Name: Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Impara l'isolamento di cellule staminali neurali dalla regione periventricolare del midollo spinale di ratto adulto e umano. Questo metodo consente la formazione di neurosfere per studi di neuroscienza e medicina rigenerativa.

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Gli autori desiderano ringraziare il supporto di Spinal Cord Injury Ontario, Ontario-China Research and Innovation Fund, Toronto General and Western Hospital Foundation e Physicians' Services Incorporated Foundation. Gli autori ringraziano la dottoressa Tasneem Zahir per la consulenza esperta nella coltura NSPC del midollo spinale umano e le dottoresse Cindi Morshead e Iris Kulbatski per la loro consulenza esperta nell'isolamento NSPC del midollo spinale di ratto.

Tutte le procedure di animali sono approvati dal Comitato cura degli animali della University Health Network, Toronto ON Canada, in conformità con le politiche stabilite nella Guida per la cura e l&#39;uso degli animali sperimentali predisposti dal Consiglio canadese cura degli animali. Per la raccolta di tessuto del midollo spinale umano, l&#39;approvazione è stata ottenuta dal Research Ethics Consiglio University Health Network e dal Trillium Gift of-Life Foundation che sovrintende la donazione di organi in Ontario, Canada. 1. Preparazione di dissezione buffer e cultura dei media <ol><li> Per l&#39;isolamento di topo midollo spinale, la preparazione di 100 ml di buffer dissezione (1x PBS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero. Per midollo spinale umano preparare 100 ml di tampone di dissezione (1x HBSS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) e conservare in frigorifero. </li><li> Preparare 100 ml di mezzo privo di siero (SFM) e calda a 37 ° C. Per preparare SFM, aggiungere 2 mM L-glutammina, 100 mg / ml di penicillina-streptomicina, 2% B27, e il 10% della miscela ormone Neurobasal-A medio. Per preparare mix ormonale, fare un 1: medio / F12 1 DMEM contenente 0,6% di glucosio, 3 NaHCO mm 3, 5 mM HEPES, 25 mg / ml di insulina, 100 mg / ml apo-transferrina, 10 micron putrescina, 30 nm selenio, e 20 nM progesterone. </li><li> Preparare la crescita EFH fattore arricchita di placcatura dei media (a SFM aggiungere 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, e 2 mg / ml di eparina) e calda a 37 ° C. Assicurarsi che EFH umano contiene fattori di crescita ricombinante umano (vedi Tabella dei Materiali). </li></ol> 2. La raccolta e la dissezione di Adult Rat periventricolare midollo spinale Tissue <ol><li> Sterilizzare strumenti sezionare in etanolo e risciacquare in soluzione fisiologica sterile, o strumenti autoclave in anticipo. Dare rat (6-8 settimane) una iniezione letale di pentobarbital di sodio (1 cc a 65 mg / ml) o overdose di anestetico (vale a dire, il 4% isofluorane) secondo una dell&#39;ente approvato protocollo animale. Douse parte posteriore del ratto con 70% etanolo e rimuovere la pelle sulla superficie dorsale con grandi forbici dissezione. </li><li> Tenendo le forbici perpendicolari alla superficie dorsale, trasversalmente tagliare la colonna vertebrale sopra arti posteriori. Usare le forbici piccole per longitudinalmente tagliare il muscolo dorsale sovrastante la colonna vertebrale in una direzione rostrale per esporre i processi spinosi. </li><li> A partire dalla fine caudale esposta, inserire rongeurs o un piccolo strumento osso-taglio smussato extradurally nella parte laterale del canale spinale nello spazio tra il midollo spinale e la colonna vertebrale. Fare piccoli tagli nella lamina (archi ossee a destra ea sinistra delle apofisi spinose su ogni lato delle vertebre) e con attenzione staccarsi la lamina per esporre il midollo spinale (Figura 1A-D). Verificare l&#39;angolo delle pale è bassa e parallela al cavo in modo che il midollo spinale sottostante non sia danneggiato. </li><li> Continuare laminectomia in direzione rostrale a fierevia e il midollo spinale toracico e cervicale. </li><li> Accise delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale, con una pinza di tessuto smussato e uso microscissors per tagliare con attenzione alle radici per rilasciare il cavo. Posizionare il midollo spinale asportato in una capsula di Petri contenente 4 ° C tampone sterile dissezione ratto (descritto in 1.1). Lavare il tessuto in appena preparato 4 ° C tampone dissezione e con le forbici hanno tagliato il midollo spinale trasversalmente in 1 centimetro segmenti (Figura 1E). </li><li> Per ogni segmento di tessuto, usare una mano per tenere il tessuto con una pinza sottile. Con l&#39;altra mano, utilizzare microscissors per rimuovere con attenzione le meningi sovrastanti, sostanza bianca, e la maggior parte della materia grigia con l&#39;aiuto di un ambito dissezione. In alternativa, utilizzare una pinza sottile (Dumont 4 #) a staccarsi maggior parte della materia grigia e bianca, lasciando solo la regione periventricolare del midollo spinale che comprende la ependyma e una piccola quantità di materia grigia circostante (Figura 1F-H).</li><li> Pool il tessuto periventricolare sezionato in una capsula di Petri 10 centimetri sterile contenente freddo tampone dissezione ratto. </li></ol> 3. La raccolta e la dissezione di Adult periventricolare umana midollo spinale Tessuto Nota: il tessuto del midollo spinale umano è raccolto da donatori di trapianto di organi adulti (i donatori avevano un&#39;età compresa 2-60 anni) dopo che gli altri organi sono stati rimossi per il trapianto di organi. Il Trillium Gift of-Life Program ottiene il consenso per la rimozione di tessuto per la ricerca da parte della famiglia del paziente e avvisa il nostro team di raccolta in modo tempestivo in modo che siamo stati in grado di raccogliere le corde entro 2 ore di clampaggio aortico. Si accettano donatori adulti maschili e femminili con sierologia negativa e senza infezioni. <ol><li> Tessuto raccolto in un modo sterile in sala operatoria attraverso un approccio anteriore utilizzando la stessa esposizione anterior già sezionato per la rimozione di organi dal transp organosquadra raccolta lant. </li><li> Esporre la colonna spinale anteriore attraverso svincolo con grandi crocette costola e grandi divaricatori paddle dei rimanenti tessuti e organi, tra cui i grandi vasi sanguigni. </li><li> Utilizzare una sega sternale montato con una lunga lama per tagliare i dischi intervertebrali alle estremità rostrale e caudale della lunghezza desiderata della colonna vertebrale, per essere asportato. Angolo della sega circa 45 ° medialmente per tagliare un trogolo triangolare dalla parte laterale dei corpi vertebrali fermandosi poco prima del canale spinale. </li><li> Togliere in blocco gli aspetti mediali dei corpi vertebrali dei segmenti desiderati con l&#39;ausilio di osteotomi curve e maglio avendo cura di evitare il taglio attraverso la dura. Sollevare delicatamente la dura ricoperta midollo spinale con una pinza dentata e fortemente incidere le estremità rostrale e caudale del cavo. Utilizzare lunghe forbici e pinze per transetto bilateralmente le singole radici. </li><li> Posizionare il segmento asportato del midollo spinale in 4 °; C tampone sterile (1x HBSS + 0,6% di glucosio + 2% di penicillina-streptomicina) in una grande provetta per il trasporto verso la camera di coltura tissutale. </li> <li> Nota: Generalmente, un 3 - segmento 6 cm midollo spinale dal toracico superiore e / o medio-basso livello toracico viene rimosso in sala operatoria in condizioni sterili non appena possibile dopo la cessazione della circolazione e posto in fredda tampone sterile . Il tempo trascorso tra la cessazione della circolazione e la rimozione del midollo spinale varia con il tempo necessario per raccogliere gli organi bersaglio per la donazione e variava da 45 minuti a 2 ore. Se il cuore e polmoni sono anche state rimosse, la dissezione può essere preso lontano rostrally per raccogliere una porzione del midollo cervicale inferiore. </li><li> Sezionare il tessuto del midollo spinale umano il più presto possibile dopo la raccolta, generalmente entro 3 ore. Rimuovere la dura e altri meningi con una pinza. Sciacquare il tessuto del midollo spinale in appena fatto 4 ° C tampone dissezione etagliate trasversalmente in 1 centimetro segmenti. </li><li> Con l&#39;aiuto di un ambito dissezione, accise meningi sovrastanti, sostanza bianca, e la maggior parte della materia grigia con pinze dei tessuti, una pinza sottile e microscissors per ogni segmento del tessuto. Pool tessuto periventricolare sezionato, che include il ependima e una piccola quantità di materia grigia circostante, in una piastra di Petri 10 centimetri sterile contenente freddo tampone dissezione umana. </li></ol> 4. L&#39;isolamento e coltura di Adult Rat e NSPCs midollo spinale umano <ol><li> Effettuare le seguenti operazioni asetticamente in una cappa a flusso laminare. <ol><li> Tritare il ratto sezionato o tessuto periventricolare umana in 1 mm 3 pezzi con microscissors. </li><li> Enzimaticamente dissociare il tessuto macinata con enzimi proteolitici utilizzando il kit di dissociazione papaina come indicato nella tabella di materiali / reagenti. Nota: i componenti dei reagenti includono 4 flaconcini; Fiala 1: soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS), Fiala 2: contenent papainag L-cisteina e EDTA, Fiala 3: Deoxyribonuclease I (DNasi), Fiala 4: inibitore della proteasi ovomucoid con albumina sierica bovina (BSA). Nota: Nota: La papaina è una proteasi solfidrile che ha un&#39;ampia specificità per i substrati di proteine. La papaina qui è derivato dal lattice dall&#39;impianto papaya Carica e degrada maggior parte dei substrati proteici più esteso rispetto proteasi pancreatiche. Durante il processo di dissociazione c&#39;è qualche danno cellulare del DNA che causano per essere rilasciato nel medium di dissociazione che aumenterà la viscosità e rendere pipettaggio difficile. Così, DNase è inclusa nella procedura di isolamento cellulare per digerire il DNA senza danneggiare le cellule intatte. Ovomucoids sono glicoproteina inibitori della proteasi utilizzati per inibire l&#39;attività papaina dopo la fase di dissociazione. </li></ol></li><li> Al primo utilizzo, ricostituire la miscela inibitore albumina ovomucoid (fiala 4) con 32 ml di EBSS (fiala 1), e quindi conservare a 4 ° C e utilizzare per isolamenti successive.Nota: Si ottiene una soluzione ad una concentrazione efficace di 10 mg di inibitore ovomucoid e 10 mg di albumina per ml. </li><li> Aggiungere 5 ml di EBSS (fiala 1) per una fiala papaina (fiala 2), ottenendo una soluzione a 20 unità di papaina / ml in 1 mM L-cisteina con EDTA 0,5 mm. Verificare che la soluzione papaina appare chiaro quando disciolto completamente, altrimenti posizionare il flacone in un bagno di acqua 37 ° C per dieci minuti fino a quando la papaina è completamente sciolto a garantire la piena attività dell&#39;enzima. </li><li> Aggiungere 500 ml di EBSS (fiala 1) per una fiala DNasi (fiala 3) e mescolare delicatamente come DNasi è sensibile al taglio denaturazione. Aggiungere 250 microlitri della soluzione di DNasi al flaconcino contenente la papaina, ottenendo una concentrazione finale di circa 20 unità / ml papaina e 0,005% DNasi. Salvare l&#39;equilibrio della fiala DNasi da utilizzare in seguito. </li><li> Posizionare il ratto macinate o tessuti umani nella soluzione papaina come preparata al precedente punto 4.4. Per l&#39;isolamento tessuto umano, suddividere il tessuto tritato equamente tra duefiale papaina (circa 0,2 g / flacone). </li><li> Incubare a 37 ° C con agitazione costante su una piattaforma rocker dissociare il tessuto nella soluzione papaina attivato. Incubare tessuti di ratto per 45 minuti a 1 ora, e tessuti umani per 1 a 2 ore a seconda della quantità di tessuto tritato, circa 0,2-0,4 g rispettivamente. </li><li> Triturare la miscela con una pipetta 10 ml di dissociare eventuali pezzi di tessuto rimanenti per produrre una sospensione cellulare torbida. Trasferire la sospensione cellulare (non includono pezzi di tessuto non dissociato) in una sterile tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere le cellule pellet in terreno contenente ovomucoid, un inibitore della papaina. <ol><li> Preparare la soluzione ovomucoid mescolando 2,7 ml EBSS (fiala 1) con 300 ml di soluzione di albumina-inibitore ovomucoid ricostituito (flaconcino 4) in un tubo da 15 ml. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi (fiala 3) salvato in precedente punto 4.4. </li><li> Eliminare il surnatante dale cellule pellet e immediatamente risospendere il pellet cellulare nella miscela di albumina-inibitore DNasi diluito. </li></ol></li><li> Cellule intatte separati da membrane cellulari mediante centrifugazione attraverso un unico passaggio gradiente di densità discontinuo. <ol><li> Preparare il gradiente di densità discontinuo aggiungendo 5 ml di soluzione di albumina-inibitore (fiala 4) in una provetta da 15 ml, e utilizzando una pipetta da 5 ml, delicatamente e lentamente strato la sospensione cellulare (preparato come descritto in precedenza al passo 4.8) sopra la soluzione di albumina-inibitore. </li><li> Centrifugare a 70 xg per 6 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Nota: L&#39;interfaccia tra i due strati di gradiente deve essere chiaramente visibile, anche se miscelazione minima in quel punto non influisce sul risultato. Frammenti di membrana rimangono all&#39;interfaccia e cellule dissociate pellet sul fondo della provetta. </li></ol></li><li> Per le cellule di ratto, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di ratto EFH media (pre-riscaldato a 37 ° C).Contare densità cellulare in tempo reale con un emocitometro e piastra le cellule in un pallone di coltura T25 ad una densità di 10 cellule / microlitro in EFH. La resa tipica di cellule da tessuto di ratto è di circa 2 x 10 6 cellule con circa il 80% viability.If colture clonali sono desiderati, alveoli con una densità inferiore a 10 cellule / microlitro. Incubare le beute a 37 ° C in 5% CO 2 e consentire le culture di crescere indisturbata per 1 settimana per evitare l&#39;aggregazione di sfere. </li><li> Per le cellule umane, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno EFH umana (pre-riscaldato a 37 ° C). Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino 40 micron cella nylon seguita con 30 ml di EFH per rimuovere frammenti mielina e membrana cellulare. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di EFH media. </li><li> Contare densità cellulare in tempo reale con un emocitometro e piastra cellule umane in piastre di coltura da 6 pozzetti ad una densità di 10 5 cellule / pozzetto in un volume totaledi 5 ml EFH / bene. La resa tipica di cellule da tessuto umano è di circa 1 x 10 6 cellule con circa il 70% redditività. Pozzi Pre-coat con un substrato aderenti come Matrigel (vedi nota sotto). Diluire con un rapporto di 40 microlitri Matrigel: 1 ml SFM. </li><li> Nota: In alternativa, possono essere utilizzati altri substrati aderenti come il poli-D-lisina / laminina, fibronectina o collagene. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO 2 e consentire le culture di crescere indisturbata per 1 settimana. </li></ol> 5. Passaging di ratto adulto e NSPCs midollo spinale umano <ol><li> NSPCs Rat formeranno piccoli neurosfere di circa 70 micron di diametro entro 1 settimana dalla semina iniziale; NSPCs passaggio ratto settimanali raccogliendo la sospensione cellulare, centrifugazione a 300 xg per 5 min, e triturazione meccanicamente il pellet cellulare dissociare le neurosfere. </li><li> Seme le cellule dissociate in fiasche T25 contenenti ratto fresco EFH medio. Alternativamente,utilizzare il 50% di media ratto condizionata per passaging. La resa tipica di NSPCs ratto a passaging è di circa 5 x 10 6 cellule che aumenta in maniera esponenziale con il numero di passaggio. </li><li> Per le culture umane, una settimana dopo la placcatura iniziale, sostituire la metà del terreno di coltura con fresca EFH due volte alla settimana per permettere alle cellule di aderire al substrato. Generalmente, 1 - 2 settimane dopo una volta che le cellule sono attaccate al substrato, sostituire l&#39;intero volume del terreno di coltura due volte alla settimana con EFH fresca. </li><li> Cellule Subculture prima di raggiungere confluenza tra 4-8 settimane. <ol><li> Cellule Subculture staccando le cellule dal substrato enzimatica (vedere Tabella dei materiali) con 2 ml di enzima per pozzetto incubate per circa 10 minuti a 37 ° C. Raccogliere sospensione cellulare, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 1 ml di appena fatto medio EFH. </li><li> Contare le cellule vive con un emocitometro e piastra le cellule in piastre di coltura 6 pozzetti (pre-coated come sopra al punto 4.12) ad una densità di 10 5 cellule / pozzetto in un volume totale di 5 ml EFH / pozzetto. La resa tipica di NSPCs umani a passaging è di circa 2 x 10 6 cellule e, in generale questo sarà il doppio con il passaggio. In generale, mantenere le culture con il 50% di media condizionata EFH 2 - 3 volte a settimana tra passaging. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Durante la dissezione del midollo spinale di ratto cura tessuto dovrebbe essere presa non danneggiare il midollo spinale durante l&#39;esecuzione della laminectomia. È facile isolare il tessuto periventricular quando i segmenti del midollo spinale sono intatti. I segmenti di tessuto devono essere completamente immersi in tampone dissezione e le meningi sovrastanti e della sostanza bianca possono essere tagliate via come strisce longitudinali con microscissors. In alternativa, pinze dei tessuti fini possono essere utiliz...

NSPCs sono cellule multipotenti impegnate per il lignaggio neurale che possono auto rinnovarsi e facilmente espandere in vitro. Ci riferiamo a queste cellule come una popolazione mista di cellule staminali / progenitrici neurali dal momento che espongono proprietà delle cellule staminali multipotenti auto-rinnovamento e progenitori più ristretti. NSPCs si trovano sia nel cervello fetale e adulto e il midollo spinale 1,2. Nell&#39;adulto, NSPCs sono normalmente quiescenti e di soggiornare all&#39;interno di nicchie specifiche, tra cui la zona subventricolare rivestimento dei ventricoli laterali 2-4, e la regione periventricolare che circonda il canale centrale del 5,6 del midollo spinale. In genere, NSPCs sono coltivate come neurosfere fluttuanti o monostrato come aderenti in mezzo privo di siero integrato con EGF e bFGF, mitogeni che selezionano per le popolazioni di cellule staminali / progenitrici. Il saggio neurosfere originariamente sviluppato da Reynolds e Weiss 2, è più comunemente usato per la cultura eespandere le cellule staminali neurali. NSPCs mostrano multipotenza quando sono placcati in siero terreno contenente senza fattore di crescita, differenziarsi in neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Multipotenti, NSPCs auto-rinnovamento possono essere isolate e coltivate da roditore midollo spinale adulto quando il tessuto coltivato comprende le regioni del canale centrale 6,7. Un potenziale vantaggio nell&#39;utilizzo NSPCs generati dal midollo spinale adulto al contrario di generare cellule da altre regioni è che queste cellule tessuto-specifiche più simili cellule del midollo spinale che sono perso o danneggiato seguenti infortunio o malattia. Lavoro precedente ha mostrato che neurosfere derivate dal midollo spinale adulto umano non vengano estese a lungo termine o diversi passaggi per generare un numero sufficiente di cellule 8,9. Tuttavia, con modificazioni in condizioni di coltura, abbiamo riportato l&#39;espansione e trapianto di midollo NSPCs derivati ​​da spinale umani adulti, dimostrando che l&#39;auto-rinnovamentoe NSPCs multipotenti possono essere isolate dal midollo spinale adulto umano dei donatori di trapianto di organi 10. Principalmente, la rimozione della maggior parte della sostanza bianca durante la dissezione e coltura di tali cellule su un substrato aderente in crescita a medio fattore arricchito selezionato per proliferanti adulti NSPCs midollo spinale umano. In questo protocollo si descrive la raccolta del midollo spinale di ratto adulto e da donatori umani di trapianto di organi, la dissezione dei tessuti periventricolare, e l&#39;isolamento, la cultura e l&#39;espansione di NSPCs.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>#10010023</td><td>Tampone di dissezione</td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>#14175095</td><td>Tampone di dissezione</td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma</td><td># G-6152</td><td>Preparare una soluzione madre di glucosio al 30% per il tampone di dissezione e la miscela ormonale</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>#15140-148</td><td>Tampone di dissezione e terreno di coltura</td></tr><tr><td>Neurobasale-A&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#10888-022</td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>L-glutammina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>#12587010</td><td>Terreno di coltura</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>#11885084</td><td>Mix ormonale</td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>#21700-075</td><td>Mix ormonale</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Sigma</td><td># S-5761</td><td>Preparare una soluzione madre al 7,5% di NaHCO3 per la miscela di ormoni</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>#H9136</td><td>Preparare una soluzione madre 1M HEPES per la miscela di ormoni</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>#I-5500</td><td>Miscela di ormoni</td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>#T-2252</td><td>Miscela di ormoni</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td># P7505</td><td>Ormone mix</td></tr><tr><td>Selenio</td><td>Sigma</td><td>#S-9133</td><td>Mix ormonale</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>#P-6149</td><td>Mix ormonale</td></tr><tr><td>EGF, topo</td><td>Sigma</td><td>#E4127</td><td>Preparare 100 &mu; g/ml di stock in B27 e aliquota; EFH medio</td></tr><tr><td>EGF, umano ricombinante</td><td>Sigma</td><td>#E9644</td><td>Preparare 100 &mu; g/ml di stock in B27 e aliquota; EFH medium</td></tr><tr><td>bFGF, umano ricombinante</td><td>Sigma</td><td>#F0291</td><td>Prepare 100 &mu; g/ml di stock in B27 e aliquota; EFH medio&nbsp;</td></tr><tr><td>Eparina, 10.000 U</td><td>Sigma</td><td>#H3149</td><td>Preparare 27,3 mg/ml di stock in miscela ormonale e aliquota; </td></tr><tr><td>Kit di dissociazione della papaina</td> media EFH <td>Worthington Biochemicals</td><td>#LK003150</td><td>Contiene EBSS, papaina, DNasi, inibitore della proteasi ovomucoide con</td></tr><tr><td>BSA Pentobarbital di sodio</td><td>Bimeda ... Pinza</td> per tessuti <td>00141704</td><td></td>DIN MTC Animal Health Inc</tr><tr><td>:</td><td>Addisons Fine Science Tools</td><td>#11006-12&nbsp;</td><td>Punta standard seghettata; disponibile anche micro-punta</td></tr><tr><td>Pinze fini: Dumont #4</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>#11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforbici</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>#15024-10</td><td>Vannas</td></tr><tr><td>Rongeurs</td> a manico rotondo <td>Bausch & Lomb</td><td>N1430</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri da 10 mm&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>T25 Fiasche da coltura</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtro cellulare</td><td>in nylon VWR</td><td>CA21008-949</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>CA73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, fattore di crescita ridotto (100x)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Scongelare secondo le indicazioni e congelare le aliquote; utilizzare diluito in un rapporto di 40 &mu; l. Matrigel: 1 ml SFM</td></tr></tbody></table>

isolamento di neural cellule staminali / progenitrici dalla regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Ratto adulto e del midollo spinale cellule neurali staminali / progenitrici umane (NSPCs) coltivate in crescita a medio fattore arricchito consente la proliferazione di multipotenti, e le cellule staminali neurali espandibili auto-rinnovamento. In condizioni di siero, questi NSPCs multipotenti si differenziano, generando neuroni, astrociti, oligodendrociti e. Il tessuto raccolto viene enzimaticamente dissociato in una soluzione di papaina-EDTA e poi dissociato meccanicamente e separati mediante un gradiente di densità discontinuo per produrre una sospensione di cellule singole che è placcato in medium Neurobasal supplementato con fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF ), ed eparina. Ratto adulto NSPCs midollo spinale sono coltivate come neurosfere libero di fluttuare e adulti NSPCs midollo spinale umano vengono coltivate come le culture aderenti. In queste condizioni, per adulti NSPCs midollo spinale proliferano, i marcatori espressi di cellule precursori, e possono essere continuamente ampliati al passaggio. Queste cellule possono be studiato in vitro in risposta a vari stimoli, e fattori esogeni può essere usato per promuovere restrizione lineage esaminare neurali differenziazione delle cellule staminali. Multipotenti NSPCs o loro discendenti possono essere trapiantate in vari modelli animali per valutare riparazione rigenerativa.

Ratto adulto cellule del midollo spinale cresciute in coltura in sospensione in EFH medio formeranno piccoli neurosfere (colonie di cellule indifferenziate) entro 1 settimana di placcatura iniziale. In colture primarie, la maggior parte delle cellule placcato moriranno e le cellule staminali fattore-sensibile crescita proliferare e sono selezionati per nel mezzo EFH. In passaggio 3, ci saranno numerose neurospheres fluttuanti circa 100 micron di diametro (Figura 2A). Neurosfere sono rotonde e la fase-lu...

Il midollo spinale adulto dei mammiferi contiene cellule staminali/progenitrici neurali (NSPC) che possono essere isolate ed espanse in coltura. Questo protocollo descrive la raccolta, l'isolamento, la coltura e il passaggio di NSPC generate dalla regione periventricolare del midollo spinale adulto dal ratto e da donatori di trapianto di organi umani.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali neurali dalla regione paraventricolare del midollo spinale di ratto adulto o umano. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando il midollo spinale mediante laminectomia. Il secondo passaggio consiste nel tagliare trasversalmente il midollo spinale in segmenti di un centimetro e nel dissezionare la regione paraventricolare da ciascun segmento del midollo spinale.Successivamente, il tessuto tritato viene tagliato in pezzi di un millimetro e quindi dissociato enzimaticamente. L'ultimo passaggio consiste nel separare le cellule integre mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo e seminare la sospensione cellulare. Infine, la formazione di neurosfere e la crescita delle cellule staminali neurali possono essere valutate mediante microscopia a immunofluorescenza.Oggi dimostrerò come isolare cellule staminali neurali dalla regione paraventricolare del midollo spinale di ratto adulto. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali neurali, come ad esempio quali fattori esogeni promuovono la restrizione della linea cellulare o come queste cellule rispondono a diversi stimoli o stress. Per iniziare, preparare la coltura, i mezzi e i tamponi per la dissezione come descritto nel protocollo testuale allegato.Successivamente, dopo un'overdose di anestetico, sterilizzare la pelle del ratto e utilizzare forbici da dissezione di grandi dimensioni per rimuovere la superficie dorsale, esponendo la colonna vertebrale. Tenere le forbici da dissezione perpendicolari alla superficie dorsale e in senso trasversale. Recidere la colonna vertebrale al di sopra degli arti posteriori.Quindi utilizzare forbici più piccole per tagliare longitudinalmente il muscolo dorsale sovrastante la colonna vertebrale in direzione rostrale, esponendo i processi spinosi a partire dall'estremità coddle esposta. Inserire uno strumento piccolo e ottuso per il taglio dell'osso in modo extraorale nella faccia laterale del canale spinale, nello spazio tra il midollo spinale e la colonna vertebrale. Posizionare la lama in modo superficiale e parallelo al midollo.Quindi effettuare piccole incisioni nella lamina ed estrarre con attenzione la lamina per esporre il midollo spinale. Questo angolo evita danni al midollo spinale sottostante. Continuare a rimuovere la lamina in direzione rostrale.Per esporre il midollo spinale toracico e cervicale utilizzando pinzette da dissezione atraumatiche, sollevare delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale e recidere le radici con forbici microchirurgiche. Per isolare il midollo, posizionare il midollo spinale asportato in una capsula di Petri contenente soluzione tampone sterile per dissezione del ratto fredda con ghiaccio. Lavare il tessuto con il tampone freddo per dissezione e utilizzare le forbici per tagliare trasversalmente il midollo spinale in segmenti di un centimetro. Per ciascun segmento di tessuto, utilizzare pinzette fini per tenere fermo il tessuto con una mano e, con l'altra mano, usare le forbici microchirurgiche per rimuovere con cura la sostanza bianca insieme alla maggior parte della sostanza grigia, lasciando soltanto la regione periventricolare del midollo spinale.Trasferire il tessuto periventricolare dissezionato in una piastra Petri sterile da 10 centimetri contenente soluzione fisiologica per dissezione di ratto fredda. Per iniziare l'isolamento delle cellule staminali neurali di ratto, utilizzare forbici microchirurgiche per tritare il tessuto periventricolare dissezionato in pezzi di un millimetro cubo. Successivamente, preparare il buffer di dissociazione enzimatica aggiungendo prima cinque millilitri di soluzione salina equilibrata di Earl in una provetta contenente papaina da un kit di dissociazione con papaina.Posizionare il vialino a 37 gradi Celsius per 10 minuti, in modo che la papaina si sciolga completamente e la soluzione appaia limpida. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di soluzione salina equilibrata di Earl al vialino contenente il DNA del kit di dissociazione. Dopo aver mescolato delicatamente, aggiungere 250 microlitri della soluzione di DNA al vialino contenente la papaina e mescolare delicatamente.Successivamente, aggiungere il tessuto tritato, circa 0,2 grammi, nel flacone e posizionare il flacone su una piattaforma oscillante a 37 gradi Celsius per 45 minuti fino a un'ora. Dopo l'incubazione, agitare la miscela con una pipetta da 10 millilitri per dissociare eventuali frammenti di tessuto rimanenti, ottenendo una sospensione cellulare torbida. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico sterile da 15 millilitri e centrifugare a 300 G per cinque minuti.A temperatura ambiente durante la centrifugazione, preparare la soluzione di OVO moid mescolando 2,7 millilitri di soluzione salina bilanciata di Earl con 300 microlitri della soluzione ricostituita di inibitore di albumina OVO MOID. In un tubo conico da 15 millilitri, aggiungere 150 microlitri della soluzione di DNA precedentemente preparata alla soluzione di oval moid e mescolare capovolgendo il tubo, scartare il soprannatante dalle cellule pellettizzate e risospendere immediatamente il pellet cellulare nella miscela diluita di inibitore di DNA e albumina. Successivamente, preparare un gradiente di densità discontinuo aggiungendo cinque millilitri di soluzione inibitrice di albumina in un tubo da 15 millilitri e utilizzando una pipetta da cinque millilitri stratificare delicatamente e lentamente la sospensione cellulare sulla soluzione inibitrice di albumina.Centrifugare il campione a 70 gs per sei minuti a temperatura ambiente. Al termine, scartare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di mezzo EFH pre-riscaldato per ratto, preparato come descritto nel protocollo testuale allegato. Contare la densità delle cellule vitali con un emocitometro e seminare le cellule in una fiasca da coltura T25 a una densità di 10 cellule per microlitro in EFH.Incubare i flaconi a 37 gradi Celsius in una atmosfera al 5% di anidride carbonica e lasciare crescere le colture indisturbate per una settimana per evitare l'aggregazione delle sferoidi. Qui è mostrata una sezione trasversale del midollo spinale di ratto colorata con blu fast luxol, nonché con ematina ed eosina per evidenziare i confini tra sostanza bianca e sostanza grigia. Il contorno tratteggiato indica il tessuto periventricolare residuo dissezionato che è stato isolato in questo protocollo da questa regione.Neurosferoidi come quelli mostrati qui cresceranno in sospensione libera in coltura ad alta ingrandimento. Si possono osservare microspine che fuoriescono dalle neurosferoidi, le quali proliferano come dimostrato dalla colorazione positiva per KI 67, in cui le neurosferoidi sono state dissociate e seminate in pozzetti rivestiti con matrigel. Inoltre, esprimeranno principalmente nestina, un marcatore delle cellule precursori neurali.Seguendo questa procedura, è possibile aggiungere fattori esogeni alle cellule coltivate per promuoverne la differenziazione. Le cellule staminali neurali adulte o le loro progenie possono inoltre essere trapiantate in diversi modelli animali per valutarne la capacità di riparazione rigenerativa. Spero che questo video si riveli utile e auguro buona fortuna nei vostri esperimenti.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video presenta un metodo per isolare le cellule staminali/progenitrici neurali dal tessuto periventricolare del midollo spinale nei ratti adulti. La tecnica prevede l'incubazione dei frammenti di tessuto in una soluzione contenente enzimi proteolitici per interrompere la matrice extracellulare e rilasciare le cellule. Successivamente, le cellule rilasciate vengono piastrate in un mezzo contenente specifici fattori di crescita che migliorano la proliferazione staminale/progenitrice...

Isolamento delle cellule progenitrici dello staminali neurale dalla regione periventricolare del midollo spinale di un ratto adulto

Matrici di fibrina che contengono fattori di crescita sono stati usati per mantenere le cellule staminali neurali innestate nei siti di completo recisione del midollo spinale. Cellule trapiantate completamente riempite la cavità della lesione e differenziate in diversi tipi di cellule neurali, tra cui i neuroni che si estendevano assoni nel midollo spinale ospite su lunghe distanze.

Promozione della sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali neurali con fibrina e fattore di crescita Cocktails dopo gravi lesioni del midollo spinale

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Questo protocollo descrive un metodo tagliere meccanico romanzo che consente l'espansione di staminali e cellule progenitrici aggregati sferici neurali senza dissociazione di una sospensione di cellule singole. Mantenere il contatto cellula / cellula consente una crescita rapida e stabile per oltre 40 passaggi.

Un metodo di espansione cGMP-applicabile per Aggregati di neurali umane staminali e cellule progenitrici derivate da cellule staminali pluripotenti o fetale tessuto cerebrale

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Lesioni del midollo spinale è una condizione traumatica che provoca grave morbilità e mortalità elevata. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un modello contusione di lesioni del midollo spinale nei topi seguita da un trapianto di cellule staminali neurali.

Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury

Stabilire sistemi di coltura per l'espansione delle cellule staminali neurali adulte (aNSC) consente l'esame e l'applicazione di aNSC per la terapia. La zona sottocallosa (SCZ) è stata recentemente riconosciuta come una nuova regione che forma neuroblasti nei topi adulti. Qui vengono descritti i metodi per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle SCZ-aNSC.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.

Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature

Qui, noi dimostrare le prestazioni di un modello di lesione minima del midollo spinale in un topo adulto che risparmia la nicchia di canale centrale alloggiamento cellule staminali neurali endogene (NSC). Vi mostriamo come l'analisi di neurosphere può essere usata per quantificare l'attivazione e migrazione delle CSN definitivo e primitiva dopo la lesione.

Un saggio di Neurosphere per valutare l'attivazione delle cellule staminali neurali endogene in un modello murino di ferita del midollo spinale Minimal

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Un metodo per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti dal cervello di ratti vivi è presentato qui in dettaglio sperimentale. Permette di raccogliere più cellule dagli stessi animali senza comprometterne il benessere.

Il metodo di "mungitura del cervello" per l'isolamento di cellule staminali neurali e cellule progenitrici di oligodendrociti da ratti vivi

Impara l'isolamento di cellule staminali neurali dalla regione periventricolare del midollo spinale di ratto adulto e umano. Questo metodo consente la formazione di neurosfere per studi di neuroscienza e medicina rigenerativa.

Isolamento di Neural cellule staminali / progenitrici dalla Regione periventricolare del ratto adulto e midollo spinale umano

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