Name: Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Scopri un metodo ELISA avanzato per rilevare l'α-sinucleina associata alla malattia nel cervello di topi transgenici A53T. Questa tecnica permette di quantificare rapidamente l'accumulo proteico nelle regioni encefaliche caudali.

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Gli autori desiderano ringraziare Damien Gaillard per vaccinazioni e il follow-up di esperimenti sugli animali. Questo lavoro è stato sostenuto da ANSES (Agenzia francese per l&#39;Alimentazione, Ambiente e Salute e Sicurezza), e da una sovvenzione della Fondazione Parkinson Francia.

Tutte le procedure ei protocolli che coinvolgono animali sono conformi alla direttiva 86/609 / CEE e ratificata da Cometh, il comitato nazionale francese per l&#39;esame di etica nella sperimentazione animale (protocollo 11-0043), CE. Gli animali sono stati alloggiati e curati in Anses di impianti autorizzati sperimentali a Lione (approvazione B 69387 0801). 1. Preparazione di topi <ol><li> Euthanize topi da una iniezione intraperitoneale di dose letale di pentobarbital sodico. </li><li> Recuperare l&#39;intero cervello dal cranio del mouse e mettetelo in una capsula di Petri di plastica 35 millimetri in ghiaccio fino all&#39;estrazione. </li><li> Estrarre il midollo spinale cervicale. NOTA: αS Estratto sia da una delle due metà del cervello dopo sezionamento sagittale o dal cervello dei topi sezionati, disponibile dopo gli esperimenti elencati nella tabella 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Sperit </td><td> Mice Inoculo (equivalente cervello) </td><td> Periodo di sopravvivenza (Dpi) </td><td> Mediana / sopravvivenza massima (giorni) </td><td> αS d individuazione da ELISA / WB / IHC </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Topo inoculato </td><td> 441 ± 166 </td><td> 419/736 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Topi inoculati (0,2 mg) </td><td> 150 ± 52 </td><td> 140/241 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Elenco degli esperimenti condotti sui topi M83. Vaccinazioni sono state eseguite a 6 settimane per l&#39;esperimento 2 nella zona striato-corticale con 20 ml di un omogenato cervello di un topo malato (1% peso / volume in glucosata al 5%), dopo anestesia di sei settimane topi M83 omozigoti del 3% inalazione isoflurano. dpi: giorni dopo inoculzione. 2. αS estrazione da Brain Metà <ol><li> Sagittalmente tagliare il cervello per ottenere due metà. Pesare ogni metà in una provetta contenente ribolysis sfere di macinazione. </li><li> Preparare sale elevato (HS) tampone contenente 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% fosfatasi e inibitori della proteasi cocktail. Aggiungere tampone Alta Sale le metà del cervello per ottenere il 20% (peso / volume) omogenati. </li><li> Preparare campioni delle due metà del cervello con un omogeneizzatore meccanico a 6,0 m / s per 23 secondi per due volte. Dopo i primi 23 sec omogeneizzazione, posizionare i tubi contenenti i omogenati in ghiaccio per 2 minuti prima del secondo ciclo di 23 sec. </li><li> Centrifugare i campioni a 1000 xg per 5 minuti per eliminare i frammenti cerebrali unground. Recuperare i supernatanti, dividerli in 200 microlitri aliquote e tenerli a -80 ° C per la successiva analisi ELISA. </li></ol> 3. αS Estrazione da sezionato regioni cerebrali <ol><li> Sezionare unintero cervello in un piatto di plastica Petri 35 millimetri sul ghiaccio con una lente d&#39;ingrandimento a bassa potenza (8X ingrandimento) utilizzando due forcipes cui estremità sono tenuti insieme, tranne quando sezionare l&#39;ippocampo. Non superare 10 minuti per preservare l&#39;integrità del cervello. Posizionare il cervello destro rivolto verso l&#39;alto e recuperare i seguenti regioni del cervello in questo ordine: <ol><li> Separate uno dei due bulbi olfattivi con pinze poste appena dietro la lampadina. Staccarlo dal cervello con un movimento verso il basso. Ripetere questa operazione per la seconda lampadina. </li><li> Cuneo delicatamente la pinza tra le due cortecce e spostarlo in avanti per facilitare dissociazione delle due cortecce. Mantenere il cervello in posizione con una pinza, utilizzare un altro per separare corteccia dal ippocampo. </li><li> Posizionare le pinze 2 millimetri al di sotto della corteccia. Mantenere una leggera pressione sulle pinze fino all&#39;inizio della ippocampo è visibile. Rimuovere la prima parte della corteccia, e ripetere con la seconda parte. Utilizzare le pinze per separare le due corteccepartendo nell&#39;ippocampo e procedendo verso la parte anteriore del cervello. </li><li> Posizionare le pinze aperte intorno uno dei ippocampi. Chiudere la pinza sul fondo dell&#39;ippocampo quindi rimuoverla, recuperando il più possibile. Ripetere la procedura per il secondo ippocampo. </li><li> Posizionare le pinze aperte sotto uno dei striata e separare delicatamente dal cervello. Utilizzare le pinze per rimuovere ogni residuo corteccia dallo striato. Ripetere questa procedura per il secondo striato. </li><li> Utilizzare le pinze per deprimere delicatamente da 2 mm, il contorno del cervelletto per facilitare la separazione del cervelletto dal cervello. Posizionare le pinze appena dietro il cervelletto e toglierlo muovendo la pinza in avanti. </li><li> Utilizzare l&#39;ampia parte della pinza per sollevare il mesencefalo per vedere chiaramente dove si unisce al tronco cerebrale. Effettuare una incisione verticale all&#39;incrocio quindi rimuovere il tronco cerebrale. </li><li> Posizionare le pinze dietro il mesencefalo, che hos composta da quattro strutture arrotondati. Incidere verticalmente fino mesencefalo è stato completamente separato dal cervello rimanente. </li></ol></li><li> Preparare omogenati di variabile% (peso / volume) in tampone HS, a seconda della quantità di tessuti disponibili, cioè, 5% omogenato per un peso compreso tra 10 e 30 mg, 10% per un peso compreso tra 30 e 80 mg, e 20% per un peso superiore a 80 mg. <ol><li> Aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni del cervello sezionati per ottenere l&#39;atteso% dell&#39;omogeneizzato. </li><li> Vortex e controllare che i tessuti sono completamente immersi nel buffer HS. </li><li> Omogeneizzare campioni preparati dalle regioni cerebrali sezionati o del midollo spinale cervicale con una smerigliatrice tessuto composto da un tubo di vetro borosilicato e due pestelli, A e B. </li><li> Versare ciascuna regione del cervello di essere schiacciato direttamente nel tubo. Inserire pestello A nella provetta e ritrarlo. Ripetere il movimento circa dieci volte di dissociare il tessuto. Quindi utilizzare pestello B a continue molatura il tessuto con altri 20 movimenti. Trasferire le omogenati in una provetta da 1,5 ml con una pipetta 1 ml. </li></ol></li><li> Centrifugare i campioni a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C per eliminare eventuali frammenti cerebrali unground. Recuperare i supernatanti, li suddividere in 200 microlitri aliquote e tenerli a -80 ° C per la successiva analisi ELISA. </li></ol> 4. Individuazione di αS con metodo ELISA <ol><li> Diluire anticorpi di copertura di 0,01 ng / ml. Utilizzare policlonale di coniglio anti-αS o monoclonale clone 42 anticorpo in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO3 tampone (pH 9,6). </li><li> Rivestire la 96 pozzetti con 100 pl per pozzetto di questa soluzione di rivestimento, e lasciare a 4 ° CO / N. Utilizzare l&#39;anticorpo policlonale di coniglio anti-αS nella soluzione di rivestimento per l&#39;ELISA utilizzando anticorpi di rilevamento syn514, clonare 42, LB509, AS11, 4D6 e 8a5. Usare l&#39;anti-αS anticorpo monoclonale clone 42 come una soluzione di rivestimentoin combinazione con anticorpo di rilevazione anti-pSer129 αS. NOTA: Se necessario, le piastre possono essere conservati a 4 ° C per una settimana prima della ELISA viene eseguita. </li><li> Utilizzare una rondella piatto per lavare i piatti per cinque volte con 300 ml di PBS con 0,05% di Tween 20 (PBST) per pozzetto. Da questo punto in poi, l&#39;incubazione è a RT. </li><li> Aggiungere 200 ml di T20 PBS tampone di bloccaggio per pozzetto. Agitare per 1 ora a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST. </li><li> Diluire le omogenati di cervello (diluizione 1: 100 del omogenati 20%, 1:50 del 10% omogenati e 1:25 delle omogenati 5% in PBST BSA 1%), e aggiungere 100 ml di ogni bene. Poi incubare per 2 ore agitando a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST. </li><li> Aggiungere i diversi anticorpi di rilevamento αS in PBST con BSA 1% alle diluizioni indicate nella lista dei materiali. Incubare per 1 ora a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST. </li><li> Aggiungi sia contro-mouse o anti-coniglio coniugati IgG HRP diluito 1: 8.000 in PBST integrato con BSA 1% per 1 ora agitando a 150 rpm. Lavare le piastre per cinque volte con PBST. </li><li> Aggiungere 100 ml di 3,3 &#39;, soluzione 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB) in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti al buio agitando a 150 rpm. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 100 ml di HC1 per bene poi misurare l&#39;assorbanza a 450 nm con il lettore per micropiastre. </li><li> Per l&#39;analisi dei dati, sottrarre il valore di assorbanza ottenuto in un pozzo con tutti i reagenti tranne i campioni di cervello di topo (Bianco) dai valori OD misurati per ciascuno dei campioni analizzati. </li></ol> 5. epitopi Mapping <ol><li> Eseguire la mappatura epitopi secondo il metodo descritto da Osman 16. In breve, i peptidi del punto della sequenza α-sinucleina umana contenente 12 aminoacidi su nitrocellulosa con 10 amminoacidi che si sovrappongono. </li><li> Blocco con 50 mM Tris / NaCl 150 mM tampone pH 10 contenente 0,05% di Tween 20 e 5% di latte in polvere. Incubare l&#39;anticorpo nel bloccare soluzione ad una concentrazione di 2 mg per ml dell&#39;anticorpo a 2-10 ° CO / N. </li><li> Lavare la membrana tre volte con 50 mM Tris / 150 NaCl mM tampone pH 10 contenente lo 0,05% di Tween 20. Incubare con la capra coniugato anti-topo IgG HRP. Lavare la membrana altre cinque volte usando lo stesso tampone poi macchia con un kit di colorazione macchia TMB occidentale. </li></ol> 6. Analisi statistica <ol><li> Utilizzare il pacchetto software R e nlme effettuare effetti misti regressioni per modellare OD. Per ogni confronto, eseguire un modello di regressione effetto misto. Utilizzare un effetto fisso per distinguere sintomatica da gruppi asintomatici. </li><li> Utilizzare un effetto casuale per riflettere le variazioni di ripetizioni per un dato mouse. Controllare omoschedasticità esaminando i residui e, se necessario, utilizzare le funzioni di varianza per modellare la struttura della varianza degli errori all&#39;interno del gruppo in linea con Pinheiro e Bates 1Impostare 0,05 come soglia di significatività P. 7. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi in conflitto da dichiarare.

L&#39;uso di un ELISA è stato dimostrato per rilevare specificamente αS D direttamente da omogenati di cervello mouse durante la malattia nel modello di topo transgenico M83. In effetti, questo ELISA potrebbe facilmente distinguere malati topi M83 da topi sani M83 utilizzando solo intere omogenati di cervello in tampone alta Salt. Le fasi più critiche per ottenere risultati di successo che utilizzano questo ELISA sono: dissezione correttamente le diverse regioni del cervello di to...

La maggior parte dei metodi attuali per rilevare l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) nei modelli sperimentali di malattia di Parkinson (DP), come l'immunoistochimica o il Western blot, sono lenti e non quantitativi. Questa malattia neurodegenerativa è caratterizzata dall'aggregazione di alpha-sinucleina principalmente sotto forma di inclusioni contenenti una forma aggregata della proteina presinaptica normalmente solubile αS1,2 (corpi di Lewy e neuriti di Lewy). Normalmente solo marginalmente fosforilata, αS è iperfosforilata al suo residuo serina 129 in queste inclusioni3 e può essere monitorata da anticorpi specificamente diretti contro αS fosforilata su Ser129, fornendo così un marcatore affidabile della patologia.
Recenti ricerche suggeriscono che un meccanismo "simile ai prioni" potrebbe essere coinvolto nella propagazione dell'aggregazione di αS all'interno del sistema nervoso di un paziente affetto4,5. Questi studi hanno riportato l'accelerazione di una sinucleinopatia inoculando estratti cerebrali contenenti αSD in un modello di topo transgenico (M83) che esprime una proteina αS umana mutata A53T associata a un grave disturbo motorio che si verifica man mano che i topi invecchiano6. Allo stesso modo, l'inoculazione intracerebrale di αS ricombinante aggregato nello stesso modello di topo M83 ha confermato l'accelerazione dell'aggregazione5. L'induzione di depositi di αS fosforilata è stata riportata anche dopo l'inoculazione di topi selvatici C57Bl/6 con αS ricombinante fibrillare o estratti cerebrali di pazienti umani con DLB7,8. Sacino et al.9 hanno recentemente sottolineato che dopo l'iniezione di αS umano fibrillare, una formazione di inclusioni di αS cerebrale diffusa e progressiva potrebbe essere indotta nei topi M83, ma non nei topi transgenici E46K o nei topi non transgenici in cui le inclusioni di αS indotte erano transitorie e principalmente limitate al sito di iniezione. Studi recenti su scimmie hanno confermato la propagazione degli aggregati di αS dopo l'inoculazione di estratti derivati dalla DP in specie più vicine all'uomo10.
Il legame tra le alterazioni di αS e la malattia di Parkinson suggerisce che αSD è un potenziale biomarcatore per la malattia di Parkinson11. Uno studio recente ha mostrato il rilevamento di aggregati solubili oligomerici di α-sinucleina nel liquido cerebrospinale umano (LCS) e nel plasma come potenziale biomarcatore per la malattia di Parkinson basato su un sistema sandwich ELISA convenzionale utilizzando lo stesso anticorpo per catturare e rilevare αS12. Basandosi sullo stesso metodo, le proteine multimeriche sono state riconosciute in campioni biologici, incluso il cervello, poiché ci sono molteplici copie di epitopi presenti nelle forme assemblate13. Molto recentemente, l'αS patologico nel LCS di pazienti con una comprovata patologia dei corpi di Lewy è stato rilevato utilizzando sia un kit ELISA con un anticorpo altamente specifico contro αSD (5G4) sia un saggio di immunoprecipitazione14. Questi metodi potrebbero differenziare i pazienti con DP/DLB da altri tipi di demenza.
La propagazione "simile ai prioni" dell'aggregazione di αS è stata ulteriormente studiata nel modello di topo transgenico M83 utilizzando un approccio ELISA progettato per identificare specificamente αSD15. In questo studio, riportiamo il protocollo ELISA dettagliato utilizzato per rilevare quantitativamente αSD nei topi malati (inoculati o meno con αSD da topi M83 malati) e più in particolare nelle regioni cerebrali specificamente bersagliate dal processo patologico in questo modello di topo transgenico M834.

<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Produced at Anses</td><td></td><td>Detection antibody 1/1,000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Detection antibody 1/3,000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Detection antibody 1/1,000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Detection antibody 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Coating and detection antibody (1/2,000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Provided by Dr. Anderson</td><td></td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>polyclonal anti-&alpha;syn antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Coating antibody</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS buffer</td><td></td><td></td><td>Adjust at pH 7.5 and keep at 4 &#176;C</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Adjust at pH 7.5</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Stock solution 100 mM, toxic</td></tr><tr><td>1% phosphatase cocktail</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50x concentrated</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tampon carbonate 50 mM pH 9.6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2.86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3.36 g/L, pH&nbsp;9.6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS blocking buffer</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10x concentrated</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Used for ELISA</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>Used for epitope mapping</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>keep on ice at this step</td></tr><tr><td>Grinding tubes</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Plate washer</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Low power magnifier&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8X magnification</td></tr><tr><td>Forceps Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>For dissection steps</td></tr><tr><td>Transfer pipette 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>

il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato elisa nel cervello di topi transgenici a53t umano mutato α-sinucleina

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

Oltre ai metodi affermati come Western blot, sono necessari nuovi metodi per quantificare rapidamente e facilmente malattia associata α-sinucleina (αS D) in modelli sperimentali di synucleopathies. Una linea di topi transgenici (M83) che sovra-esprimono i αS A53T umani e sviluppare spontaneamente una drammatica fenotipo clinico tra gli otto ei 22 mesi di età, caratterizzata da sintomi quali la perdita di peso, prostrazione e disabilità motoria grave, è stato utilizzato in questo studio. Per le analisi molecolari di αS D (αS associata a malattia) in questi topi, un test ELISA è stato progettato per quantificare specificamente αS D nei topi malati. Analisi del sistema nervoso centrale in questo modello di topo ha mostrato la presenza di αS D principalmente nelle regioni del cervello caudale e il midollo spinale. Non ci sono state differenze nella distribuzione αS D tra diverse condizioni sperimentali che portano alla malattia clinica, vale a dire, in uninoculated e normalmente invecchiamento topi transgenici e in topi inoculati con estratti di cervello di topi malati. La rilevazione specifica di αS D immunoreactivity utilizzando un anticorpo contro Ser129 fosforilata αS di ELISA essenzialmente correlati con quello ottenuto da Western Blot e immunoistochimica. Inaspettatamente, risultati simili sono stati osservati con diversi altri anticorpi contro la parte C-terminale di αS. La propagazione di αS D, suggerendo il coinvolgimento di un meccanismo di &quot;prioni-like&quot;, può quindi essere facilmente monitorato e quantificata in questo modello murino utilizzando un approccio ELISA.

In questo studio, i test ELISA utilizzate specificatamente identificati associata a malattia αS (αS D) in omogenati di cervello preparate in un buffer Alta sale da malati topi M83. Utilizzando un anticorpo che riconosce specificamente pSer129 αS (p = 0,0074), ELISA distingue facilmente vecchi, topi malati (&gt; 8 mesi) da giovani (2-5 mesi), i topi sani M83 (Figura 1). Molti altri anticorpi hanno mostrato segnali altrettanto elevati (&gt; 0,6 OD) solo in omogenati di cervello di topi malati. ...

Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare l'accumulo dell'alfa-sinucleina associata alla malattia in un modello murino transgenico della malattia di Parkinson utilizzando un approccio Eliza quantitativo. Ciò viene ottenuto permettendo prima ai topi non inoculati di invecchiare normalmente o inoculando i topi intracerebralmente con un estratto cerebrale di M 83 malato. Dopo che i topi sviluppano la malattia clinica e vengono sacrificati, le regioni cerebrali dei topi vengono dissezionate.Successivamente, da ogni regione cerebrale vengono preparati omogeneizzati in tampone a elevato contenuto di sale e su tali omogeneizzati viene eseguita l'Eliza per quantificare l'alfa-sinucleina associata alla malattia in ogni regione cerebrale. I risultati Eliza mostrano che la forma associata alla malattia della proteina alfa-sinucleina si accumula principalmente nelle regioni cerebrali coddle, compresi il mesencefalo e il tronco cerebrale, nonché nel midollo spinale dei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica Eliza rispetto ai metodi precedentemente disponibili come il western blot o l'immunoistochimica, è che fornisce una quantificazione rapida e affidabile dell'alfa-scle associata alla malattia.In questo modello sperimentale, questo metodo può aiutare a monitorare l'accumulo e la propagazione di questa proteina nel sistema nervoso centrale di questi tre topi MA. Ciò suggerisce il coinvolgimento di un meccanismo simile al cervello fino allo sviluppo della scienza clinica. Ulteriori sviluppi di questo metodo potrebbero essere considerati in futuro per lo studio di vari campioni biologici come il liquido cerebrospinale o il sangue che possibilmente contengono anche forme alfa alterate che dimostrano che questa procedura sarà un tecnico del nostro laboratorio.Tutte le procedure e i protocolli che coinvolgono animali erano in conformità con la direttiva CE 86 6 0 9 EEC e ratificati dal comm ETH, il Comitato Nazionale Francese. Per la Considerazione dell'Etica e della Sperimentazione Animale, gli animali sono stati alloggiati e curati in strutture sperimentali approvate da A e S a Leon Young dopo l'eutanazia dei topi e il prelievo del cervello e del midollo spinale. Secondo il protocollo di testo, posizionare un cervello intero in una piastra Petri su ghiaccio sotto una lente di ingrandimento a bassa potenza.Iniziare separando uno dei due bulbi olfattori posizionando le forbici appena dietro il bulbo. Utilizzando un movimento verso il basso, staccarlo dal cervello, quindi rimuovere il secondo bulbo in modo simile. Ora, mentre si tiene il cervello in posizione con le forbici, inserire delicatamente una seconda coppia di forbici tra i cortici sinistro e destro e spostarle in avanti per dissociare le due metà.Ora continuando a tenere il cervello in posizione. Posizionare la seconda forbice a due millimetri dietro il corteccia e mantenere la pressione verso l'alto per sollevare la corteccia dall'ippocampo. Quindi staccare la prima parte della corteccia iniziando dall'ippocampo e spostandosi verso la parte anteriore del cervello.Ripetere con la seconda metà. Quindi, posizionare le forbici attorno a uno degli ippocampi. Quindi chiudere delicatamente le forbici nella parte inferiore dell'organo e rimuoverlo delicatamente.Ripetere con il secondo ippocampo. Posizionare le forbici dietro uno degli striati e separarlo delicatamente dal cervello. Utilizzare le forbici per rimuovere qualsiasi corteccia rimanente dallo striato prima di rimuovere il secondo satu per separare il cervelletto dal resto del cervello con le forbici, deprimere delicatamente il contorno del cervelletto.Quindi posizionare le forbici dietro il cervelletto e spostare le forbici in avanti per rimuoverlo utilizzando la parte larga delle forbici sollevate come cefalo, che è composta da quattro strutture rotonde per vedere chiaramente dove si unisce il tronco cerebrale. Quindi fare un'incisione verticale alla giunzione prima di rimuovere il tronco cerebrale posizionando le forbici dietro il mesencefalo e in dimensione verticale per separarlo completamente dal resto del cervello. Per preparare l'omogeneizzato cerebrale, aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni cerebrali dissezionate per raggiungere una percentuale prevista di omogeneizzato come mostrato nella tabella sotto.Utilizzando un tritacarne composto da un tubo di vetro borosilicato e i pestelli A e B, versare una regione cerebrale da schiacciare nel tubo. Quindi, con il pestello A, omogeneizzare il tessuto 10 volte per dissociarlo. Quindi passare al pestello B e omogeneizzare altre 20 volte.Con una pipetta di trasferimento, trasferire l'omogeneizzato in un tubo da 1,5 millilitri, ripetendo l'omogeneizzazione con i campioni cerebrali rimanenti. Centrifugare i campioni a 1000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi raccogliere lo snat e dividerli in 200 microlitri Ali Watts. Conservare a meno 80 gradi Celsius per successiva analisi Eliza per effettuare Eliza su omogeneizzato cerebrale.Iniziare utilizzando 50 micromolar di tampone carbonato per diluire l'anticorpo di rivestimento anti alfa-sinucleina, conigli policlonale o monoclonale clone 42 a 0,01 nanogrammi per millilitro con 100 microlitri della soluzione di rivestimento dell'anticorpo rivestire i pozzetti di 96. Pozzi micropiastre e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte il giorno successivo. Aggiungere 300 microlitri di PBST nei pozzetti e utilizzare un lavapiatti per lavare le piastre cinque volte mentre si lavora a temperatura ambiente.Andando avanti, aggiungere 200 microlitri di tampone di bloccaggio T 20 PBS a ciascun pozzetto e scuotere le piastre a 150 RPM per un'ora prima di utilizzare PBST per lavare le piastre cinque volte utilizzando PBST 1%BSA diluire l'omogeneizzato cerebrale secondo le linee guida elencate qui e aggiungere 100 microlitri a ciascuno. Pozzetto, quindi incubare a temperatura ambiente e 150 RPM per due ore prima di utilizzare PBST per lavare le piastre. Cinque volte dopo il lavaggio finale, aggiungere gli anticorpi di rilevamento dell'alfa-sinucleina necessari diluiti in PBS BST e 1%BSA come elencato nella tabella due del protocollo di testo. Incubare a temperatura ambiente e 150 RPM per un'ora prima di lavare le piastre cinque volte come prima.Successivamente, aggiungere anticorpi IgG HRP coniugati anti topo o anti coniglio diluiti a uno su 8.000 in PBST 1%BSA e incubare a 150 RPM per un'ora prima di lavare le piastre cinque volte. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione TMB a ciascun pozzetto e incubare a 150 RPM per 15 minuti al buio. Fermare la reazione aggiungendo 100 microlitri di un acido cloridrico normale per pozzetto.Quindi utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 450 nanometri per l'analisi dei dati. Sottrarre il valore di densità ottica ottenuto nel pozzetto vuoto contenente solo tamponi e reagenti dalla densità ottica.I valori determinati dai campioni cerebrali effettuano un'analisi statistica secondo il protocollo di testo in questo studio, l'Eliza eseguita ha identificato specificamente l'alfa-sinucleina associata alla malattia pser 1 29 in omogeneizzato cerebrale da vecchi topi malati M 83. I topi non presenti nei giovani topi M 83. Ulteriori anticorpi testati come LB 5 0 9 hanno mostrato forti segnali nei topi malati ma non in quelli sani.La sensibilità analitica dell'ELIZA descritta in questo video è stata confrontata con

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Incubare con un enzima proteolitico per digerire i prioni normali, lasciando intatti gli aggregati resistenti.

Rilevamento di aggregati di proteine prioniche mal ripiegati nel tessuto cerebrale di topo mediante Western blotting

Fonte: Bétemps, D., et al.,  Rilevamento della α-sinucleina associata alla malattia mediante ELISA potenziato nel cervello di topi transgenici che sovraesprimono la α-sinucleina umana mutata A53T. J. Vis. Exp. (2015). Questo video mostra la procedura per rilevare la proteina α-sinucleina associata alla malattia neurodegenerativa nel tessuto cerebrale di topi transgenici utilizzando ELISA. Le fasi includono l'omogeneizzazione dei tessuti, la centrifugazione e il rilevamento ELISA della proteina...

Rilevamento della proteina associata alla malattia neurodegenerativa α-sinucleina mediante ELISA

Vi presentiamo un metodo di screening rapido e poco costoso per identificare regolatori trascrizionali utilizzando high-throughput transfezioni robotici e un dual-bagliore saggio di luciferasi in casa. Questo protocollo genera rapidamente dati scalo side-by-side funzionali per migliaia di geni ed è facilmente modificabile per indirizzare qualsiasi gene di interesse.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento di alfa-sinucleina (α-syn) sempre più insolubile/aggregata da tessuto cerebrale umano post-mortem. Attraverso l'utilizzo di tamponi con forza detergente crescente e tecniche di ultracentrifugazione ad alta velocità, è possibile esaminare le proprietà variabili dell'aggregazione α-syn in tessuti malati e non malati.

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Questo manoscritto descrive come la consegna genica locale mediata da vettori virali fornisca un modo attraente per esprimere i transgeni nel sistema nervoso centrale.  Il protocollo delinea tutti i passaggi cruciali per eseguire un'iniezione di vettore virale nella substantia nigra del ratto per sviluppare un modello animale basato su vettore virale per la malattia di Parkinson.

Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un sistema basato su cellule che replica la formazione dell'alfa-synuclein aggrega in vivo. Le inclusioni intracellulari dell'alfa-synuclein sono seminate in neuroni primari di interiorizzazione e propagazione di esogeno somministrato del microsomi nativo con alfa-synuclein aggregati isolati da topi transgenici malato dell'alfa-synuclein.

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

Questo lavoro analizza la dose vettoriale e il tempo di esposizione necessari per indurre neuroinfiammazione, neurodegenerazione e compromissione motoria in questo modello preclinico di malattia di Parkinson. Questi vettori che codificano la α-sinucleina umana vengono consegnati nella substantia nigra per ricapitolare la patologia sinucleina associata al morbo di Parkinson.

Analisi del modello murino della malattia di Parkinson indotto da vettori virali adeno-associati che codificano la α-sinucleina umana

Viene presentato un comodo metodo di perfusione alimentato a gravità per l'analisi istologica del sistema nervoso centrale del topo. Il rilevamento immunofluorescente della α-sinucleina fosforilata è dimostrato in un modello murino di malattia di Parkinson. Questo lavoro descrive anche in modo completo le fasi di perfusione transcardica, dissezione, congelamento / incorporamento dei tessuti e sezionamento congelato.

Un metodo di perfusione transcardica alimentato per gravità per l'analisi istologica del sistema nervoso centrale del topo

È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.

Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Scopri un metodo ELISA avanzato per rilevare l'α-sinucleina associata alla malattia nel cervello di topi transgenici A53T. Questa tecnica permette di quantificare rapidamente l'accumulo proteico nelle regioni encefaliche caudali.

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina (Video) | JoVE Journal

Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina

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