Mouse Naïve CD4 ⁺ Isolamento T cellulare e In vitro Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

L'obiettivo generale della seguente procedura è quello di polarizzare quattro cellule T positive CD naive isolate dai linfonodi di topo e le milze in sottogruppi distinti di T helper. In vitro, ciò si ottiene elaborando prima la milza e i linfonodi raccolti da topi adulti di tipo selvatico. Nella seconda fase, la popolazione di quattro cellule CD-positive viene arricchita mediante separazione di biglie magnetiche e quindi ulteriormente ordinata in base all'espressione naïve del marcatore delle cellule T.

Nella fase finale, le cellule vengono trattate con fattori attivanti il recettore delle cellule T e citochine polarizzanti per indurre la loro differenziazione in vari lignaggi T helper. Infine, citometria a flusso. L'Elis A e la PCR in tempo reale vengono utilizzati per valutare l'efficienza della differenziazione delle cellule T helper.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule T helper, ad esempio in che modo l'espressione di molecole specifiche o il trattamento con farmaci specifici influenzano la natura della risposta di una cellula T. Inizia fissando gli arti di un topo nero di 5-10 settimane di età compresa tra cinque e 10 settimane alla tavola da dissezione, quindi taglia la pelle longitudinalmente dall'ano al mento, facendo attenzione a non perforare il tessuto peritoneale sottostante. Quindi, apri la pelle con un perno e usa un paio di pinze per afferrare il linfonodo e un altro per separare il tessuto da ciascuna delle posizioni indicate nell'immagine.

Man mano che ogni linfonodo viene raccolto, metterlo in una capsula di raccolta contenente PBS integrato con l'1% di FBS o PBS plus, quindi aprire con cura il peritoneo e rimuovere la milza. Metti anche la milza nella capsula di raccolta e trasferisci la piastra in un secchiello del ghiaccio per arricchire per il CD quattro celle positive. Dividi i linfonodi della milza in due piastre separate da 60 millimetri contenenti tre millilitri di PBS più ciascuna usando una pinza sterile.

Quindi, posiziona un quadrato di rete di nylon sterile sulle milze e usa il lato del pollice di uno stantuffo della siringa per schiacciarle delicatamente contro la rete fino a quando quasi tutto il tessuto va in sospensione. Tubi la sospensione su e giù un paio di volte per rompere i grumi solubili rimanenti e poi posizionare un nuovo pezzo di rete di nylon sopra l'apertura di un tubo conico da 15 millilitri. Filtrare la sospensione nel tubo per rimuovere eventuali detriti rimanenti.

Ora ripeti la dissociazione meccanica per i linfonodi e riempi entrambe le provette di cellule filtrate con PBS plus. Quindi capovolgere le provette un paio di volte e far girare le cellule. Risospendere il pellet linfonodale in due millilitri di PBS.

Aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo, una soluzione CK per topo al pellet di cellule della milza. Dopo un minuto, interrompere la lisi dei globuli rossi con 10 millilitri di PBS plus. Capovolgere il tubo e far girare nuovamente le cellule.

Quindi risospendere il pellet di milza in altri 10 millilitri di PBS plus, aggiungere le cellule linfonodali e far girare la sospensione cellulare raggruppata. Questa volta, risospendere il pellet in 15 microlitri di CD, quattro perle magnetiche diluite in 85 microlitri di PBS plus per topo per 15-30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi diluire le cellule in 10 millilitri di PBS plus.

Filtrare la sospensione attraverso un filtro di nylon in un nuovo tubo da 15 millilitri e far girare le cellule. Anche in questo caso, far girare nuovamente il pellet in 100 microlitri di PBS plus per topo e selezionare positivamente per il CD quattro celle positive mediante selezione di biglie magnetiche secondo le istruzioni del produttore. Dopo aver ottenuto la frazione cellulare positiva positiva di CD, lavare le cellule in 10 millilitri di PBS plus per selezionare la frazione di cellule T positive di CD quattro.

Quindi, etichettare le cellule con gli anticorpi fluorescenti appropriati per 15-30 minuti a quattro gradi Celsius al buio dopo il lavaggio. Filtrare le celle etichettate per rimuovere eventuali detriti e trasferirle in un tubo fax su ghiaccio e proteggerlo dalla luce, smistare la popolazione CD quattro positivi, CD 25 negativi, CD 62 L, CD 44 negativi positivi in un mezzo RPMI completo. Quando tutte le celle sono state raccolte.

Lavare le cellule T naive in un terreno fresco e completo. Quindi risospendere il pellet e completare l'RPMI, contare le cellule T naive e regolare la concentrazione a una volta 10 per sei cellule per millilitro per indurre la differenziazione in vitro del sottogruppo T helper. Successivamente, lavare ogni pozzetto delle piastre per colture cellulari precedentemente rivestite con anti CD tre e anti CD 28 in un millilitro di PBS sterile privo di FBS e piastra.

Le cellule infine integrano i terreni di coltura con le citochine appropriate e gli anticorpi bloccanti come indicato nella tabella e incubano le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per quattro o cinque giorni dopo quattro o cinque giorni in coltura. È possibile eseguire la colorazione intracellulare con citochine delle quattro cellule T positive CD dalle colture in vitro differenziate di TH uno, TH due treg inducibili e TH 17. Confermare che ogni sottogruppo di cellule T mostra il profilo di citochine atteso.

Infatti, dopo 24 ore di restimolazione con tre EIS anti CD, A mostra che i sottogruppi mostrano la corrispondente produzione extracellulare delle proteine citochiniche espresse anche a livello intracellulare. La PCR in tempo reale per fattori di trascrizione specifici per il lignaggio verifica ulteriormente i profili dei fattori di trascrizione appropriati dei quattro sottogruppi di cellule T positive per CD differenziati in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare ed elaborare le cellule dei linfonodi e della milza speculari per ottenere quattro cellule T helper positive per la CD naive.

Inoltre, sarai in grado di differenziare queste cellule T in cellule TH uno, TH due TH 17 o ireg.