Name: In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Scopri il tracciamento non invasivo di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mediante scintigrafia gamma in cavalli con tendinopatia. Questo metodo consente di valutare la sopravvivenza e la distribuzione cellulare nel tempo.

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Gli autori desiderano ringraziare il finanziamento dell'Horserace Betting Levy Board UK (numero di sovvenzione 721) e di VetCell BioScience Ltd, Regno Unito e di Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spagna.

I casi descritti nel presente documento sono stati eseguiti seguente autorizzazione etico concessa dal Etica e il benessere Comitato degli animali del Colegio de VETERINARIOS de Malaga, in Spagna, e il Royal Veterinary College, North Mymms, Regno Unito Le procedure utilizzate sui cavalli si basano su protocolli approvati che sono usato in clinica per i cavalli che ricevono terapie basate sulle cellule staminali, che comprende la sedazione, l&#39;aspirazione del midollo osseo, iniezione intra-tendinee, perfusione regionale, iniezione endovenosa, il trattamento e la gestione del dolore post-procedurale e il monitoraggio dopo l&#39;impianto. 1. Disposizioni chiave per essere fatte in anticipo <ol><li> Cercate etica istituzionali e l&#39;approvazione del benessere degli animali e di aderire ai requisiti di legge locali prima di iniziare il lavoro. </li><li> Chiedere l&#39;approvazione istituzionale di lavorare con radiazioni ionizzanti come dettato dalle normative locali e legali, tra cui il livello di protezione del personale e dell&#39;ambiente e lo smaltimento di contamrifiuti inato. </li><li> Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: i cavalli presenti con un infortunio strapazzo non traumatica (tendinopatia o desmopathy) al flessore superficiale tendine digitale dell&#39;arto anteriore e lesioni con conseguente difetto entro il tendine e il difetto è circondato da tendine e / o paratenonio intatto . Nota: L&#39;esame e la diagnosi di tali infortuni e la preparazione clinica dei cavalli per l&#39;impianto delle cellule è stato dettagliato altrove 6,15. Nota: L&#39;isolamento e l&#39;espansione in coltura di BMMSC derivate dal midollo osseo dei cavalli è stato dettagliato in precedenza 6,16. L&#39;attuale protocollo per l&#39;iniezione di BMMSC per lesioni SDFT nel cavallo utilizza 10 milioni di cellule per ml 4 di midollo surnatante osso autologo (BMS) 16. </li><li> Utilizzare le cellule che hanno subito non più di 4 passaggi per l&#39;impianto in vivo di evitare potenziali fenotipo cellulare o alterazioni genetiche associate con il numero elevato passaggio cells. </li><li> Fornire il numero di celle nella BMS richiesta (entro 24 ore in una scatola a freddo 4 - 8 ° C) alla clinica veterinaria dove l&#39;impianto di cellule deve essere eseguita. Nota: L&#39;uso clinico delle cellule staminali mesenchimali nel midollo osseo surnatante è una procedura brevettata di proprietà di ReCellerate Inc (USA) e il suo uso può richiedere l&#39;autorizzazione. Nota: Tc-99m è un emettitore gamma (140 keV) con un relativamente breve emivita (6,0058 ore, quindi il 94% decade alla sua forma stabile di 99 Tc in 24 ore). L&#39;energia di gamma lo rende adatto per il rilevamento da telecamere gamma (scintigrafia) ed i risultati a breve emivita nel tempo l&#39;esposizione alle radiazioni molto limitato sia per il cavallo e il personale di gestione degli animali. Questo protocollo descrive l&#39;etichettatura in loco di cellule utilizzando Tc-99m-HMPAO [HMPAO marcato con Tc-99m (come pertecnetato di sodio)]. </li><li> Ordinare il Tc-99m fresco direttamente presso tale che essa è stata utilizzata per l&#39;etichettatura e la cellule ingegnohin 2 ore di eluizione del generatore Tc-99m. Assicurarsi che il Tc-99m è fornita come 1 GBq a (tampone standard del fornitore) un 1 ml di soluzione. </li><li> Utilizzare tutti i tamponi a temperatura ambiente. Eseguire la procedura di etichettatura, l&#39;impianto delle cellule e di imaging (gamma scintigrafia) in una camera di contenimento isotopo con tutte le attrezzature puliti con alcool asciuga prima dell&#39;inizio dei lavori. </li></ol> 2. Preparazione del Cavallo e Ecografia dell&#39;arto anteriore tendine <ol><li> Registra scansioni a ultrasuoni in un primo ricovero per infortunio (quando il midollo osseo viene aspirato) e poi al punto di tempo quando le cellule vengono iniettate radioattivi. </li><li> Eseguire l&#39;ecografia e l&#39;impianto delle cellule con il cavallo che porta peso uniformemente in una stalla e sotto sedazione in piedi (piuttosto che l&#39;anestesia generale). Somministrare sedazione usando una miscela di detomidina HCl e butorfanolo tartrato, ciascuna a 0.01 al 0.02 mg / kg IV. Nota: Il recupero è rapido e post-chirurgica di trattamento non richiedeconsiderazioni particolari. </li><li> Dopo l&#39;anestesia perineurale è applicato (passo 2,6) nella dell&#39;arto interessato, tenere il cavallo alla stazione sotto sedazione per ridurre il movimento del cavallo durante il trattamento. Controllare visivamente il livello appropriato di sedazione giudicati dalla posizione di testa abbassata e il comportamento del cavallo e che il cavallo è comodo durante l&#39;iniezione di cellule e i movimenti della gamma camera durante l&#39;acquisizione delle immagini scintigrafiche. Nota: Non è necessario applicare veterinario pomata sugli occhi (per prevenire la secchezza) perché sotto sedazione lampeggiante non viene modificata e il cavallo è in grado di mantenere l&#39;idratazione degli occhi. Il monitoraggio dopo l&#39;impianto delle cellule non è invasivo (ultrasuoni e gamma scintigrafia). </li><li> Fermaglio da vicino i capelli sovrastante il tendine (con tosatrici cavallo) quindi pulire l&#39;area ritagliata utilizzando una combinazione di uno scrub chirurgico clorexidina e, infine, l&#39;alcool. </li><li> Applicare gel di accoppiamento acustico per la zona eeseguire la scansione metodicamente per registrare scansioni della regione completo palmare metacarpo, i livelli in sequenza etichettati 1 - 7 17, con un trasduttore lineare (12 MHz o simile) per ottenere seriale coincidenza trasversali e longitudinali immagini. Conservare le immagini digitalmente in modo che l&#39;area della sezione trasversale e la zona lesioni massimo 4 possono essere ottenuti con l&#39;ausilio di software di analisi di immagine. </li><li> Preparare zona sovrastante le nervi palmari immediatamente distale del carpo per iniezione asettiche di anestetico locale per garantire la completa desensibilizzazione della pelle sovrastante il tendine e il tendine flessore superficiale. Iniettare 2 ml di mepivicaine sia per via sottocutanea e adiacente ai nervi palmari (nella loro posizione sub-fasciale) tra i tendini flessori e il legamento sospensorio immediatamente distale del carpo su entrambi i lati dell&#39;arto. </li><li> Una volta che la scansione preliminare è stata eseguita la preparazione del sito di impianto lavando la zona con clorexidina s chirurgicheSoluzione crub per almeno 5 minuti e, infine, con una garza imbevuta di alcool. Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​modo asettico. </li></ol> 3. Tc-99m-etichettatura di cellule staminali mesenchimali Equine Nota: I passaggi di etichettatura delle cellule possono essere eseguite durante l&#39;ecografia dell&#39;arto anteriore come questo decadimento isotopo minimizzerà tra l&#39;etichettatura delle cellule e l&#39;impianto di cellule marcate nel tendine. <ol><li> Rimuovere il BMS dalle cellule poiché interferisce con l&#39;assorbimento di isotopo. Per fare questo, recuperare il flaconcino di BMMSC (10 milioni di cellule in 1 ml di BMS) dalla scatola freddo e agglomerare le cellule in una microcentrifuga a 350 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il surnatante con un 18G o 19G ago (attaccato ad una siringa da 2 ml), lasciando una piccola goccia (≤ 0,1 ml) nel tubo per aiutare la risospensione delle cellule. Salvare il surnatante (BMS) in una provetta sterile e tenere in ghiaccio per dopo il riutilizzo. </li><li> Risospendere le cellule in gocciolina residua di surnatante da flIcking il tubo delicatamente con le dita (piuttosto che vortex) e lasciare la provetta in un rack a temperatura ambiente. Assicurarsi che le cellule sono risospese completamente e che non ci siano grumi di cellule visibili. </li><li> Preparare il Tc-99m come segue. Trasferire 1 ml di tecnezio pertecnetato in una fiala di HMPAO utilizzando una siringa da 1 ml e l&#39;ago. Mescolare delicatamente ma accuratamente e lasciar riposare per 5 minuti dietro piombo schermatura. Nota: Questo passaggio può essere fatto mentre le cellule girano al punto 2.1. </li><li> Aggiungere tutta la miscela Tc-99m-HMPAO utilizzando una siringa da 1 ml e l&#39;ago per le cellule e mescolare delicatamente. Incubare per 30 minuti a RT dietro piombo schermatura. </li><li> Per i passi successivi, utilizzare una pinza (o un foglio di carta velina) per aprire il coperchio della provetta per minimizzare la contaminazione isotopo del pollice (guanto) e successivamente altre attrezzature. Usare una siringa da 2 ml e 21 ago G per aggiungere o rimuovere il tampone di lavaggio. Nota: L&#39;uso di un monitor campo isotopo viene incoraggiato a monitorare la contaminazione delle superfici e attrezzature. </li&gt; <li> Aggiungere 1 ml di PBS alla miscela Tc-99m-HMPAO-cellule, chiudere il coperchio, mescolare delicatamente e girare per far sedimentare le cellule come al punto 3.1. </li><li> Rimuovere con attenzione il PBS in una nuova provetta (salvare questo dietro il piombo schermatura ed etichetta come W1). Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS fresco. Centrifugare il tubo e rimuovere il surnatante come sopra (salvare questo ed etichetta come W2). </li><li> Calcolare l&#39;efficienza di etichettatura misurando i conteggi in tubi W1 e W2 e il pellet di cellule. A tale scopo, mettendo ciascuno tubi in uno strumento calibratore di dose isotopo Bene e registrare la radioattività come colpi per minuto (CPM). Calcolare l&#39;efficienza etichettatura (Radioattività come CPM di celle) / (Radioattività delle cellule + surnatante) x 100. </li><li> Risospendere le cellule a fondo nel residuo PBS e quindi aggiungere il BMS salvato dal punto 3.1. Le cellule sono pronte per l&#39;impianto intralesionale. </li></ol> 4. L&#39;impianto di celle Tc-99m-HMPAO marcati <ol><li> L&#39;impianto intralesionalenel tendine sotto guida ecografica <ol><li> Lentamente introdurre un pollice 1.5 o 2 (50 mm) 20 ago G nella zona massima pregiudizio della lesione in un orientamento longitudinale con il trasduttore ad ultrasuoni, coperto da un telo sterile, in linea con l&#39;ago in modo che la lunghezza dell&#39;ago può essere identificati ecograficamente e la punta se l&#39;ago si trova esattamente al centro della lesione. </li><li> Utilizzando appropriata schermatura, raccogliere le cellule in una siringa da 2 ml (Luer-lock, per ridurre al minimo il rischio di contaminazione esterna e in un coprisiringa piombo schermatura) utilizzando un ago G 20. Gettare l&#39;ago facendo attenzione a non perdere alcun fluido. Ora collegare la siringa con le cellule marcate l&#39;ago pre-situato nel tendine. </li><li> Posizionare la sonda ecografica sotto l&#39;ago in modo che il tratto dell&#39;ago nel tessuto è chiaramente visibile. Iniettare le cellule ad un ritmo lento ma costante nella lesione. Assicurarsi che non c&#39;è resistenza a iniezione. Se questo si verificariposizionare accuratamente l&#39;ago sotto guida ecografica. Controllare che l&#39;espulsione del fluido nella lesione è visibile l&#39;immagine ecografica come fluido contenente bolle d&#39;aria anecoica iperecogeni on. </li><li> Togliere l&#39;ago e collocare immediatamente la pressione sul foro dell&#39;ago per evitare la perdita di cellule iniettate e minimizzare la diffusione isotopo sulla superficie esterna del lembo. Vestire Immediatamente l&#39;arto con uno strato di fasciatura autoadesivo. Il cavallo è pronto per la scintigrafia gamma. Eseguire questo immediatamente. Nota: Dopo aver iniettato le cellule nel tendine, acquisire un conteggio del siringa vuota e l&#39;ago per valutare la possibile perdita diretta di cellule che possono rimanere nella siringa. </li></ol></li><li> Perfusione regionale di cellule Tc-99m-HMPAO marcati <ol><li> Seguire passo 2.4. </li><li> Applicare un 100 millimetri laccio emostatico di gomma benda sul metacarpo prossimale con due 100 millimetri rotolo di garza di cotone fasciatura posizionato mediale e laterale. </li><li> Asetticamente preparare °e pelle sopra la vena digitale palmare laterale a livello della laterale prossimale osso sesamoide lavando la zona con una soluzione di clorexidina scrub chirurgico per almeno 5 minuti e infine con garza imbevuta di alcool. Eseguire tutti i passaggi successivi in ​​modo asettico. </li><li> Preparare una estensione 100 millimetri set con un 21 G x ¾ &quot;(0,8 x 19 mm) ago a farfalla per venipuntura riempiendo con soluzione salina sterile eparinizzata e quindi introdurre l&#39;ago nella vena laterale digitale palmare. Sangue Una volta inserita la vena sarà parzialmente riempire il set di estensione. Al connettore a bloccaggio Luer allegare un tappo di gomma blocco Luer per facilitare la successiva iniezione di cellule marcate. </li><li> Diluire le cellule staminali mesenchimali in 19 ml di PBS raccogliendo le cellule in una siringa da 20 ml precaricato con il PBS. Applicare le cellule attraverso la coppa di gomma con un 18 G (1,2 x 40 mm) ago ipodermico ad un tasso lento ma costante (30 - 40 sec). Lavare il catetere con 1 ml di PBS precaricati in una Syringe. </li><li> Rimuovere l&#39;ago e immediatamente applicare pressione alla pelle sopra il foro dell&#39;ago con uno strato di cinque 4 x 4 garze di cotone. Poi posto un bendaggio adesivo elastico leggero con sopra la zona sesamoide prossimale e lasciare il laccio emostatico in posizione per 30 minuti dopo l&#39;iniezione. </li><li> Rilasciare il laccio emostatico dopo 30 min. Il cavallo è pronto per la scintigrafia gamma. Nota: Dopo aver iniettato le cellule, acquisire un conteggio del siringa vuota e l&#39;ago per valutare la possibile perdita diretta di cellule che possono rimanere nella siringa. </li></ol></li></ol> 5. Gamma Scintigrafia <ol><li> Immagini scintigrafia <ol><li> Acquisire immagini planare scintigrafia con gamma camera (fissato a 140 KeV picco fotoelettrico utilizzando una finestra simmetrica 20%) dotato di una bassa energia, foro collimatore parallelo. <ol><li> Ottenere tutte le immagini dopo tempo 0 su cavalli sedati come al punto 2.2 in piedi. Dopo il tempo 0 scintigrafia, sostituire la benda luce sopra la si dell&#39;impiantoTé con una benda imbottita. Rimuovi questa benda prima di ogni esame la scintigrafia. </li><li> Acquisire immagini statiche per 60 secondi ciascuno (256 da 256 matrice) utilizzando il software di elaborazione con la &quot;acquisizione&quot; - &quot;Selezione di studio&quot; - opzioni &quot;osso statiche&quot;. È essenziale che il cavallo non si muove durante il periodo di acquisizione dell&#39;immagine perché l&#39;opzione modalità statica non ha un modulo per la correzione di movimento. </li><li> Per l&#39;iniezione intralesionale, ottenere immagini laterali dalla zona della lesione da carpo all&#39;estremità distale, l&#39;area equivalente dell&#39;arto controlaterale, il campo polmone sinistro e la tiroide sinistra. Durante l&#39;acquisizione di immagini arti anteriori, posizionare uno schermo di piombo tra le gambe per evitare l&#39;imaging del controlaterale dell&#39;arto. Acquisire le immagini a 5 min dopo l&#39;iniezione (tempo 0), e poi a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore. </li><li> Per perfusione regionale, ottenere immagini laterali e dorsale gamma come ad 5.1.1.3. Ottenere immagini 5 min after rilascio laccio emostatico. Questo sarà tempo 0. Può essere utile l&#39;arto immagine immediatamente dopo l&#39;iniezione delle cellule di valutare conteggi precedenti del laccio rilascio. Ottenere immagini gamma a 1, 3, 6, 12, 24, 36 e 48 ore dopo la somministrazione delle cellule. </li></ol></li><li> Dopo che le immagini sono state acquisite, processo le immagini utilizzando manualmente l&#39;opzione &quot;trasformazione&quot; del software con le opzioni selezionate per il colore &quot;Sokoloff&quot; e colore &quot;Inverti&quot;. Quindi seleziona la &quot;regione di interesse&quot; (ROI) e &quot;ellisse&quot; come questo permette rimodellamento della maschera di selezione e circolazione sull&#39;area lesione. Ottenere i conteggi sul ROI scegliendo l&#39;opzione &quot;aggiungi le statistiche&quot;. Garantire che le regioni in modo identico di dimensioni di interesse (ROI) sono registrate per ogni animale ai diversi punti temporali. </li><li> Successivamente, correggere i conteggi per il decadimento prevista del tecnezio in ogni punto. Utilizzare la seguente equazione per correggere decadimento:A = A o e - (0.693t / T 1/2), dove A o l&#39;attività iniziale dell&#39;isotopo, A è il decadimento corretto radioattività al tempo zero, t è il tempo trascorso e T 1/2 è la metà -life dell&#39;isotopo. Poi esprimere i conteggi corretti in ogni punto temporale come percentuale della ROI al tempo 0 per elaborare la percentuale di cellule rimanenti, utilizzando la seguente formula: </li></ol></li></ol> % di cellule rimanenti (t) = 100 - {[(decadimento predetto (t) - decadimento (t)) / decadimento predetto (t)]} x 100 decadimento (t) = ROI (t) / ROI (0) x 100.

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<li>Trela, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scintigraphic+comparison+of+intra-arterial+injection+and+distal+intravenous+regional+limb+perfusion+for+administration+of+mesenchymal+stem+cells+to+the+equine+foot%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot.</a> Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).</li>
<li>Barbash, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+delivery+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+to+the+infarcted+myocardium%3A+feasibility%2C+cell+migration%2C+and+body+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution.</a> Circulation. 108, 863-868 (2003).</li>
<li>Heckl, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+contrast+agents+for+molecular+imaging+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Future contrast agents for molecular imaging in stroke.</a> Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).</li>
</ol>

JD e RKS sono membri del comitato consultivo scientifico di ReCellerate Inc.

Oltre al midollo osseo, cellule staminali isolate da fonti come il tessuto adiposo sono adatti per l&#39;etichettatura con questo protocollo. Inoltre, le cellule da uno stato congelato può essere ripreso e ampliato in coltura per i numeri desiderati per gli studi di etichettatura 12. Un fattore critico che determina l&#39;efficienza di etichettatura del BMMSC è il tempo tra eluizione del Tc-99m dal generatore di molibdeno al radiofarmacia, preparazione di Tc-99m-HMPAO e l&#39;uso ...

Strategie rigenerativa per la riparazione di tessuti malati o danneggiati sono basate su cellule staminali multipotenti derivate da una varietà di tessuti e impiantati nella zona colpita. I recenti progressi nell&#39;applicazione delle autologo BMMSC per il trattamento di tendini e lesioni legamentose nel cavallo hanno dimostrato di migliorare le misure di outcome sia sperimentale 1-5 e studi clinici 6. Il cavallo è un modello particolarmente interessante per valutare l&#39;efficacia delle cellule staminali trattamenti correlati perché soffre di età e affaticare le lesioni riportate ai tendini dell&#39;arto anteriore distale, è un animale atletico, ed è un grande, facilitare il recupero del midollo osseo e dell&#39;impianto corretto. Lesioni tendinee guarire naturalmente con fibrosi ma il tendine è guarito funzionalmente inferiore 7 e ha un elevato rischio di re-infortunio 8. Il superficiale tendine flessore (SDFT) è più comunemente influenzato come si è evoluto per agire come una energia elasticanegozio ed esperienze ad alto carico insiste per ottenere efficienza energetica e locomozione ad alta velocità. Ripristinare la funzione dopo la lesione è quindi fondamentale. Queste lesioni sono simili a quelle che interessano il tendine di Achille nell&#39;uomo che svolge una funzione simile 9. Non ci sono buone opzioni di trattamento per curare o raggiungere un buono di riparazione per tali lesioni, strategie rigenerative quindi basati su cellulari offrono un&#39;opportunità interessante per migliorare i risultati e ridurre re-infortunio. Nella maggior parte degli studi 5 - 20 milioni BMMSC autologhe vengono iniettati direttamente nella lesione che solitamente si verificano nel nucleo del corpo tendine che agisce quindi come un ricettacolo per le cellule. Il destino delle cellule, una volta iniettate non è chiaro e metodi diversi di etichettatura delle cellule per monitorare le cellule sono state descritte recentemente. Cellule marcate con un cartellino di fluorescenza hanno dimostrato di sopravvivere solo in un numero relativamente piccolo (&lt;10%) 10,11. Etichette fluorescenza richiedonotessuto extraction e sezionamento per l&#39;analisi istologica, che richiede molto tempo e non facilmente facilitare l&#39;analisi temporale in un grande modello animale o in casi clinici. Nel più recente lavoro abbiamo usato il 99m Tc radioisotopi per etichettare le cellule e seguire il loro destino da Gamma scintigrafia 1. Questo metodo consente raffronti rapidi da effettuare tra le diverse vie di consegna delle cellule, tra cui intralesionale, per via endovenosa attraverso la vena giugulare 1 o perfusione regionale via intra-arteriosa di 12 o per via endovenosa 1,12 iniezioni. La persistenza e la distribuzione di cellule possono poi essere ripreso dalla gamma scintigrafia dei vari organi. Questo ha dimostrato che solo il 24% delle cellule iniettate intralesionally rimasto nella lesione da 24 ore 1 e questo è supportato da un altro studio utilizzando lesioni sperimentalmente creati e utilizzando lo stesso radiomarcato 5. Inoltre, le cellule mostrano una limitata capacità di casa in lesioni tendinee quando consegnato neld per perfusione regionale o per via endovenosa, ma sono dispersi nei polmoni di questi ultimi percorsi 4. BMMSC etichettato con nanoparticelle di ferro è un metodo alternativo per monitorare le cellule impiantate in tendini delle zampe anteriori 13. Sebbene cellule marcate nanoparticelle ferro consentono inseguimento cellule in vivo tramite MRI, studi temporali in un grande animale sono limitati dal numero di volte in anestesia possono essere somministrati ad ogni tempo per effettuare le scansioni MRI. Inoltre, le nanoparticelle di ferro sono ipointensa in MRI che limita le informazioni sulla migrazione di cellule marcate nel corpo tendine. Altri radioisotopi che possono essere utilizzati comprendono indio-111 ma soffre lo svantaggio di un tempo di dimezzamento più lungo di Tc-99m (2,8 giorni vs 6,0 ore) e più alta energia di emissione di raggi gamma. Inoltre, la vitalità cellulare è stata riportata una riduzione quando marcato con Indio-111 14. Tc-99m, d&#39;altra parte, viene normalmente utilizzato sia nucleare equina e umanamedicina di etichettare cellule mononucleate del sangue periferico e seguire la loro distribuzione in vivo mediante scintigrafia. Esso può essere relativamente facilmente assimilato dalle cellule utilizzando HMPAO come una molecola linker di impegnare la tecnezio, come Tc-99m-HMPAO, alle cellule. Tc-99m-HMPAO etichettato BMMSC mostrano buona vitalità e può proliferare in vitro 4. Dettagli Questo protocollo l&#39;etichettatura e la tracciabilità dei equino BMMSC autologo impiantato in lesioni viventi naturalmente allo SDFT zampa anteriore. È importante notare che il protocollo è destinato esclusivamente per essere utilizzato come strumento di ricerca. Il suo uso come modalità terapeutica clinica non è raccomandata come l&#39;effetto del radiomarcato sul fenotipo cellulare non è stato completamente chiarito.

<table><tbody><tr><td>Tecnezio99m&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Si prega di informarsi con il fornitore locale di radiazioni ionizzanti in conformità con i requisiti legali. L'isotopo deve essere utilizzato entro 2 ore dall'eluizione dal generatore di molibdeno-99</td></tr><tr><td>Ceretec - Esametilpropileneammina ossima (HMPAO).</td><td>GE HealthCare</td><td></td><td>Si prega di informarsi direttamente con GE HealthCare</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge, Minispin/Minispin Plus</td><td>Ependorf</td><td>22620100</td><td></td></tr><tr><td>aghi da 18 G e 19 G</td><td>Terumo Medical</td><td>NN-1838R (18 G); &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NN1938R (19 G)</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 1 ml e 2 ml</td><td>Scientific Laboratory Supplies Ltd</td><td>SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml)Provette</td><td></td></tr> per <tr><td>microcentrifuga 1,5 ml</td><td>Greiner Bio-One Ltd</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>LifeTechnologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di garza sterili</td><td>Shermond Ltd</td><td>UNG602</td><td></td></tr><tr><td>Benda autoadesiva CoflexVet</td><td>Andover Healthcare, Inc.</td><td>3540RB-018</td><td></td></tr><tr><td>Software per l'imaging ad ultrasuoni</td><td>Scion Image, Scion Corporation, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software per l'elaborazione degli scintigrammi MicasXplus</td><td>Bartec Technologies Ltd</td><td></td><td>Contatore di</td></tr><tr><td>isotopi http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html Field per il monitoraggio degli isotopi</td><td>John Caunt U.K.</td><td>GMS1800a</td> Contatore <td>a http://www.johncaunt.com/</td></tr> <tr><td>pozzetti per misure isotopiche, calibratore di dose</td><td>Capintec Southern Scientific</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in equine tendinopatia

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

I recenti progressi nell&#39;applicazione delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMMSC) per il trattamento di lesioni legamentose e tendinee nel cavallo suggeriscono una migliore misure di esito in entrambi gli studi sperimentali e clinici. Sebbene la BMMSC vengono impiantati nella lesione tendinea in gran numero (di solito 10 - 20 milioni cellule), solo un numero relativamente piccolo sopravvivere (&lt;10%) anche se questi possono persistere per 5 mesi dopo l&#39;impianto. Questo sembra essere un comune osservazione in altre specie dove BMMSC sono stati impiantati in altri tessuti ed è importante capire quando si verifica questa perdita, quanti sopravvivono il processo di impianto iniziale e se le cellule vengono cancellati in altri organi. Il monitoraggio del destino delle cellule può essere ottenuto mediante radiomarcatura il BMMSC prima dell&#39;impianto che permette non invasivo imaging in vivo di posizione di cella e la quantificazione dei numeri di cellulare. Questo protocollo descrive un labeli cellulareProcedura ng che usa tecnezio-99m (Tc-99m), e il monitoraggio di queste cellule dopo l&#39;impianto in tendini flessori feriti nei cavalli. Tc-99m è un (t 1/2 del 6,01 hr) isotopo breve durata che emette raggi gamma e può essere internalizzati dalle cellule in presenza del hexamethylpropyleneamine ossima composto lipofilo (HMPAO). Queste proprietà lo rendono ideale per l&#39;uso in cliniche di medicina nucleare per la diagnosi di molte malattie differenti. Il destino delle cellule marcate può essere seguita a breve termine (fino a 36 ore) per la scintigrafia gamma di quantificare sia il numero di cellule conservate nella lesione e distribuzione delle cellule nei polmoni, tiroide e altri organi. Questa tecnica è adattato dall&#39;etichettatura di leucociti del sangue e può essere utilizzato per l&#39;immagine impiantato BMMSC in altri organi.

Tc-99m-HMPAO incorporazione in BMMSs non compromettere la loro capacità di aderire alla cultura del tessuto plastico e mentre mostrano capacità proliferazione di formare monostrati (figura 1), non abbiamo pienamente determinato se i tassi di proliferazione o altri fenotipi cellulari sono interessati. La loro morfologia è simile alle cellule non marcate con una tipica forma a fuso. L&#39;efficienza etichettatura cellulare (es., L&#39;assorbimento di etichetta) varia tipicamente da circa 1,5% al ...

Questo protocollo descrive la radiomarcatura delle cellule staminali mesenchimali equine e il loro impianto nelle lesioni tendinee del cavallo al fine di determinare la sopravvivenza cellulare e la distribuzione dei tessuti utilizzando la scintigrafia gamma.

In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è seguire in modo non invasivo la distribuzione e il destino delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo marcate dopo la loro iniezione mediante scintigrafia gamma. Il destino delle cellule staminali dopo l'iniezione è poco compreso. I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente di tracciare in modo non invasivo le cellule staminali in multipli organi dopo la somministrazione e che la breve emivita dell'osteo A ne assicura l'eliminazione entro 48 ore.Sebbene ciò abbia fornito informazioni sull'uso delle cellule staminali nella terapia delle tendinopatie spontanee, potrebbe essere impiegato anche per lo studio di terapie per malattie ossee e cardiache. In generale, le difficoltà principali per chi si approccia per la prima volta a questo metodo riguardano la coordinazione delle cellule, l’asetticità durante l’etichettatura e l’allestimento del paziente. Per l’applicazione immediata delle cellule, iniziare applicando un gel di accoppiamento acustico sull’arto rasato e utilizzare un trasduttore lineare per esaminare sistematicamente l’intera regione metacarpale palmares, ottenendo immagini seriali trasversali e longitudinali per identificare la zona di lesione massima.Dopo la somministrazione dell'anestetico locale, detergere il sito di impianto con una soluzione chirurgica a base di clorexidina per almeno cinque minuti, seguita da una passata con garza imbevuta di etanolo. Indossare prima un paio di guanti quando l'animale è stato preparato, quindi pelletizzare un'aliquota di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo pari a una volta 10 alla settima in un millilitro di supernatante del midollo osseo mediante centrifugazione. Successivamente, aspirare il supernatante con una siringa da due millilitri, dotata di un ago da 18 o 19 gauge, lasciando circa 100 microlitri di soluzione nel tubo.Trasferire il soprannatante in una provetta da microcentrifuga posta sul ghiaccio, quindi risospendere delicatamente le cellule nei residui 100 microlitri di soprannatante agitando leggermente. Accertarsi che le cellule siano completamente risospese e che non siano presenti grumi visibili di tessuto. Successivamente, lasciare le cellule a temperatura ambiente.Ora mescolare un millilitro del Protec nutato al technetio in una provetta contenente H-M-P-A-O. Dopo cinque minuti, utilizzare una siringa da un millilitro con ago per trattare le cellule staminali mesenchimali con l'intero aliquota di TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Quindi chiudere la provetta con il tappo, mescolare delicatamente le cellule agitando leggermente e posizionare la provetta a temperatura ambiente dietro uno schermo al piombo.Dopo 30 minuti, aprire il tubo con una pinzetta e utilizzare una siringa da un millilitro per tubo dotata di un ago da 21 gauge per aggiungere un millilitro di PBS alle cellule. Richiudere il tubo e mescolare le cellule. Successivamente, centrifugare le cellule e utilizzare la siringa da due millilitri per trasferire con attenzione il soprannatante in un tubo etichettato come lavaggio uno, presumibilmente schermato.Quindi lavare il pellet in un altro millilitro di PBS come appena dimostrato. Trasferire il secondo lavaggio nel tubo schermato etichettato W2 dopo il secondo lavaggio. Risospendere accuratamente le cellule nel PBS residuo e nel volume aliquotato di sopranatante di midollo osseo freddo su ghiaccio, tenendo il trasduttore in parallelo con l'ago.Introdurre lentamente un ago da 1,5 o due pollici, calibro 20, nella zona di massimo danno, al centro della lesione, in orientamento longitudinale. Successivamente, utilizzando l'apposita protezione, aspirare le cellule in una siringa da due millilitri con sistema lure-lock dotata di ago da calibro 20 e scartare l'ago, avendo cura di non perdere alcun liquido. Dopo aver collegato la siringa all'ago precedentemente posizionato nel tendine, posizionare la sonda ecografica al di sotto dell'ago in modo che la traiettoria dell'ago nel tessuto sia chiaramente visibile ed iniettare le cellule a ritmo lento ma costante nella lesione.Verificare che il fluido espulso nella lesione sia visibile all'ecografia come liquido coico contenente bolle d'aria iperecogene; una volta somministrate tutte le cellule, rimuovere l'ago. Utilizzare le opzioni di acquisizione dello studio e immagine statica ossea nel software di elaborazione per acquisire immagini statiche per 60 secondi ciascuna. Successivamente, ottenere immagini laterali dalla zona della lesione, dal carpo fino all'estremità distale, dalla zona equivalente dell'arto controlaterale, dal campo polmonare sinistro e dalla tiroide sinistra nei tempi indicati.Quindi selezionare la regione di interesse e gli strumenti ellittici e rimodellare la maschera di selezione sull'area della lesione in modo appropriato. Infine, scegliere l'opzione aggiungi due statistiche per ottenere i conteggi relativi alla regione di interesse. Assicurarsi che vengano registrate regioni di interesse di dimensioni identiche per ogni animale nei diversi punti temporali.Dopo la somministrazione intralesionale, le cellule verranno osservate come un'area focale di segnale con una limitata diffusione delle cellule nel tessuto tendineo circostante nel tempo. Al contrario, quando le cellule vengono somministrate mediante perfusione regionale attraverso la vena palmare digitale, si osserva una graduale riduzione del segnale nel sito di iniezione. Nel tempo, i campi polmonari sono solitamente negativi dopo iniezione intralesionale, ma occasionalmente può essere rilevato in tempi precoci un segnale molto focale che diventa più generalizzato nel tempo.La tiroide rimane negativa anche con questa via di somministrazione. La perfusione regionale mostra inoltre un segnale focale nei polmoni, che nel tempo diventa più diffuso, sebbene l'intensità del segnale sia significativamente maggiore rispetto a quella osservata con la via intralesionale. Con una tiroide che spesso presenta anch'essa un segnale focale, si considerano il conteggio totale iniziale di radioisotopo delle cellule al tempo zero prima dell'iniezione e i conteggi del primo gammagramma nella regione di interesse.Il tempo zero post iniezione può essere utilizzato per calcolare la percentuale di riduzione dei conteggi in ogni punto temporale successivo all'iniezione, al fine di determinare il decadimento previsto del TC 99 M dai conteggi iniziali. La persistenza delle cellule rimaste nel sito di iniezione può quindi essere calcolata per ogni tempo successivo all'iniezione. Seguendo questa procedura, altre vie di somministrazione cellulare possono essere applicate per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla capacità di homing delle cellule staminali mesenchimali dopo il loro sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina regionale per esplorare metodi volti a migliorare il mantenimento cellulare all'interno delle lesioni tendinee. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come etichettare le cellule e registrarne la distribuzione e la concentrazione in diversi sistemi organici. Non dimenticare che lavorare con radiazioni ionizzanti può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale, monitor di radiazione, schermature in piombo e lo smaltimento corretto dei rifiuti contaminati sono essenziali durante l'esecuzione di questa procedura.

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Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Un modello murino sperimentale di metastasi ossee è stata fondata dopo la consegna intracardiaca di cellule tumorali che esprimono luciferasi mammarie. Sviluppo del tumore e ha portato lesione osteolitica sono stati monitorati longitudinalmente con bioluminescenza e micro-TC.

Monitoraggio metastasi tumorali e lesioni osteolitiche con bioluminescenza e Micro CT Imaging

La misurazione quantitativa della funzione progenitrici del midollo in guarigione della frattura richiede una tecnologia di imaging seriale ad alta risoluzione. Qui, sono ottenute utilizzando protocolli per microscopia intravitale e inseguimento osteo-lineage sequenzialmente immagine e quantificare la migrazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali endogene osteogenico / progenitrici nel processo di riparazione di fratture ossee.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

La natura delle interazioni tra staminali e progenitrici di cellule ematopoietiche (HSPCs) e nicchie di midollo osseo è poco conosciuta. Modifiche hardware personalizzato e un protocollo di acquisizione multi-step consentono l'utilizzo di due fotoni e microscopia confocale per immagine ex vivo HSPCs etichettati homed all'interno delle aree del midollo osseo, interazioni monitoraggio e movimento.

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I monociti sono regolatori chiave dell'immunità innata e svolgono un ruolo critico nel rinnovamento del sistema fagocitario mononucleare periferico e in caso di infiammazione. Questo manoscritto descrive la procedura di imaging in tempo reale del midollo osseo calvaria di topo per studiare il meccanismo di mobilizzazione dei monociti.

Monitoraggio midollo osseo di topo monociti<em&gt; In Vivo</em

Il protocollo descrive un nuovo modello di camera a finestra del femore murino che può essere utilizzato per tracciare il movimento delle cellule nel midollo osseo femorale in vivo. La microscopia a fluorescenza multifotone intravitale viene utilizzata per visualizzare tre componenti del midollo osseo femorale (vascolarizzazione, matrice di collagene e neutrofili) nel tempo.

Femore finestra del modello Camera per<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule nel midollo osseo murino

Questo protocollo descrive un modo efficiente per monitorare la persistenza delle cellule e la biodistribuzione di adiposo-derivate cellule staminali mesenchimali umane (haMSCs) di fluorescenza da' etichettatura in un modello di osteoartrite (KOA) del ginocchio di ratto tramite iniezione intra-articolare (IA).

In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

Qui usiamo bioluminescenti, raggi x ed emissione di positroni tomografia/computato tomografia imaging per studiare l'attività come inibitore di mTOR urta i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in un modello dello xenotrapianto. Questo permette analisi fisiologicamente pertinenti, non invasivo e multimodale dell'effetto anti-mieloma di terapie designando i tumori del midollo osseo-engrafted mieloma in vivo.

Formazione immagine di tomografia multimodale bioluminescenti ed emissione positronica tomografia/computazionale di mieloma multiplo del midollo osseo xenotrapianti in topi NOG

Presentato qui è un protocollo per la consegna e il monitoraggio di cellule staminali mesenchymale non invasive (MSC) in un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche. Le nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetiche sono impiegate come sonda di risonanza magnetica (MRI) per l'etichettatura MSC e il tracciamento in vivo non invasivo dopo la consegna intranasale mediante risonanza magnetica in tempo reale.

Monitoraggio delle cellule staminali mesenchymale con etichetta chimica dell'ossido di ferro superparamagnetico utilizzando la risonanza magnetica dopo la consegna intranasale in un modello murino traumatico da lesioni cerebrali

Questo protocollo descrive il rilevamento della migrazione delle cellule staminali scheletriche periosteali mediate da CCL5 in tempo reale utilizzando la microscopia intravitale animale vivo.

Imaging in tempo reale della migrazione indotta da CCL5 di cellule staminali scheletriche periosteali nei topi

Iniezioni locali di un colorante mitocondriale con etichetta di dotante terminale di cellula di Schwann in vivo per microscopia confocale. Questo metodo utilizza prove di concetto dimostrate su tessuto muscolare scheletrico di topi con muscoli sani o malati per fornire una visualizzazione mitocondriale ad alta risoluzione.

Metodi per la quantificazione in situ della morfologia mitocondriale nelle cellule muscolari e terminali di Schwann di topi

Scopri il tracciamento non invasivo di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mediante scintigrafia gamma in cavalli con tendinopatia. Questo metodo consente di valutare la sopravvivenza e la distribuzione cellulare nel tempo.

In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia (Video) | JoVE Journal

In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

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