Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare lo sviluppo del comportamento e l'attività neurale di numerosi esemplari adulti di C. elegans. Questo viene ottenuto coltivando i vermi in camere microfluidiche riempite di cibo. L'acquisizione prolungata di immagini a calcio viene eseguita mediante una telecamera E-M-C-C-D e tempi di esposizione brevi attivati da segnale TTL.

La procedura può essere ampliata esaminando più camere in sequenza o registrando contemporaneamente diverse camere. I risultati mostrano il comportamento delle larve e degli adulti, nonché i transitori di calcio nei neuroni di comando. Il vantaggio principale di questa tecnica con microcamere è che il comportamento e lo sviluppo possono essere seguiti per un lungo periodo con un'immagine di alta qualità.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché è difficile imparare a riempire le microcamere con la giusta quantità di cibo e calore. Per iniziare, configurare un microscopio dotato di riscaldatore per il coperchio, piatto automatico e sistema di videocamera E-M-C-C-D. Realizzare timbri in polimetilsubossazone in un laboratorio di microfluidica o ricorrendo a una fonderia commerciale.

Tagliare il chip in PDMS in 16 timbri singoli utilizzando un bisturi. Successivamente, esporre sia il timbro che un vetrino al plasma d'aria per circa un minuto prima di attaccare il timbro sul vetrino. Procedere lentamente per evitare di fondere la plastica.

Ritagliare un'area quadrata dal fondo di una piastra da 3,5 centimetri. Preparare più piastre contemporaneamente. Preparare aliquote sterili sia di agarosio a punto di fusione elevato che a punto di fusione basso prima dell'uso.

Posizionare tre aliquote di aeros ad alto punto di fusione su un blocco riscaldante. Inoltre, sciogliere un'eloqua di aero a basso punto di fusione prima di trasferirla su un blocco riscaldante separato. Per prima cosa, prendere la capsula di plastica con l'apertura quadrata creata in precedenza e posizionarla capovolta con l'apertura rivolta verso l'alto.

Utilizzare un pezzo di nastro adesivo doppio per coprire l'apertura. Ruotare la piastra in modo che il nastro adesivo si trovi sul fondo e posizionare la piastra su una superficie rigida. Liberare l'apertura tagliando con un bisturi.

Successivamente, riempire l'area che circonda l'apertura con due millilitri di aros ad alto punto di fusione. Attendere finché l'agros non si solidifica. Una volta solidificato, rimuovere il film protettivo che copre il nastro adesivo doppio su lato opposto.

Questo produce un sottile anello di nastro adesivo che circonda l'esterno dell'apertura. L'agarosa funge da serbatoio di umidità che in seguito circonderà il campione. Prima di costruire le microcamere, preparare la superficie del timbro in PDMS esponendola al plasma d'aria per 20-60 secondi.

Creare due distanziatori di uguale altezza impilando da cinque a nove vetrini. Posizionare un singolo vetrino tra i due impilati di distanziatori. Successivamente, posizionare il vetrino contenente il timbro in PDMS sopra i distanziatori.

Regolare l'altezza degli spaziatori in modo che vi sia uno spazio di 1,5 millimetri tra la superficie di stampo e il vetrino di vetro. Quando pronto, posizionare una goccia di aros caldo ad alto punto di fusione sul vetrino vicino al timbro in PDMS e far scivolare rapidamente il timbro orizzontalmente nel liquido aros. Una volta che l'aros si è solidificato e appare opaco, rimuovere il timbro verticalmente con un unico movimento.

Utilizzando un ago di platino fine, trasferire le uova o i vermi insieme ai batteri OP 50 sull'aros. Usare una ciglio per distribuire un uovo o un verme per camera insieme al cibo. Un quadratino di aros dovrebbe contenere circa 30 vermi.

Tagliare la lastra di agarosio contenente le microcamere in forma quadrata in modo che si adatti perfettamente all'apertura della piastra. Utilizzare pinzette per sollevare la lastra e posizionarla a faccia in giù su un coprioggetto di vetro; una volta appoggiato, non sollevare né spostare il coprioggetto, per evitare di spingere il contenuto fuori dalle camere.

Le camere sono ora sigillate. Successivamente, inserire il vetrino nell'apertura della piastra di plastica. Premere delicatamente il vetrino sul cerchio formato dal nastro adesivo doppio.

Attenzione a non rompere il vetro. Capovolgere la piastra e utilizzare paraffina a basso punto di fusione per riempire lo spazio tra la lastra di agarosio e il serbatoio di paraffina; procedere quando la paraffina si è solidificata. Sigillare la piastra con un coperchio e parafilm.

Dopo aver terminato la preparazione delle microcamere, controllarle correttamente al microscopio stereoscopico. Il riempimento delle camere e il controllo dell'umidità sono fondamentali per il successo dell'esperimento. Per iniziare, posizionare la piastra contenente le microcamere sul microscopio e mettere a fuoco il campione. Registrare 40 fotogrammi ogni 20 secondi ogni mezz'ora per 24 ore.

Successivamente, impostare la scansione in modo che visiti ogni verme utilizzando lo stage. L'obiettivo è filmare circa 30 vermi in un'unica esecuzione. È possibile acquisire immagini di più vermi allontanando lo zoom.

Utilizzare un ingrandimento inferiore per coprire diverse microcamere e filmare simultaneamente diverse microcamere adiacenti. Al termine dell'acquisizione delle immagini, separare i dati per ciascuna camera individuale ritagliando una regione di interesse che comprenda un singolo animale. La sottrazione tra fotogrammi può essere utilizzata per valutare rapidamente i dati relativi alla mobilità.

Dopo l'acquisizione delle immagini, l'analisi del calcio viene eseguita su un microscopio composto dotato di fluorescenza epifluorescente a campo largo. Per limitare l'esposizione alla luce, utilizzare un segnale logico transistor-transistor (TTL) che attiva un LED per illuminare il campione. Allo stesso tempo, la telecamera acquisisce un fotogramma.

Eseguire un filmato a intervalli per 24 ore, acquisendo ogni verme ogni 15-30 minuti. Registrare prima 20 secondi con contrasto di interferenza differenziale (DIC).

Poi 20 secondi con fluorescenza GFP. E infine, un'immagine del segnale MK due per i livelli di espressione di controllo. Per l'ispezione visiva dei dati, utilizzare una mappa di colori falsati per migliorare la visibilità delle piccole variazioni nell'intensità della fluorescenza.

Infine, eseguire l'analisi dei dati del calcio utilizzando procedure standard. Questo esempio mostra il comportamento larvale. Una camera con dimensioni maggiori permette lo sviluppo da uovo a adulto a lungo termine; qui vengono mostrati i cambiamenti nel comportamento.

La larva dauer qui mostrata è una fase vitale alternativa attivata in condizioni ambientali sfavorevoli. Questo verme adulto ha deposto numerose uova all'interno della camera. Infine, questa immagine mostra un ermafrodita adulto e un maschio in accoppiamento all'interno di una camera per adulti.

L'immagine del calcio del neurone intercomando A VA per una larva di stadio L1 è mostrata qui. Queste immagini mostrano l'attività del calcio per lo stesso tipo di neurone in un animale adulto. L'ampliamento dell'immagine a lungo termine permette di acquisire immagini di 30 vermi su un singolo chip della telecamera.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante riempire le camere con la quantità corretta di cibo e assicurarsi dei movimenti corretti dell'agarro. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare l'immagine a microcamere aros in varie fasi della vita di sea elegance.