Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio Caenorhabditis elegans

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di monitorare lo sviluppo del comportamento e l'attività neurale di più anziani. Ciò si ottiene coltivando i vermi in camere microfluidiche piene di cibo. L'imaging del calcio a lungo termine viene eseguito utilizzando una fotocamera E-M-C-C-D e i tempi di esposizione brevi attivati dal TTL vengono attivati.

La procedura può essere ampliata scansionando più camere in sequenza o filmando più camere contemporaneamente. I risultati mostrano il comportamento larvale e adulto, nonché il transitorio del calcio dei neuroni di comando. Il vantaggio principale di questa tecnica di microcamera è che il comportamento e lo sviluppo possono essere seguiti per un lungo periodo di tempo con immagini di alta qualità.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché riempire le microcamere con la giusta quantità di cibo e calore è difficile da imparare. Per iniziare, installa un microscopio con un riscaldatore del coperchio, un tavolino automatico e un sistema di telecamere E-M-C-C-D. Fabbricare timbri in polimetilsusciano in un impianto di microfluidica o utilizzando una fonderia commerciale.

Tagliare il chip PDMS in 16 timbri individuali utilizzando un bisturi. Quindi, esporre sia il timbro che un vetrino al plasma ad aria per circa un minuto prima di attaccare il timbro sul vetrino. Lavorando lentamente per evitare di sciogliere la plastica.

Ritaglia un'area quadrata dal fondo di un piatto da 3,5 centimetri. Prepara più piatti contemporaneamente. Preparare aliquote sterili di aero ad alto e basso punto di fusione prima dell'uso.

Posizionare tre aliquote di aeros ad alto punto di fusione su un blocco riscaldante. Inoltre, sciogliere un eloqua di aero a basso punto di fusione prima di trasferirlo in un blocco riscaldante separato. Per prima cosa, prendete la pirofila di plastica con l'apertura quadrata creata in precedenza e posizionatela a testa in giù con l'apertura rivolta verso l'alto.

Usa un pezzo di nastro biadesivo per coprire l'apertura. Capovolgere il piatto in modo che il nastro adesivo sia sul fondo e posizionare il piatto su una superficie dura. Taglia l'apertura liberandoti con un bisturi.

Quindi, riempire l'area che circonda l'apertura con due millilitri di aros ad alto punto di fusione. Aspetta che l'agros sia solido. Una volta solidificato, rimuovere la pellicola protettiva che copre il nastro biadesivo dall'altro lato.

Ciò si traduce in un sottile anello di nastro adesivo che circonda l'esterno dell'apertura. L'agro funge da serbatoio di umidità che in seguito circonderà il campione. Prima di costruire le microcamere, preparare la superficie del timbro PDMS esponendola al plasma d'aria per 20-60 secondi.

Crea due distanziatori di uguale altezza impilando da cinque a nove vetrini. Posizionare un singolo vetrino tra le due pile di distanziatori. Quindi, posiziona il vetrino che contiene il timbro PDMS sui distanziatori.

Regolare l'altezza dei distanziatori in modo che ci sia uno spazio di 1,5 millimetri tra la superficie di stampaggio e il vetrino. Quando è pronto, posizionare una goccia di aros caldo ad alto punto di fusione sul vetrino vicino al timbro PDMS e far scorrere rapidamente il timbro orizzontalmente nel liquido aros. Una volta che l'aros si è solidificato e appare opaco, staccare il timbro verticalmente con una sola mossa.

Usando un plettro di platino sottile, trasferisci le uova o i vermi insieme ai batteri OP 50 sull'aros. Usa una ciglia per distribuire un uovo o un verme per camera insieme al cibo. Un tampone aros dovrebbe contenere circa 30 vermi.

Tagliare la lastra di aros contenente le micro camere in un quadrato in modo che si adatti bene all'apertura del piatto. Utilizzare una pinza per sollevare la lastra e posizionarla a testa in giù su un vetrino coprioggetti una volta lasciata cadere, non sollevare o far scorrere il vetrino coprioggetti. Per evitare di spingere il contenuto fuori dalle loro camere.

Le camere sono ora sigillate. Quindi, posizionare il vetrino coprioggetti nell'apertura del piatto di plastica. Premere delicatamente il vetrino di copertura sull'anello in nastro biadesivo.

Fare attenzione a non rompere il vetro. Capovolgere il piatto e utilizzare aros a basso punto di fusione per riempire lo spazio tra la lastra agro e il serbatoio aros per quando l'aros si sarà solidificato. Sigillare il piatto con un coperchio e param.

Dopo aver terminato la preparazione delle microcamere, controllarle correttamente con uno stereomicroscopio. Le camere di riempimento e il controllo dell'umidità sono fondamentali per il successo. Per iniziare, posiziona il piatto contenente le microcamere sul microscopio e metti a fuoco il campione: registra 40 fotogrammi di immagine in 20 secondi ogni mezz'ora per 24 ore.

Quindi, impostare la scansione in modo che visiti ogni worm utilizzando la fase. Cerca di filmare circa 30 vermi in una corsa. È possibile visualizzare più worm riducendo lo zoom.

Utilizzare un ingrandimento inferiore per coprire diverse microcamere e filmare contemporaneamente diverse microcamere adiacenti. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, separare i dati per ogni singola camera ritagliando una regione di interesse che copre un animale. La sottrazione può essere utilizzata per valutare rapidamente i dati sulla mobilità.

Dopo l'imaging, l'imaging del calcio viene eseguito su un microscopio composto dotato di epifluorescenza a campo largo. Per limitare l'esposizione alla luce, utilizzare un segnale logico transistor transistor che attiva un LED per illuminare il campione. Allo stesso tempo, la fotocamera registra un fotogramma.

Esegui un filmato a raffica per 24 ore. Questo immagine di ogni verme ogni 15-30 minuti. Prima registrazione di 20 secondi con DIC.

Quindi 20 secondi con fluorescenza GFP. E infine, un'immagine del segnale MK due per i livelli di espressione del controllo. Per l'ispezione visiva dei dati, utilizzare una mappa a falsi colori per migliorare la visibilità di piccole variazioni nell'intensità della fluorescenza.

Infine, eseguire l'analisi dei dati sul calcio utilizzando le procedure standard. Questo esempio mostra il comportamento larvale. Una camera con dimensioni maggiori consente lo sviluppo da un uovo a un adulto a lungo termine, qui vengono mostrati i cambiamenti nel comportamento.

Il seme della larva della dote qui è una fase di vita alternativa che viene attivata in condizioni ambientali avverse. Questo verme adulto ha deposto molte uova nella camera. Infine, questa immagine mostra un ermafrodita adulto e un maschio che si accoppiano all'interno di una camera per adulti.

L'imaging del calcio dell'interneurone di comando A VA per una larva L one è mostrato qui. Queste immagini mostrano l'attività del calcio per lo stesso tipo di neurone in un animale adulto. L'ingrandimento dell'imaging a lungo termine consente di visualizzare 30 vermi su un chip della fotocamera.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante riempire le camere con la giusta quantità di cibo e garantire i corretti movimenti dell'agarro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'imaging della micro camera aros su varie fasi della vita dell'eleganza del mare.