Imaging Live Cell durante meccanica Stretch

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di osservare il ruolo della deformazione meccanica sulla meccanobiologia cellulare in tempo quasi reale. Ciò si ottiene costruendo prima un sistema con membrane flessibili su cui le cellule vengono coltivate e allungate. In una seconda fase, allungare la membrana per calibrare il numero di motori con la deformazione della membrana.

Successivamente, le cellule epiteliali polmonari di topo vengono allungate e i nuclei vengono visualizzati. Al fine di dimostrare che la deformazione della membrana viene trasmessa alle cellule, le barelle sono state quindi incorporate nell'A FM per la nanoindentazione al fine di misurare la rigidità delle singole cellule prima e dopo l'allungamento. I risultati mostrano danni diretti sulle celle a causa dell'allungamento applicato.

Sempre sulla base dell'imaging a fluorescenza, è stato dimostrato che la produzione di specie reattive dell'ossigeno aumenta con l'allungamento. Bene, questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo della biologia meccanica polmonare, come ad esempio se le cellule epiteliali possono essere danneggiate o meno con la ventilazione meccanica. Questo metodo può fornire informazioni sulle cellule polmonari, sulla biologia meccanica e può essere applicato anche ad altri tessuti molli come fette di fegato o di cartilagine di crescita.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa della combinazione non convenzionale di strumenti utilizzati in questi esperimenti, come il microscopio a forza atomica. Per iniziare, preparare una membrana PDMS rivestita di collagene modificata per l'uso in coltura cellulare come descritto nel protocollo di testo allegato. Successivamente, seminare cellule epiteliali polmonari di topo a 2,5 milioni di cellule per pozzetto su una membrana sterile e flessibile rivestita di collagene.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per due giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza. Quindi utilizzare un punzone per biopsia da 1,5 millimetri per praticare due fori in ciascuna delle sei linguette di fissaggio, a 20,5 millimetri dal centro del costrutto se non si desidera alcun pretensionamento. E rimuovere il terreno di coltura cellulare.

Assicurarsi che l'attuatore meccanico sia in una posizione di deformazione zero e posizionare la membrana sulla barella in modo che i fori di punzonatura siano allineati con i perni e i morsetti. Posizionare i morsetti superiori in posizione, quindi serrare le viti una alla volta, alternando i diversi lati. Aggiungere un millilitro di terreno di coltura cellulare prima di posizionare il dispositivo sul tavolino del microscopio.

Centrare il dispositivo sul percorso della luce. Quindi, fissare il dispositivo al tavolino. Messa a fuoco della membrana regolando le posizioni in piano e verticale del dispositivo meccanico con un controller di tavolino del microscopio nel blocco di input di destinazione.

Immettere un valore di conteggio del motore, che corrisponde al livello di deformazione desiderato da applicare. Quindi, impostare il valore nel blocco di input della velocità su 10 RPM o meno per osservare lo stesso campo prima e dopo l'allungamento poiché il campo potrebbe spostarsi rispetto all'obiettivo del microscopio e potrebbe essere necessario regolare il tavolino del microscopio durante l'allungamento. Una volta impostato tutto, fai clic su Vai.

Inizia apportando modifiche al microscopio a forza atomica. Aumentare l'altezza della testa FM fino alla sua posizione massima in direzione Z. Quindi posizionare gli estensori sulle gambe per sollevare il piano in cui un cantilever FM entra in contatto con il campione.

Quindi, rimuovere la piastra dello scanner FM A e l'obiettivo desiderato dal microscopio. Aggiungere un distanziatore all'obiettivo e quindi rimontarlo sul microscopio. Quindi riposizionare la piastra dello scanner sull'A FM. L'altezza del distanziatore dipenderà dall'obiettivo e dalla specifica configurazione FM, ma è necessario utilizzare il distanziatore se si desidera l'imaging ottico poiché il piano di osservazione sarà spostato nella direzione Z.

Quindi, avviare il software A FM, il software del microscopio ottico e tutte le sorgenti luminose necessarie, inclusa la sorgente luminosa per le misure di fluorescenza. Monta un chip con una trave a sbalzo che ha una rigidità di 200 pico newton per nanometro o meno per misurare il modulo elastico delle cellule vive sull'A FM. Quindi, allineare il laser, quindi montare un vetrino di copertura sul dispositivo e utilizzarlo per calibrare la rigidità del cantilever secondo i suggerimenti del produttore. Immediatamente prima di montare la membrana sul dispositivo di allungamento, tagliare le pareti a circa un millimetro di altezza.

Ciò riduce l'interferenza riscontrata tra le pareti della membrana e la cella di carico. Quindi rimuovere il terreno di coltura cellulare e montare la membrana sul dispositivo meccanico. Posizionare il dispositivo meccanico con l'adattatore sullo scanner utilizzando il software.

Allungare la membrana al livello di deformazione a trazione desiderato prima della nanoindentazione. Aggiungere 0,5 millilitri o meno di terreno sulle cellule per mantenerle idratate, ma anche fare attenzione a evitare fuoriuscite che potrebbero danneggiare lo scanner FM o il microscopio. Quindi innestare la trave a sbalzo con la membrana.

Seguire il protocollo del particolare dispositivo FM A per scansionare le aree di interesse. Quando un ceppo del 20% è stato applicato alle cellule seminate sulla membrana, le cellule sono state spostate del 20% come indicato qui, l'impatto delle cellule sulla produzione di specie reattive dell'ossigeno è stato misurato nelle cellule epiteliali bronchiali utilizzando un sensore cumulativo di superossido mitocondriale come descritto nel protocollo di testo allegato. In assenza di allungamento meccanico, la produzione di ROS non è aumentata significativamente oltre i 60 minuti quando è stato applicato e mantenuto un singolo allungamento del 17%.

C'è stato un aumento dei ROS mitocondriali che è persistito per altri 60 minuti con l'incorporazione della barella meccanica nel microscopio a forza atomica. Le mappe del modulo elastico, delle cellule epiteliali polmonari di topo prima e dopo la deformazione di trazione del 10% sono state ottenute dalle regioni qui descritte. Sono state registrate 300 singole curve di deflessione forzata su un'area di 40 per 40 micrometri, mostrando un cambiamento nella localizzazione delle regioni ad alto modulo con l'applicazione della deformazione.

Una volta padroneggiato, l'allungamento cellulare può essere eseguito in 15 minuti. Mentre una nanoindentazione FM può richiedere due ore di esecuzione corretta Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare le cellule con cura ma rapidamente poiché i risultati possono essere influenzati negativamente dall'agitazione e dall'esposizione prolungata all'aria ambiente prima che i dati vengano riportati. Non dimenticare che lavorare con un FM può essere estremamente impegnativo.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere precauzioni come tenere tutti i liquidi lontani dallo scanner.