Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule staminali neurali dalla regione paraventricolare del ratto adulto o del midollo spinale umano. Ciò si ottiene prelevando prima il midollo spinale tramite laminectomia. Il secondo passo consiste nel tagliare il midollo spinale trasversalmente in segmenti di un centimetro e sezionare la regione paraventricolare da ciascun segmento del midollo spinale.

Successivamente, il tessuto tritato viene tagliato in pezzi di un millimetro e quindi dissociato enzimaticamente. Il passaggio finale consiste nel separare le cellule intatte mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo e placcare la sospensione cellulare. In definitiva, la formazione delle neurosfere e la crescita delle cellule staminali neuro possono essere valutate utilizzando la microscopia a immunofluorescenza.

Oggi dimostrerò come isolare le cellule staminali neurali dalla regione paraventricolare del midollo spinale del ratto adulto. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali neurali, come ad esempio quali fattori esogeni promuovono la restrizione del lignaggio o come queste cellule rispondono a vari stimoli o stress. Per iniziare, preparare i tamponi di coltura, terreno e dissezione come descritto nel protocollo di testo allegato.

Successivamente, dopo un sovradosaggio di anestetico, sterilizzare la pelle del ratto e utilizzare grandi forbici da dissezione per rimuovere la superficie dorsale, esponendo la colonna vertebrale. Tenere le forbici di dissezione perpendicolari alla superficie dorsale e trasversalmente. Taglia la colonna vertebrale sopra gli arti posteriori.

Quindi utilizzare forbici più piccole per tagliare longitudinalmente il muscolo dorsale sovrastante la colonna vertebrale in direzione rostrale per esporre i processi spinosi a partire dall'estremità della coccola esposta. Inserire extraoralmente un piccolo strumento per il taglio dell'osso smussato nella parte laterale del canale spinale nello spazio tra il midollo spinale e la colonna vertebrale. Posizionare la lama poco profonda e parallela al cavo.

Quindi fai dei piccoli tagli nella lamina e stacca con cura la lamina per esporre il midollo spinale. Questo angolo previene danni al midollo spinale sottostante. Continuare a rimuovere la lamina in direzione rostrale.

Per esporre il midollo spinale toracico e cervicale utilizzando una pinza per tessuto smussato, sollevare delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale e recidere le radici con micro forbici Per rilasciare il cordone, posizionare il midollo spinale asportato in una capsula di Petri contenente un tampone di dissezione per ratti sterile ghiacciato. Sciacquare il fazzoletto con il tampone da dissezione ghiacciato e tagliare trasversalmente il midollo spinale in segmenti di un centimetro con le forbici. Per ogni segmento di tessuto, usa una pinza sottile per tenere il tessuto con una mano e con l'altra mano usa le micro forbici per rimuovere con cura la sostanza bianca insieme alla maggior parte della materia grigia, lasciando solo la regione periventricolare del midollo spinale.

Estrarre il tessuto periventricolare sezionato in una capsula di Petri sterile da 10 centimetri contenente un tampone di dissezione per ratti ghiacciato. Per iniziare l'isolamento delle cellule staminali neurali di ratto, utilizzare le micro forbici per tritare il tessuto ventricolare sezionato in pezzi di un millimetro cubo. Successivamente, preparare il tampone di dissociazione enzimatica aggiungendo prima cinque millilitri di soluzione salina bilanciata di Earl a una fiala di papaina da un kit di dissociazione della papaina.

Posizionare la fiala a 37 gradi Celsius per 10 minuti in modo che la papaina sia completamente sciolta e la soluzione appaia limpida. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione salina bilanciata di Earl alla fiala di DNA del kit di dissociazione. E mescolare delicatamente, aggiungere 250 microlitri della soluzione di DNA alla fiala contenente papaina e mescolare delicatamente.

Quindi, aggiungere il fazzoletto tritato di circa 0,2 grammi nella fiala e posizionare la fiala su una piattaforma a bilanciere a 37 gradi Celsius per 45 minuti a un'ora. Dopo l'incubazione, tri tassiare la miscela con una pipetta da 10 millilitri per dissociare eventuali pezzi di tessuto rimanenti e ottenere una sospensione cellulare torbida. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile da 15 millilitri e centrifugare a 300 Gs per cinque minuti.

A temperatura ambiente durante la centrifugazione, preparare la soluzione di OVO moid mescolando 2,7 millilitri di soluzione salina di Earl's balance con 300 microlitri di albumina ricostituita Soluzione di inibitore di OVO MOID. In una provetta conica da 15 millilitri, aggiungere 150 microlitri della soluzione di DNA precedentemente preparata alla soluzione ovale di moide e mescolare capovolgendo la provetta, scartare il surnatante dalle cellule pellettate e sospendere immediatamente il pellet cellulare nella miscela di inibitori dell'albumina di DNA diluita. Successivamente, preparare un gradiente di densità discontinuo aggiungendo cinque millilitri di soluzione di inibitore dell'albumina a una provetta da 15 millilitri e utilizzando una pipetta da cinque millilitri sovrapporre delicatamente e lentamente la sospensione cellulare sopra la soluzione di inibitore dell'albumina.

Centrifugare il campione a 70 gs per sei minuti a temperatura ambiente. Una volta terminato, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno EFH di ratto preriscaldato che viene preparato come descritto nel protocollo di testo allegato. Contare la densità delle cellule vive con un emocitometro e immergere le cellule in un pallone di coltura T 25 a una densità di 10 cellule per microlitro in EFH.

Incubare i palloni a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% e lasciare che le colture crescano indisturbate per una settimana per evitare l'aggregazione di sfere. Qui è mostrata una sezione trasversale del midollo spinale di ratto che è stata colorata con luxal fast blue, così come ematina ed eoin per mostrare i confini della materia bianca e grigia. Il contorno tratteggiato designa il tessuto periventricolare rimanente sezionato che è stato isolato in questo protocollo da questa regione.

Neurosfere, come quelle mostrate qui, cresceranno fluttuando liberamente in coltura in sospensione ad alto ingrandimento. Si possono vedere micro punte che sporgono dalle neurosfere, le neurosfere proliferano, come mostrato dalla colorazione positiva KI 67 in cui le neurosfere sono state dissociate e piastrate su pozzetti rivestiti di matrigel. Inoltre, esprimeranno principalmente il nido in cui è un marcatore per le cellule precursori neurali.

Seguendo questa procedura, i fattori esogeni possono essere aggiunti alle cellule in coltura per promuovere la differenziazione. Le cellule staminali neurali adulte o la loro progenie possono anche essere trapiantate in vari modelli animali per valutare la loro capacità di riparazione rigenerativa. Spero che questo video ti sia utile e buona fortuna con i tuoi esperimenti.