In Vivo Imaging e tracciamento di tecnezio-99m etichetta cellule staminali mesenchimali del midollo osseo in Equine Tendinopatia

L'obiettivo generale di questo protocollo è seguire in modo non invasivo la distribuzione e il destino delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo marcate dopo la loro iniezione mediante scintigrafia gamma. Il destino delle cellule staminali dopo l'iniezione è poco compreso. I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente di tracciare in modo non invasivo le cellule staminali in multipli organi dopo la somministrazione e che la breve emivita dell'osteo A ne assicura l'eliminazione entro 48 ore.

Sebbene ciò abbia fornito informazioni sull'uso delle cellule staminali nella terapia delle tendinopatie spontanee, potrebbe essere impiegato anche per lo studio di terapie per malattie ossee e cardiache. In generale, le difficoltà principali per chi si approccia per la prima volta a questo metodo riguardano la coordinazione delle cellule, l’asetticità durante l’etichettatura e l’allestimento del paziente. Per l’applicazione immediata delle cellule, iniziare applicando un gel di accoppiamento acustico sull’arto rasato e utilizzare un trasduttore lineare per esaminare sistematicamente l’intera regione metacarpale palmares, ottenendo immagini seriali trasversali e longitudinali per identificare la zona di lesione massima.

Dopo la somministrazione dell'anestetico locale, detergere il sito di impianto con una soluzione chirurgica a base di clorexidina per almeno cinque minuti, seguita da una passata con garza imbevuta di etanolo. Indossare prima un paio di guanti quando l'animale è stato preparato, quindi pelletizzare un'aliquota di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo pari a una volta 10 alla settima in un millilitro di supernatante del midollo osseo mediante centrifugazione. Successivamente, aspirare il supernatante con una siringa da due millilitri, dotata di un ago da 18 o 19 gauge, lasciando circa 100 microlitri di soluzione nel tubo.

Trasferire il soprannatante in una provetta da microcentrifuga posta sul ghiaccio, quindi risospendere delicatamente le cellule nei residui 100 microlitri di soprannatante agitando leggermente. Accertarsi che le cellule siano completamente risospese e che non siano presenti grumi visibili di tessuto. Successivamente, lasciare le cellule a temperatura ambiente.

Ora mescolare un millilitro del Protec nutato al technetio in una provetta contenente H-M-P-A-O. Dopo cinque minuti, utilizzare una siringa da un millilitro con ago per trattare le cellule staminali mesenchimali con l'intero aliquota di TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Quindi chiudere la provetta con il tappo, mescolare delicatamente le cellule agitando leggermente e posizionare la provetta a temperatura ambiente dietro uno schermo al piombo.

Dopo 30 minuti, aprire il tubo con una pinzetta e utilizzare una siringa da un millilitro per tubo dotata di un ago da 21 gauge per aggiungere un millilitro di PBS alle cellule. Richiudere il tubo e mescolare le cellule. Successivamente, centrifugare le cellule e utilizzare la siringa da due millilitri per trasferire con attenzione il soprannatante in un tubo etichettato come lavaggio uno, presumibilmente schermato.

Quindi lavare il pellet in un altro millilitro di PBS come appena dimostrato. Trasferire il secondo lavaggio nel tubo schermato etichettato W2 dopo il secondo lavaggio. Risospendere accuratamente le cellule nel PBS residuo e nel volume aliquotato di sopranatante di midollo osseo freddo su ghiaccio, tenendo il trasduttore in parallelo con l'ago.

Introdurre lentamente un ago da 1,5 o due pollici, calibro 20, nella zona di massimo danno, al centro della lesione, in orientamento longitudinale. Successivamente, utilizzando l'apposita protezione, aspirare le cellule in una siringa da due millilitri con sistema lure-lock dotata di ago da calibro 20 e scartare l'ago, avendo cura di non perdere alcun liquido. Dopo aver collegato la siringa all'ago precedentemente posizionato nel tendine, posizionare la sonda ecografica al di sotto dell'ago in modo che la traiettoria dell'ago nel tessuto sia chiaramente visibile ed iniettare le cellule a ritmo lento ma costante nella lesione.

Verificare che il fluido espulso nella lesione sia visibile all'ecografia come liquido coico contenente bolle d'aria iperecogene; una volta somministrate tutte le cellule, rimuovere l'ago. Utilizzare le opzioni di acquisizione dello studio e immagine statica ossea nel software di elaborazione per acquisire immagini statiche per 60 secondi ciascuna. Successivamente, ottenere immagini laterali dalla zona della lesione, dal carpo fino all'estremità distale, dalla zona equivalente dell'arto controlaterale, dal campo polmonare sinistro e dalla tiroide sinistra nei tempi indicati.

Quindi selezionare la regione di interesse e gli strumenti ellittici e rimodellare la maschera di selezione sull'area della lesione in modo appropriato. Infine, scegliere l'opzione aggiungi due statistiche per ottenere i conteggi relativi alla regione di interesse. Assicurarsi che vengano registrate regioni di interesse di dimensioni identiche per ogni animale nei diversi punti temporali.

Dopo la somministrazione intralesionale, le cellule verranno osservate come un'area focale di segnale con una limitata diffusione delle cellule nel tessuto tendineo circostante nel tempo. Al contrario, quando le cellule vengono somministrate mediante perfusione regionale attraverso la vena palmare digitale, si osserva una graduale riduzione del segnale nel sito di iniezione. Nel tempo, i campi polmonari sono solitamente negativi dopo iniezione intralesionale, ma occasionalmente può essere rilevato in tempi precoci un segnale molto focale che diventa più generalizzato nel tempo.

La tiroide rimane negativa anche con questa via di somministrazione. La perfusione regionale mostra inoltre un segnale focale nei polmoni, che nel tempo diventa più diffuso, sebbene l'intensità del segnale sia significativamente maggiore rispetto a quella osservata con la via intralesionale. Con una tiroide che spesso presenta anch'essa un segnale focale, si considerano il conteggio totale iniziale di radioisotopo delle cellule al tempo zero prima dell'iniezione e i conteggi del primo gammagramma nella regione di interesse.

Il tempo zero post iniezione può essere utilizzato per calcolare la percentuale di riduzione dei conteggi in ogni punto temporale successivo all'iniezione, al fine di determinare il decadimento previsto del TC 99 M dai conteggi iniziali. La persistenza delle cellule rimaste nel sito di iniezione può quindi essere calcolata per ogni tempo successivo all'iniezione. Seguendo questa procedura, altre vie di somministrazione cellulare possono essere applicate per rispondere ad ulteriori domande riguardo alla capacità di homing delle cellule staminali mesenchimali dopo il loro sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina regionale per esplorare metodi volti a migliorare il mantenimento cellulare all'interno delle lesioni tendinee. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come etichettare le cellule e registrarne la distribuzione e la concentrazione in diversi sistemi organici. Non dimenticare che lavorare con radiazioni ionizzanti può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale, monitor di radiazione, schermature in piombo e lo smaltimento corretto dei rifiuti contaminati sono essenziali durante l'esecuzione di questa procedura.