Name: Mouse Naïve CD4 + Isolamento T cellulare e In vitro Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Impara a isolare e differenziare cellule T CD4+ naive da linfonodi e milza di topo in sottopopolazioni T helper in vitro. Questo metodo utilizza separazione con microsfere magnetiche e citochine polarizzanti.

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Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l&#39;Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l&#39;ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).

Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando protocolli approvati dall&#39;ufficio di salute ambientale e sicurezza presso l&#39;Rosalind Franklin University of Medicine and Science. C57BL / 6 topi (acquistato da NCI) utilizzato per questo protocollo è stato ospitato in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti utilizzando i protocolli approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso l&#39;Rosalind Franklin University of Medicine and Science. 1. Preparazione di strumenti, accessori e reagenti <ol><li> Coat 48 pozzetti o 24 pozzetti piastre con anti-CD3 e anti-CD28 (Tabella 1) in PBS sterile, coperchio e avvolgere in parafilm per evitare l&#39;evaporazione e la contaminazione, e poi incubare O / N a 4 ° C il giorno prima T isolamento delle cellule. In alternativa, i pozzetti cappotto 1 ora a 37 ° C. Eseguire condizioni Th0, Th1, Th2, e iTreg rivestendo sia anti-CD3 e anti-CD28 a 1 ug / ml in 0,5-1 ml diVolume tal (piastra 48 pozzetti). Per Th17, di solito cappotto anti-CD3 a 2 mg / ml e anti-CD28 a 1 mg / ml. NOTA: Abbiamo scoperto che una concentrazione di anti-CD3 inferiore è ottimale per la generazione Th1, Th2, e iTreg mentre una maggiore concentrazione anti-CD3 è ottimale per la generazione Th17. Così, anti-CD3 e anti-CD28 concentrazioni dovrebbero essere titolati e ottimizzati per i singoli laboratori (Tabella 2). </li><li> Sterilizzare un insieme di strumenti di dissezione (forbici e pinze) per la soluzione in autoclave o disinfettante. Saranno necessari un tubo o un piccolo bicchiere contenente etanolo al 70% per una rapida sterilizzazione di strumenti tra dissezioni. Infine, sarà necessaria una bottiglia spray contenente 70% di etanolo per sterilizzare la superficie del mouse prima dissezione. </li><li> Preparare una superficie di dissezione avvolgendo un pezzo di polistirolo o sughero in fogli di alluminio. Perni dissezione o aghi vengono utilizzati per fissare l&#39;animale in luogo. </li><li> Preparare piatti o piastre per la raccolta di tiUESTIONI. Se i tessuti pooling, separati 60 millimetri piatti contenenti 3 ml di PBS sterile + 1% FBS (PBS +) per milza e linfonodi tessuti è sufficiente. Se mantenendo tessuti da singoli topi separati, preparare un 1ml 24-pozzetti contenenti di PBS + il numero desiderato di pozzetti. </li><li> Preparare i media RPMI completo per colture cellulari e pre-caldo prima dell&#39;uso (Tabella 1). NOTA: Noi abitualmente utilizziamo RPMI ma altri media come IMDM e DMEM può essere altrettanto efficace o superiore a seconda del laboratorio e l&#39;esperimento. </li><li> Cut 2x2 cm quadrati di nylon ingranano con una dimensione dei pori e autoclave a 120 micron per sterilizzare (Tabella 1). </li><li> Opzionale: se si utilizza il cellulare magnetico ad alta velocità del sistema di smistamento come autoMACS per l&#39;arricchimento di cellule CD4 +, corsa pre-caldo e risciacquo buffer in un bagno d&#39;acqua C 37 o per evitare danni alla macchina. </li><li> NOTA: arricchimento si consiglia di aumentare il rendimento di smistamento e ridurre i tempi di ordinamento. </li><li> Tuttopassaggi di preparazione, fatta eccezione per la dissezione, devono essere eseguite in una cappa coltura tissutale sterili. </li></ol> 2. Isolamento dei linfonodi e della milza di topi <ol><li> Euthanize il numero di animali utilizzando una tecnica istituzionalmente approvato. Utilizzare C57BL / 6 topi di sesso femminile, di età 5-10 settimane, a causa della loro alta percentuale di cellule T naive e grasso corporeo inferiore rispetto ai maschi o ai topi anziani. NOTA: Le cellule derivate da topi maschi si esibiranno in modo simile in vitro e le fasi del protocollo rimangono gli stessi. Topi femmina, 5-10 settimane vecchie, in genere produrrà 3-6 x 10 6 naïve cellule CD4 + T per mouse. Tuttavia, utilizzando diversi ceppi di topi possono influenzare il rendimento e le prestazioni. Per esempio, cellule di topi C57BL / 6 sono migliori per la generazione di cellule Th1 mentre le cellule da topi Balb.c sono migliori per generare cellule Th2. </li><li> Distribuire gli arti dell&#39;animale e perno in posizione, come mostrato in Figura 1. Tagliare la pelle lungoitudinally dall&#39;ano al mento facendo attenzione a non forare tessuti più profondi. </li><li> Diffusione aprire la pelle con una pinza e pin la pelle in atto per permettere un facile accesso ai linfonodi come mostrato in Figura 1. </li><li> Raccogliere linfonodi accessibili dalle posizioni indicate nella figura 1. Afferrando linfonodo con un paio di pinze, mentre la separazione dei tessuti con un altro paio di pinze permette una facile rimozione. Posizionare il tessuto nel piatto di raccolta. </li><li> Raccolto milza dalla posizione mostrata in figura 1. In questo caso, il taglio attenzione nel peritoneo è necessario per ottenere l&#39;accesso alla milza. Posizionare il tessuto in un piatto di raccolta. </li><li> Ripetere la procedura se saranno raccolte più tessuti. Altrimenti procedere con i passi successivi. A questo punto, eseguire tutte passaggi rimanenti in ghiaccio fino fasciame delle cellule T dopo la cernita. </li></ol> 3. Tissue Processing e CD4 + arricchimento<ol><li> Trattare i linfonodi e la milza in piatti diversi per aumentare la resa di preparazioni di cellule linfonodali non richiedono eritrociti lisi, che possono provocare la morte dei leucociti minore. Pertanto, le seguenti operazioni descrivono un metodo per il trattamento della milza e dei linfonodi popolazioni seguiti separatamente unendo prima di etichettatura per l&#39;ordinamento. </li><li> Rimuovere il tessuto (milza o linfonodi aggregati) dal piatto di raccolta e posto in un nuovo piatto 60 millimetri contenente 3 ml di PBS +. Inserire un quadrato di nylon sterile maglia sopra il tessuto con pinze sterilizzate. </li><li> Prendete il lato del pollice di un stantuffo della siringa (3-10 ml) e distruggere il tessuto delicatamente contro la rete. Quasi tutto il tessuto dovrebbe andare in sospensione. In alternativa, posizionare il tessuto tra due vetrini smerigliati autoclavato e rettificato in sospensione. </li><li> Pipettare la sospensione su e giù per un paio di volte per rompere i grumi solubili rimanenti. Inserire un nuovo pezzo quadrato di maglia di nylon sopra l&#39;apertura di unTubo da 15 ml e filtrare la sospensione attraverso per rimuovere i detriti rimanenti. </li><li> Ripetere i passaggi 2-4 per linfonodi supplementare e tessuto splenico. </li><li> Una volta che la sospensione è stata filtrata in un tubo 15ml riempire il resto del tubo con PBS + e invertire alcune volte. Centrifugare le cellule a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Per le cellule spleniche, aspirare il surnatante dopo centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di soluzione ghiacciata 1X ACK per milza per 1 min per lisare gli eritrociti. Aggiungere quindi 10 ml di PBS + sulla parte superiore del ACK, invertire il tubo, e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Per le cellule linfonodali, aspirare il surnatante e risospendere in 2 ml di PBS +. Se lo si desidera questi possono essere combinati con le cellule della milza dopo la loro lisi ACK e lavaggio. </li><li> Aspirare il surnatante dopo centrifugazione dei splenociti e risospendere in altri 10 ml di PBS +. A questo punto la sospensione linfonodo può esseredded sulla parte superiore della sospensione milza se è richiesto il pool di tessuto per l&#39;ordinamento. Centrifugare il tubo di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Il pellet cellulare può essere preparato per CD4 arricchimento. Se non viene eseguita questa operazione, passare alle fasi di preparazione di smistamento. </li><li> Per CD4 arricchimento utilizzando il sistema cell sorting magnetico ad alta velocità, risospendere il pellet cellulare CD4 con perline. Tipicamente 15 ml di perline diluito in 85 ml di PBS + è usato per etichettare i tessuti dal 1 mouse. Rampa il volume della miscela sferette, se necessario, risospendere il pellet, e incubare per 15-30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS +, passare la sospensione attraverso nylon in un nuovo tubo 15 ml per rimuovere i detriti e centrifugare di nuovo a 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere il precipitato in 100 ml di PBS + per topo e procedere alla selezione positiva sul sistema di smistamento cellulare magnetica ad alta velocità. Se si utilizza un sistema di separazione manuale, fsusseguirsi le istruzioni del produttore per l&#39;arricchimento. In alternativa, risospendere i campioni di tampone FACS: PBS con 1mM EDTA (pH = 8) e 1% BSA, sterile filtrata. </li><li> Rimuovere la frazione positiva e lavare di nuovo con 10 ml di PBS +. La frazione arricchita CD4 + è ora pronto per essere etichettato per l&#39;ordinamento. </li></ol> 4. cellule Ordinamento Naïve CD4 + T <ol><li> Etichettare il pellet di cellule con PBS + anticorpi fluorescenti contenenti diretti contro CD62L, CD44, CD25, e CD4. Se utilizzando gli anticorpi elencati nella Tabella 1, sono forniti diluizioni per ciascuno. Per la colorazione, un volume di 100 ml di cocktail anticorpo viene utilizzato per tessuti da un mouse. </li><li> Risospendere il pellet in cocktail di anticorpi e incubare per 15-30 min a 4 ° C al buio. </li><li> Lavare le cellule con 10 ml di PBS + e centrifugare 475 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Passare il composto sopra un altro filtro di nylon o filtro cella cap rispostare i detriti avanzi. Pipettare le cellule marcate in un tubo che è compatibile per il cell sorter. Mantenere le cellule in ghiaccio e protetti dalla luce fino al genere. </li><li> Preparare tubi di raccolta pipettando 1-2 ml di mezzi completi RPMI o FBS nel fondo dei tubi compatibili per la raccolta su un cell sorter. </li><li> Ordina l&#39;ingenuo cellule CD4 + T come CD4 + CD25 - CD62L + CD44 - popolazione (Figura 2). Lavare le cellule raccolte con mezzi completi RPMI e centrifugare come descritto sopra. </li><li> Risospendere il pellet in completo RPMI, contare le cellule naive, e regolare la concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> 5. Impostare la differenziazione in vitro <ol><li> Aspirare i pozzetti delle piastre rivestite anti-CD3 e anti-CD28 e lavare ogni pozzetto con 1 ml di PBS sterile (senza FBS). Per piastre 48 pozzetti, piastra 0,5 x 10 6 cellule / pozzetto in 0,5 ml di RPMI. Per piastre da 24 pozzetti, cultura 1 x 10 6 cellule / pozzetto in 1,0 ml di RPMI. </li><li> Se testare l&#39;influenza di un elemento quale un farmaco aggiungere la sostanza ai pozzetti appropriati sia prima, durante o dopo il processo di differenziazione seconda dell&#39;esperimento. Avanti, integrare il terreno di coltura con citochine e anticorpi bloccanti conseguenza. Th0: 30 U / ml di hIL-2. Th1: 15 ng / ml rmIL-12, 30 U / ml di hIL-2, e 5.000 ng / ml 11B11.Th2: 10 ng / ml rmIL-4, 30 U / ml di hIL-2, 2,000 ng / ml solubile 37.51, e 5.000 ng / ml XMG1.2. iTreg: 15 ng / ml hTGFβ, 30 U / ml HIL-2, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. Th17: 20 ng / ml rmIL-6, 3 ng / ml hTGFβ, 5.000 ng XMG1.2 / ml, e 5.000 ng / ml 11B11. NOTA: Le condizioni sopra esposte sono risultati essere ottimale per massimizzare la produzione di citochine misurata alla fine dell&#39;esperimento differenziazione (sezione Risultati rappresentativi). Tuttavia, ogni condizione deve essere ottimizzato per i singoli laboratori (Tabella 2 </strong&gt;). Inoltre, l&#39;aggiunta di anti-CD28 solubile in aggiunta al anti-CD28 piastra-bound è stato trovato per migliorare la produzione di citochine Th2 nel nostro laboratorio, ma non ha alcun effetto su altri sottogruppi di cellule T: </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con il 5% di CO 2 per 4-5 d prima analisi dell&#39;espressione genica e della produzione di citochine. In alternativa, rimuovere le cellule dagli stimoli TCR dopo 2 d, rettificato per 1 x 10 6 cellule / ml con mezzi freschi, e la piastra in nuovi pozzi (non rivestito) per migliorare la proliferazione e la resa finale. In questo caso, le citochine polarizzanti fresche e gli anticorpi non sono necessari, ma di 10 U / ml di IL-2 dovrebbero essere aggiunti nuovi media per Th0, Th1, Th2, e culture iTreg. </li></ol> 6. Analisi della Differenziazione <ol><li> Per l&#39;analisi di citochine mediante citometria a flusso, restimolare ogni pozzetto con 10ng / ml PMA e 1.000 ng / ml ionomicina o Tabella / ml anti-CD3 per 4-6 ore in presenza di un inibitore golgi come brefeldina A (1 mg1). Eseguire intracellulare colorazione citochine seconda dell&#39;esperimento (Figura 3). NOTA: Stain citochine o fattori di trascrizione, quali IL-4 (non mostrato) e IFNγ non specifico lineage (Figura 3) per colture Th17, per ciascuna condizione come controlli negativi e come indicatore dell&#39;efficienza differenziazione. Inoltre, macchia Foxp3 per culture Th17 come lo sviluppo reciproco delle Tregs può verificarsi con l&#39;aggiunta di TGFβ. </li><li> Per la quantificazione delle proteine, raccogliere il surnatante da ogni dosaggio bene e specifici citochine ELISA (Figura 3). Se si teme che il fattore in fase di test ha influenzato la proliferazione rispetto a campioni di controllo, le cellule possono essere lavati, contati, normalizzata, e quindi restimolati con 1 mg / ml di anti-CD3 per 24 ore prima di raccogliere surnatanti per test ELISA. Se saggiare IL-4 da Th2 è necessaria condizioni, lavaggio e restimolare rimuovere IL-4 che può essere leftover dalla cultura iniziale differenziazione. </li><li> Per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica mediante real time PCR, le cellule raccolto dopo il periodo di incubazione, lavare, normalizzano, e ri-stimolano per 2-6 h con 1 mg / ml di anti-CD3 prima della raccolta mRNA (Figura 3). </li></ol>

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<li>Reynolds, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+2+signaling+in+CD4%28%2B%29+T+lymphocytes+promotes+T+helper+17+responses+and+regulates+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 2 signaling in CD4(+) T lymphocytes promotes T helper 17 responses and regulates the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Immunity. 32 (5), 692-702 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pathogenic+TH17+cells+by+inducible+salt-sensing+kinase+SGK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of pathogenic TH17 cells by inducible salt-sensing kinase SGK1.</a> Nature. 496 (7446), 513-517 (2013).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+T%28H%2917+cells+in+the+absence+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-971 (2010).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Avni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T%28H%29+cell+differentiation+is+accompanied+by+dynamic+changes+in+histone+acetylation+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">T(H) cell differentiation is accompanied by dynamic changes in histone acetylation of cytokine genes.</a> Nat Immunol. 3 (7), 643-651 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. (9), (2007).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+naive+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naive CD4 T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765(2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfonodi estern...

Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell&#39;antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l&#39;eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull&#39;ambiente citochina presente durante l&#39;attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazione CD28 legatura, e la segnalazione di citochine. 1 le cellule helper tipo (Th1) sono caratterizzati dalla loro produzione effettore della citochina IFNγ nonché la loro esigenza di IL-12 di segnalazione durante il processo di differenziazione 3,4. Alla fine si è scoperto che le cellule Th1 differenziate hanno un profilo genetico che è più tipicamente caratterizzata by l&#39;espressione del fattore di trascrizione famiglia scatola T, Tbx21 (T-bet), che è considerato il principale regolatore del programma genetico Th1 5. Inoltre, IL-12 e IFNγ può promuovere espressione T-bet 6,7. Nella risposta immunitaria, le cellule Th1 sono importanti per la difesa contro i patogeni intracellulari e forti promotori di infiammazione autoimmune. In contrasto, cellule helper di tipo 2 (Th2) richiedono IL-4 per il loro sviluppo e le citochine effettrici, tra IL-4, IL-5 e IL-13, sono importanti per guidare le risposte delle cellule B e sono patogeni allergia 8, 9. Simile a cellule Th1, le cellule Th2 sono stati trovati ad esprimere la propria principale regolatore trascrizionale, chiamato GATA-3 10,11. È interessante notare la presenza di citochine polarizzanti e la generazione di una specifica linea Th sono antagonisti allo sviluppo di altri 2,12, suggerendo che solo un particolare sottoinsieme Th può diventare dominante durante un re immunitariorisposta. Poiché l&#39;identificazione delle linee Th1 e Th2, ulteriore lavoro ha dimostrato ancora più unica sottogruppi di cellule T helper, incluse follicolare helper (TFH), IL-9-produzione (Th9), e IL-22-produzione (Th22) (recentemente rivisto in 13). Ai fini di esperimenti di differenziazione in vitro, questo protocollo si concentrerà solo su due sottoinsiemi gi altri, chiamati cellule T regolatorie (Treg) e-17-producono IL cellule CD4 + T (Th17). Cellule T regolatrici CD25 + possono verificarsi in natura (nTreg) nel timo; cellule Th naïve possono anche essere indotti (iTreg) per diventare normativa in periferia (rivisto in 14,15). Entrambi i tipi di Tregs esprimono un fattore di trascrizione caratteristico, definito scatola forkhead P3 (Foxp3), che è critica per i loro meccanismi di soppressione effettori che includono la produzione solubili anti-infiammatori mediatore, IL-2 consumo, e delle cellule meccanismi contatto-dipendente 14,15. La mancanza di Foxp3 risultati espressione di una grave, multiorgano malattia autoimmune chiamati disregolazione immunitaria, poliendocrinopatia, enteropatia, la sindrome X-linked (IPEX), dimostrando il ruolo critico di questo sottoinsieme Th nel risolvere l&#39;infiammazione e regolazione tolleranza periferica di auto antigeni 16. In vitro, le cellule helper CD4 + T naive up-regolano Foxp3 e diventare impegnati nel programma Treg dopo stimolazione con IL-2 e TGF-β 14,15. Ci possono essere da moderata a notevole plasticità in linee cellulari T CD4 +, soprattutto se si considera solo la produzione di citochine (rivisto in 17,18). Tuttavia, ai fini di protocolli di differenziamento in vitro, discuteremo ogni sottoinsieme come un lignaggio unico. Recentemente, un sottogruppo di cellule Th17 che produce la citochina IL-17 è stato identificato come un lignaggio unico con funzioni pro-infiammatorie che sono particolarmente patogeni durante l&#39;infiammazione autoimmune 19-21. Cellule Th17 esprimono un fattore di trascrizione unico, chiamato retinoidi legati orfano recettore gamma t (RORγt) che coordina il programma genetico Th17 22. TGFβ è importante per la generazione di Th17 lineage attraverso l&#39;induzione di RORγt. Tuttavia, l&#39;effetto di segnalazione TGFβ è creduto per indurre unico impegno Th17 su synergizing con IL-6 (valutata in 12). Ulteriori studi hanno dimostrato che una varietà di altri segnali che possono regolare positivamente impegno Th17, comprese IL-1β, aumento del sodio, e TLR segnalazione 23-26. Altri studi hanno suggerito che i patogeni cellule Th17 in vivo sono quelli che ignorano di fatto la segnalazione TGFβ e invece si basano su una combinazione di IL-1, IL-6 e IL-23 per la loro differenziazione 27. Così, le cellule Th17 possono essere ricavati da una varietà di vie di segnalazione; ai fini del presente protocollo, comunemente usato il (TGFβ e IL-6), percorso per Th17 lineage impegnosarà presentato. I protocolli di differenziazione descritti di seguito per tutti i lignaggi effettrici si basa su anticorpi fisso come stimoli per il TCR e CD28 durante l&#39;intero corso dell&#39;esperimento. Tuttavia, altri hanno dimostrato che l&#39;attivazione TCR con l&#39;antigene cellule presentanti l&#39;28 o cross-linking anti-CD3 e anti-CD28 con anticorpi criceto per 2 giorni 29 sono anche mezzo altamente efficace per indurre la generazione di vari sottoinsiemi Th. Il protocollo presentato qui si basa su metodi precedentemente segnalati per isolare le cellule CD4 + T murine da organi linfoidi secondari 30 e la generazione di cellule Th17 31. Una differenza importante è che questo protocollo si basa sull&#39;utilizzo di un cell sorter isolare le cellule CD4 + T naive dai tessuti linfoidi. Tuttavia, molte aziende offrono ora i kit di separazione rapidi che possono arricchire le cellule T CD4 + naïve, che può essere in grado di bypassare il requisito fo l&#39;ordinamento seconda dell&#39;esperimento. I metodi e reagenti presentati in questo protocollo sono ciò che abitualmente usiamo e troviamo per essere il più efficace. Tuttavia, tenere presente che esistono reagenti e metodi alternativi per molti dei passi presentati di seguito e spetta al laboratorio individuo per determinare che cosa funziona meglio per i loro scopi.

<table><tbody><tr><td>RPMI completo:</td><td></td><td></td> <td>Riscaldare in un bagno d'acqua a 37 oC prima dell'uso</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10 % FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-mercaptoetanolo</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>100X 15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>rete di nylon da 120 micron</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>Taglio in quadrati da 2 cm2 e autoclave</td></tr><tr><td>Alternativa: filtri cellulari da 100 micron Fisher</td><td></td><td>08-771-19</td><td>Alternativa al taglio della rete di nylon</td></tr><tr><td>tampone di corsa autoMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>Scaldare a bagnomaria a 37 oC prima dell'uso</td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo autoMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>Scaldare a bagnomaria a 37 oC prima dell'uso</td></tr><tr><td>Perle CD4</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>tampone di lisi ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>Citochine:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Umane (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Topo ricombinante (rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R & D Systems</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R & D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>Utilizzare a 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>Utilizzare a 1:400</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>Utilizzare a 1:1000</td></tr><tr><td>anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>Utilizzare a 1:500</td></tr><tr><td>Phorbol&nbsp; 12-miristato 13 acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>Preparare un impasto a 0,1 mg/ml in DMSO e congelare le aliquote a -20 oC</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>Preparare un impasto a 0,5 mg/ml in DMSO e congelare le aliquote a -20 oC</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>Utilizzare a 1:1000</td></tr></tbody></table>

mouse naïve cd4<sup&gt; +</sup&gt; isolamento t cellulare e<em&gt; in vitro</em&gt; differenziazione in t sottopopolazioni cellulari

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Le cellule T CD4+ inesperte (naïve) dell'antigene subiscono espansione e differenziazione in sottogruppi effettori al momento del riconoscimento del recettore delle cellule T (TCR) dell'antigene affine presentato su MHC classe II. I segnali delle citochine presenti nell'ambiente al momento dell'attivazione del TCR sono un fattore importante nel determinare il destino effettore di una cellula T CD4+ naïve. Sebbene l'ambiente delle citochine durante l'attivazione delle cellule T naive possa essere complesso e coinvolgere sia segnali ridondanti che opposti in vivo, l'aggiunta di varie combinazioni di citochine durante l'attivazione delle cellule T CD4+ naive in vitro può facilmente promuovere la creazione di linee di helper T effettrici con l'espressione di citochine e fattori di trascrizione caratteristici. Tali esperimenti di differenziazione sono comunemente usati come primo passo per la valutazione di bersagli che si ritiene promuovano o inibiscano lo sviluppo di alcuni sottogruppi di helper T CD4+. L'aggiunta di mediatori, come agonisti di segnalazione, antagonisti o altre citochine, durante il processo di differenziazione può anche essere utilizzata per studiare l'influenza di un particolare bersaglio sulla differenziazione delle cellule T. Qui, descriviamo un protocollo di base per l'isolamento di cellule T naive dal topo e i passaggi successivi necessari per polarizzare le cellule naive a vari lignaggi di effettori T helper in vitro.

Il punto di tempo per l&#39;analisi di differenziazione può variare a seconda della condizione Th in prova e la forza di attivazione del recettore delle cellule T. Dopo 2-3 giorni di differenziamento, le cellule possono essere visualizzati al microscopio ottico per determinare l&#39;entità della proliferazione delle cellule T. Wells espositrici vasta proliferazione e aggregazione delle cellule saranno molto probabilmente pronti per l&#39;analisi al giorno 4. Condizioni di differenziazione si basa su l&#39;aggiunta di es...

Le cellule T CD4+ ingenue si polarizzano in vari sottoinsiemi a seconda dell'ambiente al momento dell'attivazione. La differenziazione delle cellule T CD4+ naive in vari sottogruppi di effettori può essere ottenuta in vitro attraverso l'aggiunta di stimoli recettoriali delle cellule T e segnali specifici delle citochine.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è polarizzare linfociti T CD4 positivi naïve isolati da linfonodi e milza di topo, indirizzandoli verso distinti sottogruppi di linfociti T helper. In vitro, ciò si ottiene innanzitutto processando milza e linfonodi prelevati da topi adulti di tipo selvatico. Nel secondo passaggio, la popolazione di cellule CD4 positive viene arricchita mediante separazione con microsferette magnetiche e successivamente ulteriormente selezionata in base all'espressione dei marcatori dei linfociti T naïve.Nell'ultimo passaggio, le cellule vengono trattate con fattori attivanti il recettore delle cellule T e citochine polarizzanti per indurre la loro differenziazione in diverse linee di cellule T helper. Infine, la citometria a flusso, il test ELISA e la PCR in tempo reale vengono utilizzati per valutare l'efficienza della differenziazione delle cellule T helper.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule T helper, ad esempio come l'espressione di specifiche molecole o il trattamento con farmaci specifici influisca sulla natura della risposta di una cellula T. Iniziare fissando gli arti di un topo C57BL/6 di età compresa tra cinque e dieci settimane al tavolo da dissezione, quindi tagliare longitudinalmente la pelle dall'ano al mento, avendo cura di non perforare il tessuto peritoneale sottostante. Successivamente, fissare la pelle aperta e utilizzare una pinzetta per afferrare il linfonodo e un'altra per separare il tessuto da ciascuna delle sedi indicate nell'immagine.Man mano che ciascun linfonodo viene prelevato, collocarlo in una piastra di raccolta contenente PBS integrato con 1% di FBS o PBS più, quindi aprire con attenzione il peritoneo ed asportare la milza. Posizionare anche la milza nella piastra di raccolta e trasferire la piastra in un contenitore con ghiaccio per arricchire le cellule positive al CD4. Suddividere i linfonodi e le milze in due piastre distinte da 60 millimetri contenenti tre millilitri di PBS più ciascuna, utilizzando pinze sterili.Successivamente, posizionare un quadrato di maglia sterile in nylon sulle milze e utilizzare il lato del pollice dello stantuffo di una siringa per schiacciarle delicatamente contro la maglia fino a quando quasi tutti i tessuti passano in sospensione. Passare la sospensione su e giù per alcuni cicli con una pipetta per rompere gli eventuali grumi solubili rimanenti, quindi posizionare un nuovo pezzo di maglia in nylon sull'apertura di un tubo conico da 15 millilitri. Filtrare la sospensione nel tubo per rimuovere qualsiasi detrito residuo.Ora ripetere la dissociazione meccanica per i linfonodi e riempire entrambe le provette di cellule filtrate con PBS più. Quindi capovolgere le provette alcune volte e centrifugare per raccogliere le cellule. Ri-sospendere il pellet di linfonodi in due millilitri di PBS.Aggiungere un millilitro di soluzione CK ghiacciata per topo al pellet di cellule spleniche. Dopo un minuto, arrestare la lisi dei globuli rossi con 10 millilitri di PBS più. Ribaltare il tubo e centrifugare nuovamente le cellule.Quindi risospendere il pellet di milza in altri 10 millilitri di PBS più, aggiungere le cellule dei linfonodi e centrifugare la sospensione cellulare combinata. Questa volta risospendere il pellet in 15 microlitri di microsferette magnetiche CD4 diluite in 85 microlitri di PBS più per topo, per 15-30 minuti a quattro gradi Celsius. Poi diluire le cellule in 10 millilitri di PBS più.Filtrare la sospensione attraverso un setaccio in nylon in un nuovo tubo da 15 millilitri e centrifugare le cellule. Successivamente, risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS più per topo e selezionare positivamente le cellule CD4 positive mediante selezione con microsferette magnetiche seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver ottenuto la frazione cellulare CD4 positiva, lavare le cellule in 10 millilitri di PBS più per isolare la frazione di linfociti T CD4 positivi.Successivamente, etichettare le cellule con gli anticorpi fluorescenti appropriati per 15-30 minuti a quattro gradi Celsius al buio, dopo il lavaggio. Filtrare le cellule etichettate per rimuovere eventuali detriti e trasferirle in un tubo FACS su ghiaccio, proteggendole dalla luce, per ordinare la popolazione CD4 positiva, CD25 negativa, CD62L positiva, CD44 negativa in mezzo RPMI completo. Quando tutte le cellule sono state raccolte.Lavare le cellule T naive in mezzo fresco e completo. Quindi risospendere il pellet e contare le cellule T naive in RPMI completo, quindi regolare la concentrazione a un milione di cellule per millilitro per indurre la differenziazione in vitro dei sottogruppi di cellule T helper. Successivamente, lavare ogni pozzetto di piastre per colture cellulari precedentemente rivestite con anti-CD3 e anti-CD28 in un millilitro di PBS sterile privo di FBS e seminare le cellule.Le cellule infine integrano il mezzo di coltura con le citochine appropriate e con anticorpi bloccanti, come indicato nella tabella, e incubano le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per quattro o cinque giorni, dopo quattro o cinque giorni di coltura. È possibile eseguire la colorazione intracellulare delle citochine nei linfociti T positivi per CD4 derivati dalle colture di TH1, TH2, treg induttivi e TH17 differenziati in vitro. Questo per confermare che ciascun sottoinsieme di linfociti T presenti il profilo di citochine previsto.Effettivamente, dopo 24 ore di restimolazione con EIS anti-CD3, A mostra che i sottoinsiemi esibiscono anche la corrispondente produzione extracellulare delle proteine citochiniche espresse intracellularmente. La PCR in tempo reale per i fattori di trascrizione specifici della linea conferma ulteriormente i profili appropriati dei fattori di trascrizione dei sottoinsiemi di linfociti T CD4 positivi differenziati in vitro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare ed elaborare cellule dei linfonodi e della milza per ottenere linfociti T helper naïve CD4 positivi.Inoltre, sarai in grado di differenziare queste cellule T in TH1, TH2, TH17 o cellule ireg.

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Isolamento dei linfociti utilizzando il kit di Miltenyi MAC è un modo affidabile per purificare le cellule da tutta omogenati di tessuto linfoide. Cellule purificate utilizzando il sistema Miltenyi sono tipicamente ≥ 96% puro. Qui, le misure prese per isolare cellule T CD4 +, uno dei tanti kit offerto da Miltenyi.

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Mouse Naïve CD4

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