta dopo che abbiamo dimostrato exvivo, che la microglia mostrava un'intensa attivazione e raggruppamento nella prontezza centrale dei giovani topi DBA attraverso J ad età che precedevano la neurodegenerazione rilevabile.

Per chiederci se questi primi cambiamenti immunitari innati che hanno preceduto il glaucoma rilevabile abbiano causato la sua neurodegenerazione, abbiamo dovuto stabilire un approccio in vivo per tracciare i cambiamenti microgliali. A dimostrare la procedura per l'acquisizione di immagini dal vivo sarà Caesar Romero, un tecnico del mio laboratorio Per iniziare le operazioni, avviare il sistema CSLO e inserire le informazioni sulla sessione. Quindi, preparati per l'imaging in modo sicuro.

Montare un obiettivo pulito a campo largo da 55 gradi. Posiziona il mouse sulla piattaforma di imaging due minuti dopo aver somministrato l'anestetico e dilata entrambe le pupille usando le mie gocce tatiche. Cinque minuti dopo, confermare che il topo è anestetizzato.

Successivamente, con una pressione minima, coprire ogni occhio con lenti a contatto. Orientare il mouse in modo che l'occhio destro incontri la lente dell'obiettivo e l'orbita sia parallela alla lente. L'animale non ha bisogno di essere trattenuto ma mantenuto a una distanza costante dalla lente dell'obiettivo.

Con l'occhio allineato con esso per i successivi 10-15 minuti, il mouse non si muoverà né sbatterà le palpebre mentre i suoi movimenti oculari vengono tracciati dal sistema di imaging dal vivo CSLO. Inizia la sessione di imaging raccogliendo una vista del fondo oculare della retina interna. Per questo.

Selezionare la modalità a infrarossi, che corrisponde a una lunghezza d'onda di eccitazione di 820 nanometri. Quindi regolare la potenza del laser al 100% e la sensibilità tra il 40 e il 60% Successivamente, lavorando ad alta velocità, localizzare l'occhio utilizzando il joystick per orientare l'oftalmoscopio e prepararsi a raccogliere una vista del fondo oculare del disco ottico e della vascolarizzazione retinica. Ispezionare la cornea e il cristallino per verificare la presenza di lesioni o opacità.

Escludere dallo studio gli occhi con difetti o lesioni che possono influire sull'acquisizione dell'immagine. Ora, avvicinando l'obiettivo all'occhio, individua l'area del disco ottico, che è la superficie della testa del nervo ottico o ONH. Quindi centrare l'immagine sull'ONH.

Il corretto posizionamento dell'ONH è fondamentale per ottenere una messa a fuoco e una missione uniformi in tutta l'immagine. Il passo successivo è visualizzare i piani interni della retina e l'ONH. Per un piano focale di riferimento, utilizzare i principali vasi sanguigni situati sulla superficie vitreale della retina, che corrisponde a 59 e 60 diottrie, o anche più in profondità a 55 diottrie nelle aree scavate del disco ottico.

Quindi, regolare la saturazione dell'immagine utilizzando la manopola sul pannello a sfioramento fino a quando un alone bianco di illuminazione copre la maggior parte del fondo oculare attorno al disco ottico. Quindi seleziona la saturazione più bassa che rende un alone uniforme indicativo di un contrasto ottimale per quell'occhio. Potrebbe essere necessario riallineare la fotocamera se persistono aree scure.

Ora, raccogli un'immagine del fondo oculare ad alta risoluzione della retina centrale con una media di 30 fotogrammi acquisiti in tempo reale per migliorare il rapporto segnale/rumore. Ciò corrisponde a 4,7 fotogrammi al secondo, normalizzati immediatamente e nella stessa posizione preparata per raccogliere un'immagine a fluorescenza delle cellule GFP positive. Passa alla modalità di imaging a fluorescenza nel pannello touchscreen, che seleziona il laser blu con eccitazione laser a 488 nanometri e un set di filtri a barriera da 460 a 490 nanometri e imposta l'acquisizione al 100% di potenza laser e al 100-125% di sensibilità.

Ora raccogli un'immagine a fluorescenza bidimensionale a singolo punto XY dell'ONH con una media di 100 scansioni. Quindi, acquisisci un'immagine multipunto della retina attorno al composito di selezione ONH nel pannello di controllo, quindi fai una panoramica con l'oftalmoscopio lungo l'asse temporale nasale. Il software calcola automaticamente la media delle aree appena scansionate e le unisce in tempo reale.

Se la qualità dell'immagine delle aree della retina è insufficiente per consentire la media, il cerchio verde che identifica un'area da scansionare diventerà rosso. L'immagine composita risultante copre un'area fino a 1,7 per quattro millimetri. Prestare attenzione durante l'acquisizione dell'immagine composita.

Le immagini ad alta risoluzione possono andare perse spostando l'obiettivo troppo rapidamente prima del completamento della media di scansione e dello stitching delle immagini. Quando l'anestesia inizia a svanire, la sessione di imaging deve terminare perché il topo inizia a respirare pesantemente e l'imaging diventa impraticabile. Inizia con l'allineamento sequenziale delle immagini del fondo oculare per una serie temporale utilizzando il sistema vascolare e il disco ottico come punti di riferimento.

Utilizzando un software di editing di immagini convenzionale, allinea tutte le immagini fino a quando il loro O hs non si sovrappone. L'immagine superiore sarà semitrasparente durante il trascinamento. Quindi ruotare ogni immagine nella sequenza fino a quando i suoi principali vasi sanguigni non si sovrappongono al sistema vascolare dell'immagine precedente e salvare la disposizione per riferimento futuro.

Registrare l'angolo corretto per ogni immagine e applicarlo all'immagine di fluorescenza a singolo punto XY corrispondente. Ora è possibile identificare le singole cellule microgliali GFP positive localizzate nella retina centrale aprendo i file TIFF allineati in Fluor render. Per visualizzare tutte le celle, riempire lo schermo con l'immagine e definire la vista di rendering composita ortogonale e interpolata.

Quindi definisci le proprietà: 0,58, gamma 255, punto di saturazione, 255, luminanza, 195 alfa a 1,00, ombreggiatura. Termina le selezioni scegliendo entrambi i canali RG come visibili. Nascondi il canale B facendo doppio clic su di esso nel riquadro dell'area di lavoro per segmentare le singole celle.

Selezionare e somigliare il canale rosso aumentando la soglia bassa fino a quando la maggior parte delle celle non viene mascherata con una sovrapposizione minima ed escludendo i processi cellulari mantenendo costante la soglia alta. Infine, salva il file con le celle mascherate utilizzando il comando di acquisizione. Apri l'immagine con le celle mascherate nell'editor grafico raster.

Invertire la scala di grigi per l'osservazione diretta e regolare la risoluzione a 300 DPI o più. L'immagine RGB viene salvata come file TIF. Il passo successivo dell'analisi delle immagini dal vivo è la microglia, quindi la segmentazione e il morfo per identificare SATA per la quantificazione dell'area.

Utilizza software in grado di misurare l'intensità e contare gli oggetti in base alla soglia. Apri il file TIFF con le celle segmentate e seleziona il ridimensionamento della spline per la massima risoluzione e il canale rosso in bianco e nero per una migliore visualizzazione. Quindi, calibra l'immagine definendo il suo diametro orizzontale da 1,4 a 1,7 millimetri a seconda dell'età per segmentare le singole cellule.

Quindi, MA, applica la soglia di intensità sul canale rosso. Aprire la funzione di intensità della soglia nel comando di conteggio oggetti e aggiornamento account. Utilizzare questa funzione per tenere traccia dei parametri bidimensionali per ogni soglia di regione di interesse che rappresenta l'individuo.

Quindi, quindi, definisci la soglia di intensità nell'istogramma dell'intensità. Selezionare il 50-60% più basso dei 255 livelli e perfezionare il valore di soglia finale delle singole celle. Valuta visivamente la sovrapposizione tra la maschera del colore di soglia in blu e il perimetro del soma della cella in grigio utilizzando i controlli della barra degli strumenti binari o il catalogo oggetti.

Identificare manualmente le regioni somiali di interesse con più cellule. Separare questi elementi separando le regioni di interesse. Durante questa operazione, utilizzare l'interruttore per visualizzare direttamente le celle utilizzando la restrizione dell'area.

Classificare le cellule microgliali come attivate. Se le loro aree somata sono più grandi di 50-60 micron quadrati. Classificare le microglia come disattivate se hanno somata più piccole.

Infine, verificare il processo e controllare la complessità delle ramificazioni in ciascuna cellula microgliale attivata sovrapponendo la maschera somica e l'immagine del singolo punto XY con il contrasto aumentato del 50%Il protocollo descritto è stato utilizzato per visualizzare le cellule microgliali su un'ampia area della retina centrale. Nei topi giovani DBA due J eterozigoti che esprimono CX tre C uno GFP, l'elevata risoluzione cellulare combinata con l'immagine dal vivo, la soglia e l'analisi morfometrica hanno permesso la segmentazione automatica delle singole cellule GFP positive, e quindi le cellule sono state discriminate in base all'area DBA due topi J modello di glaucoma cronico e sono state sottoposte a imaging mensile per monitorare lo sviluppo della microgliosi locale e l'attivazione della microglia all'età in cui procede la neurodegenerazione rilevabile coerente con la variabile progressione della neurodegenerazione negli occhi individuali. Questa analisi ha rivelato cambiamenti nell'attivazione della microglia retinica e nella microgliosi con il tempo.

L'analisi ha anche rilevato cambiamenti dinamici nella densità delle microglia totali e attivate all'interno delle singole retine. La densità della popolazione di microglia non è stata accoppiata a cambiamenti nella densità cellulare che esprime GFP coerenti con altri risultati. Pertanto, l'analisi CSLO potrebbe essere utilizzata come indicatore della progressione precoce della malattia.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ottimizzare attentamente i livelli di saturazione dell'immagine fluorescente di GFP più microglia, localizzata la retina interna, la riproducibilità delle immagini CSLO della retina centrale, nonché il dettaglio cellulare coerente rilevato in tutta la retina centrale dipende in modo critico da questo passaggio dopo il suo sviluppo. Questo protocollo di imaging dal vivo viene applicato nel nostro laboratorio, per sedare veramente il potenziale legame tra i cambiamenti precoci nella microglia della testa del neure ottico e la successiva progressione del glaucoma nella DBA alla JM e in altri modelli di degenerazione retinica cronica. Questa strategia di imaging dal vivo può anche consentire la diagnosi precoce di altre patologie croniche che colpiscono anche la retina e il nervo ottico per la degenerazione come la sclerosi multipla, il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson.