Name: Etichettatura Viral-mediata e trapianto di Medial gangliari Eminenza (MGE) Celle per In Vivo Studi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Scopri la trasduzione virale di progenitori GABAergici MGE per studi di neuroscienza in vivo. Questa tecnica consente l'etichettatura specifica e il trapianto in corteccia ospite per analizzare l'integrazione neuronale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a JLRR da: Autism Speaks, Nina Irlanda, Weston Havens Foundation, NIMH R01 MH081880, e NIMH R37 MH049428. PRW è stato sostenuto da una borsa di studio dal National Science Council di Taiwan. SFS è stato sostenuto da F32 (MH103003).

Dichiarazione etica: Le seguenti procedure sono state approvate dal nostro protocollo istituzione e animali. Assicuratevi di ottenere l&#39;approvazione per tutte le procedure che comportano interventi chirurgici di sopravvivenza prima di iniziare gli esperimenti e verificare tutti i protocolli siano aggiornati. 1. Lentivirus Preparazione (Fase Opzionale) <ol><li> Split tre 10 piatti di cellule HEK293T cm per ogni lentivirus da effettuare, alla presenza di 10 ml DMEM / 10% FBS, e crescere a ~ 60-70% di confluenza. Grow cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Trasfettare i seguenti plasmidi DNA (10 mg totali) in ogni piatto con un reagente di trasfezione: 6.4 mg CAG-Flex-GFP vettori lentivirali (sequenza di DNA del vettore di cui alla tabella 1), 1.2 mg pMD2.G (codifica VSV-g), 1.2 mcg pRSV-Rev, e 1,2 mg pMDLg / pRRE. I tre vettori lentivirali imballaggio sono disponibili in commercio (Tabella Nota: Questo particolare approccio utilizza generazione lentivir 3 °AL vettori ma vettori di 2 ° generazione e plasmidi associati anche lavorare. </li><li> Preparare un contenitore di rifiuti contenente una soluzione di candeggina al 10% entro un cappuccio BSL2 certificato per inattivare eventuali soluzioni o dispositivi che hanno contattato o che contengono lentivirus. Avanti, rimuovere completamente i media 4-6 ore dopo la trasfezione nella soluzione di candeggina, sostituire con lo stesso volume di nuovi media, e permettono alle cellule di crescere. </li><li> Dopo 4 giorni, raccogliere i media in 50 ml provette coniche e centrifugare a 1000 xg per 15 minuti per far sedimentare i detriti cellulari. Successivamente, filtrare il surnatante con una membrana da 0,45 micron. Ogni proteina filtro vincolante basso, come PVDF, funziona bene. Attenzione: posto sia i rifiuti solidi e liquidi virale nella soluzione di candeggina. </li><li> Carico 30 ml filtrati surnatante in provette ultracentrifuga e in un&#39;ultracentrifuga. Centrifugare a 100.000 xg per 2,5 ore a 4 ° C. Aprire le provette in un cappuccio BSL2 e rimuovere il surnatante in 10% Bleach. Aggiungi ~ 100 ml di PBS al pellet, che produce titoli di 1x10 ^ 7-8 infettive unità / ml. Aliquota della giornata e negozio successivo a -80 ° C. Lentivirus aliquote sono stabili a -80 ° C per almeno sei mesi. </li><li> Considerazione importante: molte istituzioni hanno ora core virali. Acquisire virus concentrato con un titolo minimo di 1x10 7 infettive unità / ml, per ottenere risultati ottimali. </li></ol> 2. I topi donatori per MGE Dissection <ol><li> In primo luogo, impostare un accoppiamento a tempo tra una linea Cre-espressione di interessi e di un wild type (WT) mouse o un mouse che esprimerà un giornalista dopo ricombinazione Cre-mediata. Nota: Molte linee Cre driver sono transgenici e sono mantenuti e allevati in stato emizigote. Pertanto, solo la metà degli embrioni conterrà il transgene Cre. DNA può essere rapidamente preparato dagli embrioni per un breve PCR per rilevare l&#39;allele Cre. I + embrioni Cre possono essere raccolte in modo che venga utilizzato solo il tessuto MGE del genotipo desiderato. Alternativamente, un reporter Cre-dipendente può essere utilizzato, per selezionare gli embrioni per MGE dissezione e di trapianto. </li><li> Calcola che giorno corrisponderà E13.5. Se gli animali sono stati accoppiati la sera prima, il giorno della spina è 0,5. Ordine topo gravide temporizzata o una femmina con i cuccioli WT P1 per tempo avere postnatale (P) 1 topi nel giorno del tessuto del donatore sarà E13.5. In alternativa, impostare queste accoppiamenti in casa una settimana prima l&#39;accoppiamento degli animali donatori. Nota: La prima strategia di generare sia E13.5 e embrioni P1 / cuccioli per lo stesso giorno è spesso difficile da fare in modo affidabile. </li></ol> 3. Preparazione di media, strumenti e attrezzature. <ol><li> Preparare i reagenti e gli strumenti per la preparazione di cellule MGE (Tabella 2). <ol><li> Preparare una superficie pulita e posizionare pinze pulite, forbici e un coltello o microchirurgico o pinza sottile (per una precisa dissezione dei tessuti) sulla superficie. </li><li> Preparare la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), fo dissezione, e mezzo di Eagle modificato di Dulbeco (DMEM) con il 10% fetale bovino surem (FBS), per la trasduzione. </li><li> Preincubare 20-30 ml DMEM / 10% FBS in un tessuto C cultura incubatore 37 ° per circa 1 ora. Il coperchio deve essere allentato per permettere lo scambio di gas e pH equilibrio dei media. Nota: La preincubazione dei media può essere preparata poco prima di iniziare la dissezione. </li></ol></li></ol> 4. MGE cellulare Preparazione <ol><li> Sacrifica il mouse incinta secondo un protocollo animali approvato e rimuovere gli embrioni in una capsula di Petri 10 centimetri contenente ghiacciata HBSS. </li><li> Rimuovere il cervello da ogni embrione utilizzando un ambito dissezione (fare uno alla volta, lasciando il resto degli embrioni in ghiacciata HBSS) e quindi procedere a tagliare il tessuto MGE. Nota: Si riporta di seguito, e in Figura 1, sono passaggi chiave che mostrano come rimuovere il MGE. Inoltre, la figura 2 è un film che mostra tutta la dissezioneprocedura. <ol><li> Posizionare il cervello con lato ventrale rivolto verso l&#39;alto (figure 1A, A &#39;). Nota: è anche giusto avere la dorsale verso l&#39;alto. Tagliare il cervello a metà lungo il piano sagittale per generare due pezzi. Un esempio hemisected cervello viene mostrato (figure 1B, B &#39;), notare che dorsale (la corteccia sovrastante) e gli aspetti ventrale del coperchio cervello e circondano il tessuto eminenza gangliare (GE). </li><li> Poi, con la mano dominante, tenere sia pinza molto sottili o un stabknife (tabella 2), mentre immobilizzare l&#39;emisfero con una pinza detenuti da una mano non dominante. (Mediale del dell&#39;emisfero deve essere rivolto verso l&#39;alto). Aprire la dorsale e ventrale del tessuto con una pinza e un coltello pugnalata per rivelare il tessuto sottostante GE (Figura 1C e schematizzato in figura 1C &#39;). Nota: la rimozione alcuni media dal piatto dissezione di Petri può rendere più facile per stabilizzare il tessuto mentre performing la dissezione MGE. </li><li> Fare tagli rettilinei con stabknife o una pinza sottile per separare la CGE, LGE e tessuti del setto (vedi esempio tagli indicati con colore rosso linee tratteggiate, figure 1D e D &#39;). Questi tagli possono essere realizzati in qualsiasi ordine. Nota: Immaginate il MGE come una &#39;scatola&#39; che è tagliato fuori dal tessuto circostante. In questo modo contribuisce a rendere riproducibile tagli simili per ogni dissezione, riducendo così la variabilità in dissezioni dei tessuti. </li><li> Infine, girare il MGE su un lato e tagliare la parte inferiore (quella che era la parte laterale del cervello). Questo elimina la zona manto della MGE (scartare nelle figure 1E e 1E &#39;) dal resto del MGE. L&#39;ultimo aspetto della MGE contiene zone prevalentemente ventricolare e porzioni zona subventricolare di MGE, che contiene quasi tutte le cellule progenitrici MGE. Procedere con questo tessuto. </li></ol></li><li> Considerazione importante: L&#39;aggiunta di gel di silicone al fondo di una capsula di Petri can servire come un eccellente superficie dissezione in quanto protegge le delicate punte di pinza e fornisce una superficie morbida per appuntare il tessuto con una pinza. </li></ol> 4.3 strategie aggiuntive per MGE Dissection. <ol><li> Tagliare la pelle dell&#39;embrione con pinze come le forbici per rimuovere rapidamente il cervello. Come l&#39;embrione depone su un lato, tenere il tessuto alla base della testa con le pinze utilizzati per ancorare il tessuto. In primo luogo, tagliare anteriore ventrale al cervello e posteriore ventrale al cervello, e quindi collegare i due tagli lungo il lato dell&#39;embrione. Poi afferrare il lembo di pelle e tirarlo sopra la parte superiore del cervello. Il cervello può essere rapidamente sezionato dal tessuto rimanente. </li><li> In alternativa, ancorare la faccia posteriore tutto il cervello dietro la corteccia. Nel frattempo, afferrare ciascun emisfero all&#39;aspetto caudale più dorsale della corteccia e strappare la corteccia lontano dal tessuto ancorata in direzione anteriore. In questo modo, sia cortices possono essere rimossi e le eminenze gangliari bilaterali sono rivelati, ancora attaccato al resto del tessuto preservare l&#39;anatomia mediale-laterale. </li><li> Passare alla pugnalata coltello per fare tagli precisi in tutto il MGE su ogni emisfero. Utilizzare un set pulito separata di pinze per raccogliere il MGE o una pipetta con una grande punta (es., P1000). Nota: Mantenere il tessuto raccolti lontano da ogni altro materiale sezionato, come alcuni media è inevitabilmente trasferito quando il MGE viene raccolto. </li><li> Raccogliere il MGE e mettere il tessuto in una provetta da 1,5 ml di raccolta contenente DMEM / 10% FBS, (un volume di 500 microlitri è sufficiente per raccogliere i MGEs). Ripetere l&#39;operazione per l&#39;altro emisfero e luogo nello stesso tubo di raccolta. I campioni in ghiaccio fino a quando tutti i tessuti vengono raccolti. </li></ol> 5. etichettatura lentivirali e Trapianti <ol><li> Spostare i tubi di tessuto MGE in una cappa BSL2 certificato e rimuovere il supporto. Nota: IlTessuto MGE è abbastanza grande da essere visibili a occhio e si depositano sul fondo della provetta consentendo media fredde per essere facilmente e delicatamente rimossi. </li><li> Aggiungi ~ 500 ul dei media DMEM / 10% FBS, che è stato preincubata in un 37 ° C tessuto cultura incubatore. Successivamente, aggiungere polibrene facilitare trasduzione a ciascun tubo ad una concentrazione finale di 8 mg / ml. Triturare il tessuto MGE per creare una sospensione di cellule singole, con una punta P1000 pipetta. Infine, aggiungere ~ 15-20 ml di lentivirus concentrato ad ogni provetta. </li><li> Considerazione importante: Una triturazione di 10-12 volte è sufficiente a rompere il tessuto MGE da un unico embrione, ma più triturazioni può essere richiesto se più MGEs sono raggruppate. Provate diverse condizioni triturazione per determinare che cosa funziona meglio. </li><li> Chiudere bene ogni tubo, miscelare, di luogo tutti i tubi in un C incubatore 37 °. Incubare le cellule in lentivirus per almeno 30 minuti e fino a 1 ora. Tempi più lunghi hanno portato a devitalità cellulare sgualcito. Invertire i tubi ogni 10 minuti fino a quando il tempo è scaduto. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con lentivirus, togliere i tubi dal incubatore e centrifugare a ~ 700 xg per 3 minuti per far sedimentare le cellule. Nel cofano BSL2, rimuovere il surnatante e gettarlo in candeggina al 10%. Successivamente, aggiungere 1 ml DMEM / 10% FBS e triturare il pellet 2-3 volte per lavare, centrifugare di nuovo alla stessa velocità per sedimentare le cellule. Ripetere questo lavaggio-passo 2-3 più volte per rimuovere il virus in eccesso. Nota: Eseguire le operazioni di centrifugazione a 4 ° C, tuttavia, ridotta vitalità non è stato osservato quando brevi rotazioni vengono eseguite a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il più media come possibile e mettere ogni tubo in ghiaccio. Grazie ai media residua sui lati del tubo, ~ 2-3 microlitri di supporti finirà copre il pellet dal tempo della procedura di trapianto è iniziato. </li></ol> 6. Trapianti e Validazione <ol><li> Acquisire cuccioli P1 ospitanti e preparare la proceduraArea spruzzando giù con il 70% di etanolo. Per mantenere la sterilità durante la procedura si raccomanda di eseguire queste procedure in una stanza pulita procedura dedicata. Inoltre, utilizzare uno strumenti chirurgici autoclavato sterilizzare le superfici che i cuccioli saranno in contatto con con il 70% di etanolo. Un esempio di equipaggiamenti rappresentativi necessari per effettuare trapianti e un&#39;area procedimento rappresentativo è mostrato in Figura 3. </li></ol> Nota: Mentre questo procedimento è una iniezione di piccoli volumi, e non una procedura chirurgica che richiederebbe un&#39;incisione, ferita aperta o suture, è comunque raccomandato che una nuova micropipetta viene utilizzato per ogni mouse da iniettare. Le micropipette sono sterilizzati calore quando tirato e smussato su una superficie che è stata spruzzata con etanolo al 70% immagazzinato in un contenitore sigillato. <ol><li> Generare micropipette avere un diametro di punta tra i 40-80 micron. A seguito di queste dimensioni sarà resa ottimalerisultati. Calore sterilizzare le micropipette quando tirato e smussato su una superficie e spruzzare con il 70% di etanolo prima di riporre le micropipette in un contenitore sigillato. Nota: In alternativa, se l&#39;accesso ai dispositivi necessari per creare questi aghi (Tabella 2) è limitante, utilizzare qualsiasi altro dispositivo di iniezione. Tuttavia, questi non possono essere adatti come le micropipette causa di diversi diametri. </li><li> Elaborare olio minerale in una siringa da 1 ml, e con un ago 30 G 1/2, riempire completamente la pipetta di vetro con olio minerale. Successivamente, montare il pistone sul dispositivo stereotassico, quindi collegare la pipetta di vetro al dispositivo di carico e stereotassico sul pistone. Utilizzando l&#39;unità idraulica, sposta lo stantuffo a metà strada nella pipetta di vetro, la rimozione di olio minerale che si riversa con un pulito un tovagliolo di carta pulito. <ol><li> In alternativa all&#39;utilizzo di una siringa, immergere l&#39;estremità posteriore della pipetta in olio minerale e riempito per azione capillare. Per evitare bolle d&#39;aria nel pipette, mantenere la pressione positiva sulla siringa fino completamente fuori dalla pipetta di vetro. Nota: Altri dispositivi possono essere utilizzati per trapiantare con successo cellule MGE 14. Qualsiasi dispositivo in grado di fornire un volume inferiore o vicino 100 opere nl anche per questa procedura. </li></ol></li><li> Quindi, utilizzare un tovagliolo di carta sterili, o qualsiasi materiale assorbente, con l&#39;angolo contorto in una punta sottile per rimuovere delicatamente l&#39;eccesso dei media sopra il pellet MGE. Questo passaggio concentra la densità cellulare in modo che i volumi di iniezione più piccoli possono essere raggiunti. Avanti, utilizzare un volume basso (P2 è preferito) pipetta di elaborare lentamente il pellet e triturare 1-2 volte prima di passare la sospensione cellulare su una superficie idrofobica. Il volume dovrebbe essere appena sotto 1 ml. Spostare la punta dell&#39;ago nella sospensione cellulare e con il motore idraulico, elabora la sospensione cellulare nella pipetta. </li><li> Anestetizzare un cucciolo P1 tramite ipotermia (avvolgere in un guanto in lattice e messo in ghiaccio per ~ 2-4 minuti).Verificare l&#39;efficacia di anestesia con uno stimolo nocivo. Pizzica la pelle tra le dita dei piedi con una pinza sottile: il cucciolo deve essere insensibile se pizzicato. Quindi, posizionare il cucciolo su uno stampo che si trova sotto il dispositivo di iniezione, quindi rendere la pelle tesa tirando indietro la pelle sulla testa e fissare con nastro adesivo di laboratorio standard. Nota: Durante l&#39;ipotermia è molto efficace su topi e si traduce in basso tasso di mortalità neonatale, le procedure devono essere fatte in fretta, come cuccioli cominceranno a recuperare in meno di 10 min. Inoltre, 4 min in ghiaccio è un limite superiore di ciò che può essere tollerato. Cercate di indurre ipotermia solo una volta se è richiesto un tempo più lungo per preparazioni iniettabili. Tuttavia, se un cucciolo recupera presto, prima permettere al cucciolo di riprendersi completamente prima di indurre nuovamente ipotermia. Inoltre, solo indurre ipotermia uno più tempo per eseguire le iniezioni. Pups si riprenderà entro 5-10 minuti di ipotermia. Questo può essere facilitato mettendo i cuccioli con lettiera e la mamma o mettendo il cucciolo in un surfac caldoe per recuperare. </li><li> Utilizzando un dispositivo stereotassico, posizionare la punta della pipetta di vetro sulla superficie sulla testa del cucciolo, perpendicolare alla superficie della testa. Quando la pipetta è in contatto con la testa, considerare questo come &#39;0&#39;. Successivamente, spingere la pipetta attraverso la superficie della pelle e del cranio nella corteccia, quindi inserire e ritirare la pipetta ~ 2 volte prima di fermarsi. Per ottimale il targeting delle cellule nella neocorteccia, iniezioni vengono eseguite quando la micropipetta è ad una profondità di 0,1 mm. Tuttavia, questo dovrebbe essere ottimizzato dall&#39;utente (vedi nota sotto). Nota: Durante questa profondità si rivolge in modo affidabile gli strati più profondi neocorticali con i dispositivi sopra descritti, alcuni profondità dovrebbe essere testato determinati empiricamente. Inoltre, un campo di profondità in posizione rostro-caudale e medio-laterale differente deve essere testato per determinare quali profondità è ottimale in ogni sito. Inoltre, la puntura iniziale deve essere rapida, come lenta penetrazione nella neocorteccia diminuisce la capacità di cleanly penetrare il tessuto. Provare diverse velocità al primo avvio di questa procedura per trovare ciò che funziona meglio. Inoltre, per le coordinate di prova, non esiste un vero sostituto per l&#39;utilizzo di cellule marcate, come i coloranti sono stati inaffidabili per indicare la posizione. </li><li> Una volta che l&#39;ago è in posizione, ruotare il dispositivo idraulico per avanzare lo stantuffo nella pipetta di vetro, spingendo un determinato volume di sospensione cellulare nella corteccia. Iniettare 50-70 nls per sito. Ripetere questa procedura in 3-6 siti diversi a diversi livelli rostrale-caudale se l&#39;obiettivo è quello di ottenere una vasta distribuzione delle cellule in tutto il neocorteccia. Nota: I volumi di 100 nl o superiori possono causare lesioni e portare a grandi ciuffi di cellule iniettate che non riescono a migrare in modo efficiente del sito di iniezione. Così, volumi di iniezione più piccoli (~ 70 nl o meno) sono ottimali, su più siti se il tempo lo permette. </li><li> Quando le iniezioni sono, rimuovere il cucciolo dal palco e segnare (tep clipping è un modo affidabile per identificare il pups in seguito). Una volta che il cucciolo ha recuperato ed è in grado di muoversi da solo (questo avviene in pochi minuti di rimuoverli dal palco), la rimise con la mamma e la lettiera. Nota: Dal momento che si tratta di una procedura minimamente invasiva non ci sono procedure di post-chirurgiche, una volta che il cucciolo è liberi di muoversi e riscaldato. Tuttavia, cuccioli devono essere controllati, non solo dopo la procedura, ma anche il giorno seguente per assicurare non hanno segni di deterioramento della salute. </li><li> Prima di avviare la procedura sul successivo cucciolo, spruzzare giù la zona con etanolo al 70% per mantenere una zona di lavoro sterile. Lasciare i cuccioli iniettati di sviluppare e poi valutare il tessuto in fase di sviluppo appropriato (s). </li></ol>

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<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+in+prefrontal+cortex+receive+subtype-specific+forms+of+excitation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons in prefrontal cortex receive subtype-specific forms of excitation and inhibition.</a> Neuron. 81 (1), 61-68 (2014).</li>
<li>Chen, Y. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%E2%80%9CMGE+Enhancers%E2%80%9D+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+%28MGE%29+Progenitors+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PLoS ONE. 8 (5), e61956(2013).</li>
<li>Pattabiraman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+enhancers+active+in+protodomains+of+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of enhancers active in protodomains of the developing cerebral cortex.</a> Neuron. 82 (5), 989-1003 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L&#39;uso di precursori degli interneuroni GABAergici corticale dalle eminenze gangliari embrionali (GES) per le terapie cellulari basate sta mostrando la promessa per molte condizioni 12 -1 4. Sono necessarie tecniche molecolari precisi per monitorare, ed esprimere geni di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni. Qui forniamo un protocollo dettagliato per etichettare le cellule MGE embrionali con lentivirus prima del trapianto e mostriamo come questa tecnica può essere usata per esprimere geni di ...

GABAergici interneuroni corticali costituiscono ~ 20-30% dei neuroni nella neocorteccia dei mammiferi, mentre il resto corrisponde a eccitatori, principali neuroni glutamatergici. Interneuroni sono molto diverse nelle proprietà elettrofisiologiche, assoni e dendriti morfologia e sinaptica mira 1, e gli squilibri in eccitatoria tono / inibitorio Si ipotizza che alla base di alcuni fenotipi di disturbi neuropsichiatrici / neurologici, tra cui l&#39;autismo, la schizofrenia e l&#39;epilessia 2. L&#39;obiettivo generale del protocollo qui descritto è quello di fornire un mezzo per modificare in modo efficiente geneticamente GABAergici progenitori degli interneuroni corticali prima del trapianto in vivo per le analisi. Interneuroni GABAergici corticale nascono in eminenze gangliari mediale e caudale (MGE e CGE, rispettivamente) 3,4, così come la zona preottica 5. Progenitori degli interneuroni corticali sottoposti seguita a lunga distanza di migrazione tangenzialedalla migrazione radiale per raggiungere i loro obiettivi finali. All&#39;arrivo a destinazione, questi interneuroni corticali devono integrarsi correttamente nella rete neuronale esistente, e ogni sottogruppo interneurone unica contribuirà alla circuiteria corticale in modi specifici. Quattro sottogruppi principali possono essere distinti da marcatori molecolari: somatostatina MGE-derivato (SST) + e parvalbumina (PV) + sottogruppi, e CGE-derivati ​​peptide intestinale vasoattivo (VIP) + e Reelin +; SST - sottogruppi 6. Diversi sottogruppi interneuroni corticali sono nati più di momenti diversi durante lo sviluppo embrionale nel MGE e CGE 7, 8. Questi e altri corticali marcatori interneuroni GABAergici sono stati utilizzati per generare specifiche linee di Cre-driver per molti di questi sottogruppi 9-11. Il trapianto di progenitori MGE è emersa come una terapia cellulare potenziale per il trattamento di disturbi che possono essere causati da squilibriin eccitazione / inibizione 12 - 24. Questi benefici terapeutici possono essere dovuti in parte alla capacità unica di progenitori MGE (per disperdere, differenziare e integrare in un cervello host), o potenzialmente perché molti peri-somatiche PV inibitorio + cellule derivano dalla MGE. Cellule MGE possono anche essere rapido ed efficiente trasdotte con lentivirus prima del trapianto 15, consentendo alle cellule che sono geneticamente modificati in vitro da studiare in vivo. Il razionale per lo sviluppo di questo approccio è stato quello di superare i blocchi stradali in studio GABAergici sviluppo interneuroni corticale e la maturazione. In particolare, MGE il trapianto ha permesso ai ricercatori di studiare lo sviluppo di cellule mutanti in vivo, quando il mouse mutante avrebbe altrimenti morto in un punto di tempo in anticipo. Inoltre, introducendo geni di interesse prima del trapianto, gli effetti di geni specifici su un fenotipo mutante possono essere valutati in un effmaniera icient. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per trasdurre cellule MGE con lentivirus prima del trapianto. Inoltre, si mostra come questa tecnica può essere adattato per esprimere un gene di interesse in specifici sottogruppi di interneuroni da un gruppo eterogeneo di precursori degli interneuroni corticali, utilizzando una combinazione di lentivirus espressione Cre-dipendenti e disponibili linee del mouse Cre-driver. Inoltre, questo protocollo introduce tecniche e una piattaforma per i ricercatori di modificare geneticamente GABAergici precursori degli interneuroni corticali per studi in vivo in un modo unico. Un vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci attuali è che le cellule trapiantate MGE si disperderanno di distanza dal sito di iniezione. Inoltre, a differenza di iniezioni virali focali, dopo che le cellule MGE disperdono la loro morfologia è più facile da valutare. Questo approccio può essere usato per studiare l&#39;effetto di introdurre geni di interesse in tipo selvatico o mutante cellule, introducendo un tipo di cellula specificogiornalista per valutare la morfologia, o potenzialmente per studiare l&#39;effetto della malattia alleli in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenti e attrezzature per il trapianto di cellule MGE</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>REF 309602</td><td>BD, Becton Dickinson e azienda</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30 1/2 G</td><td>305106</td><td>BD, Becton Dickinson e azienda</td><td></td></tr><tr><td>Foro di precisione per fornire 5 &micro; l (viene fornito con stantuffo)</td><td>5-000-1005</td><td>Drummond società</td><td></td>scientifica</tr><tr><td>Parafilm</td><td>PM-999</td><td>Polysciences, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio con bracciolo **</td><td>MZ6</td><td>Leica</td><td></td></tr><tr><td>Digital solo per topi strumento stereotassico **</td><td>51725D</td><td>Stoelting company</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore fine oleodinamico ad asse singolo **</td><td>MO-10</td><td>Narishige</td><td></td></tr><tr><td>Smussatrice rotante rivestita di diamante</td><td>prodotta in casa</td><td></td>Estrattore per pipette ad ago 730 Kopf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td> strumenti</td><td></td></tr><tr><td>Olio</td><td></td> minerale <td>Qualsiasi farmacia o farmacia</td><td></td></tr><tr><td>Qualsiasi pipetta e puntali che possono essere affidabili misura 1 &micro; l di volume</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">** Questi sono i modelli particolari che usiamo, ma molte altre configurazioni dovrebbero funzionare</td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti opzionali (per fare Lentivirus)</td></tr><tr><td>25 mm, 0.45 &micro; m filter</td><td>09-719B</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ultra-trasparenti (25 x 89 mm)</td><td>344058</td><td>Beckman Coulter&reg;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 (formato da 1,5 ml)</td><td>11668019</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Altri materiali disponibili in commercio</td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE codifica per plasmidi gag/pol</td><td>12251</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev codifica per plasmidi Rev</td><td>12253</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G codifica per plasmidi VSVG</td><td>12259</td><td>Addgene</td><td></td></tr><tr><td>pAAV-Flex-GFP</td><td>28304</td><td>Addgene</td><td></td></tr></tbody></table>

etichettatura viral-mediata e trapianto di medial gangliari eminenza (mge) celle per<em&gt; in vivo</em&gt; studi

Viral-mediated Labeling and Transplantation of Medial Ganglionic Eminence (MGE) Cells for In Vivo Studies

GABAergici interneuroni corticali, derivati ​​dalla mediale embrionale e eminenze gangliari caudale (MGE e EGC), sono funzionalmente e morfologicamente diversificato. Incursioni sono stati fatti nella comprensione dei ruoli di distinti sottogruppi di interneuroni corticali, tuttavia, ci sono ancora molti meccanismi da elaborati che possono contribuire allo sviluppo e la maturazione dei diversi tipi di cellule GABAergici. Inoltre, la segnalazione GABAergici alterata può contribuire a fenotipi di autismo, la schizofrenia e l&#39;epilessia. Specifiche linee Cre driver hanno cominciato a spartire le funzioni di sottogruppi interneuroni unici. Nonostante i progressi nella modelli murini, è spesso difficile da studiare in modo efficiente GABAergici progenitori degli interneuroni corticale con approcci molecolari in vivo. Una tecnica importante usata per studiare la cellula di programmazione autonoma di queste cellule è il trapianto di cellule MGE in corteccia di accoglienza. Queste cellule trapiantate migrano ampiamente, differenziarsi, unND funzionale integrazione. Inoltre, le cellule possono essere efficacemente MGE trasdotte con lentivirus immediatamente prima del trapianto, consentendo una moltitudine di approcci molecolari. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo di trasdurre efficientemente cellule MGE prima del trapianto per l&#39;analisi in vivo, utilizzando disponibili linee Cre-driver e vettori di espressione Cre-dipendenti. Questo approccio è vantaggioso perché unisce manipolazione genetica preciso con la capacità di queste cellule di disperdersi dopo il trapianto, permettendo una maggiore risoluzione specifico tipo cellulare in vivo.

Poiché le cellule MGE hanno la capacità unica di migrare e integrare quando trapiantati in un neocorteccia serie 16, che forniscono un ottimo sistema modello per la manipolazione genetica prima di studi in vivo. Qui, si mostra come si possa isolare il tessuto MGE da embrioni E13.5 (Figure 1 e 2), che possono poi essere trasdotte con lentivirus sia in vitro o in modo rapido prima del trapianto per gli studi in vivo. Etichettatura MGE via lentivirus è stata eseguita p...

GABAergici progenitori degli interneuroni corticali disperdono, sviluppare e sinapticamente integrarsi in una corteccia di accoglienza dopo il trapianto. Queste cellule possono essere facilmente trasdotte prima del trapianto per gli studi in vivo di precursori GABAergici geneticamente modificati. Qui, vi mostriamo le tecniche di etichettatura virale per indirizzare specifici sottogruppi di interneuroni utilizzando linee Cre esistenti e giornalisti Cre-dipendenti.

Etichettatura Viral-mediata e trapianto di Medial gangliari Eminenza (MGE) Celle per<em&gt; In Vivo</em&gt; Studi

GABAergic cortical interneurons, derived from the embryonic medial and caudal ganglionic eminences (MGE and CGE), are functionally and morphologically ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di trasdurre rapidamente in modo virale progenitori neuronali GABAergici da cellule MGE prima del trapianto in un ospite per studi in vivo. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando le cellule MGE da un embrione donatore positivo per Cree. Il secondo passaggio consiste nell'etichettare rapidamente ed efficientemente le cellule MGE isolate con un virus appositamente modificato per uno scopo specifico, come l'etichettatura di un particolare tipo cellulare.In seguito, le cellule trans-use vengono trapiantate in un ospite e lasciate sviluppare in vivo. Infine, la microscopia scent o altre tecniche possono essere utilizzate per valutare le cellule transdotte e trapiantate nel momento appropriato. Uno dei principali vantaggi di questo approccio rispetto ad altre tecniche, come l'iniezione diretta del virus, è che le cellule MGE migrano a grande distanza dal sito di iniezione, che rappresenta un sito di lesione, rendendo possibile lo studio delle cellule in un ambiente più normale.Poiché le cellule MGE sono progenitrici di neuroni corticali, un tipo cellulare implicato in disturbi neuropsichiatrici quali l'autismo, la schizofrenia e l'epilessia, riteniamo che le tecniche qui descritte possano effettivamente contribuire a chiarire le basi biologiche di alcune di queste malattie neuropsichiatriche. Inoltre, questa tecnica consente un rapido modificamento genetico di queste cellule per studi in vivo. Dopo aver preparato il lentivirus ed essersi procurati l'MGE seguendo le indicazioni del protocollo scritto, raccogliere entrambi gli emisferi dell'MGE e porre il tessuto in due provette da raccolta da 1,5 millilitri contenenti 500 microlitri di DMEM con il 10% di FBS. Mantenere i campioni sul ghiaccio finché non è stato raccolto tutto il tessuto.Quindi trasferire le provette in una cappa certificata di livello BSL due. Aspirare con attenzione il mezzo senza disturbare il tessuto MGE depositato sul fondo della provetta. Aggiungere quindi circa 500 microlitri di DMEM preriscaldato con mezzo contenente il 10% di FBS.Aggiungere poli-brain fino a una concentrazione finale di otto microgrammi per millilitro e triturare attraverso una punta di pipetta P 1000 fino al raggiungimento di una sospensione monocellulare. Quindi aggiungere da 15 a 20 microlitri di lentivirus concentrato a ogni tubo. Successivamente, chiudere accuratamente ogni tubo, capovolgerlo per mescolare e quindi posizionare tutti i tubi in un incubatore a 37 gradi Celsius.Incubare le cellule con il lentivirus per almeno 30 minuti, ma non più di un'ora, poiché tempi più lunghi hanno determinato una ridotta vitalità cellulare. Capovolgere i tubi ogni 10 minuti dopo l'incubazione.Rimuovere i tubi dall'incubatore e centrifugare a 700 volte G a quattro gradi Celsius per tre minuti. Per formare il pellet delle cellule nella cappa di sicurezza di livello 2, rimuovere il surnatante e scartarlo in una soluzione di ipoclorito al 10%. Successivamente, aggiungere un millilitro di DMEM con 10% di FBS e retro.Ripetere la centrifugazione da due a tre volte per lavare il pellet. Come in precedenza, ripetere questo lavaggio da due a tre volte per rimuovere l'eccesso di virus. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere la maggior quantità possibile di mezzo e porre ogni provetta sul ghiaccio a causa del mezzo residuo sulle pareti della provetta.Circa due o tre microlitri di mezzo finiranno per coprire il pellet cellulare al momento dell'inizio della procedura di trapianto. Assicurandosi che venga mantenuta una tecnica sterile per tutta la durata dell'operazione, aspirare l'olio minerale in una siringa da un millilitro e quindi, utilizzando un ago da 30 e mezzo di calibro, riempire completamente la pipetta di vetro con l'olio minerale. Successivamente, fissare la pipetta di vetro al dispositivo stereotassico e, con l'aiuto di un assistente, inserirla nel pistone mediante il sistema idraulico.Spostare lo stantuffo circa a metà strada all'interno della pipetta di vetro, rimuovendo l'olio minerale che fuoriesce con un tovagliolo di carta pulito. Successivamente, arrotolare l'angolo di un tovagliolo di carta sterile in una punta fine e utilizzarla per rimuovere con delicatezza l'eccesso di mezzo sopra il pellet cellulare di mge. Questo permetterà di concentrare la densità cellulare, consentendo di ottenere volumi di iniezione più piccoli.Successivamente, utilizzare una pipetta P2 per aspirare lentamente il pellet cellulare e ripetere l'operazione da uno a due volte prima di dispensarlo su una superficie idrofobica. Il volume deve essere leggermente inferiore a un microlitro. Portare la punta dell'ago nella sospensione cellulare e, utilizzando la pompa idraulica, aspirare la sospensione cellulare nella pipetta.Dopo aver anestetizzato un animale mediante ipotermia, verificare l'efficacia dell'anestesia. Pinzando la pelle tra le dita dei piedi con una pinzetta, non si dovrebbe osservare alcuna reazione. Successivamente, posizionare l'animale su un supporto collocato sotto il dispositivo di iniezione e tendere la pelle tirando indietro la cute sulla testa, quindi fissarla.Utilizzando rapidamente il nastro da laboratorio standard, manovrare con attenzione il braccio dello stereotassico in modo da posizionare la punta della pipetta di vetro sulla testa del cucciolo perpendicolarmente alla superficie cranica. Quando la pipetta entra in contatto con la testa, considerare questa posizione come zero. Successivamente, spingere la pipetta attraverso la superficie della cute e del cranio fino alla corteccia.Quindi inserire ed estrarre la pipetta due volte prima di interrompere il targeting delle cellule nella neocorteccia. Le iniezioni vengono effettuate quando la micropipetta si trova a 0,1 millimetro. Una volta che l'ago è in posizione, ruotare il dispositivo idraulico per avanzare lo stantuffo all'interno della pipetta di vetro e iniettare da 50 a 70 nanolitri per sito.Ripetere questa procedura in tre-sei siti diversi a diversi livelli rostrali del midollo. Se è richiesta una distribuzione ampia di cellule trasformate in tutta la neocorteccia, al termine delle iniezioni, rimuovere il cucciolo dal supporto e contrassegnarlo secondo le procedure approvate. Una volta che il cucciolo si è ripreso ed è in grado di muoversi autonomamente, riposizionarlo con la femmina allattante e il resto della nidiata.Controllare i cuccioli dopo l'intervento e il giorno successivo per assicurarsi che non vi siano segni di peggioramento delle condizioni di salute in questo esperimento. Cellule positive per l'iris della somatostatina E 13.5 del gruppo AI 14, insieme a cellule MGE, sono state trapiantate o transdotte con il lentivirus CAG flex GFP prima del trapianto in neo-cortici di tipo selvaggio e valutate a sette giorni dal trapianto. Queste immagini di immunofluorescenza dei neo-cortici a sette o 35 giorni dal trapianto mostrano cellule MGE trapiantate positive per il pomodoro rappresentative; qui vengono mostrate immagini di immunofluorescenza di cellule MGE transitate con il lentivirus CAG flex GFP e valutate a sette DPT.Questo istogramma mostra la quantificazione della proporzione di cellule positive al pomodoro 2D che esprimevano GFP a sette giorni dal trapianto. Per le seguenti immagini, le cellule MGE sono state ottenute da topi positivi per somatostatina IRIS CRE all'E 13,5 e trasduttate con un lentivirus CAG flex GFP, quindi trapiantate nella neocorteccia di ospiti selvatici P uno prima della valutazione. A 35 giorni dal trapianto, questa immagine rappresentativa della neocorteccia di ospiti trapiantati dimostra l'espressione di GFP proveniente dal vettore Flex.Qui il tessuto è stato colorato per la somatostatina al fine di determinare la co-espressione di GFP e dei neuroni GABAergici esprimenti somatostatina, e qui il tessuto è stato colorato per la parvalbumina. Queste immagini sovrapposte, colorate anche con DAPI, mostrano il grado di colocalizzazione di GFP con somatostatina e parvalbumina. Infine, questo istogramma mostra la quantificazione della proporzione di cellule GFP che co-esprimono somatostatina o parvalbumina. A seguito dei metodi descritti in questa procedura, altri strumenti molecolari, ad esempio un virus associato al dentale, possono essere utilizzati per modificare geneticamente le cellule in studi in vivo. Non dimenticare che lavorare con lentivirus può essere estremamente pericoloso; precauzioni di sicurezza, come l'uso di idonei DPI e la conduzione delle operazioni in un livello di sicurezza biologica (BSL), devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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