Il rilevamento della malattia associata α-sinucleina da avanzato ELISA nel cervello di topi transgenici A53T umano Mutato α-sinucleina
30 maggio 2015
Viene descritta un'ELISA che offre un approccio quantitativo innovativo. Rileva specificamente l'α-sinucleina associata alla malattia (αSD) in un modello di topo transgenico (M83) di sinucleinopatia utilizzando diversi anticorpi contro la forma αS fosforilata nella Ser129 o la parte C-terminale della proteina.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è monitorare l'accumulo dell'alfa-sinucleina associata alla malattia in un modello murino transgenico della malattia di Parkinson utilizzando un approccio Eliza quantitativo. Ciò viene ottenuto permettendo prima ai topi non inoculati di invecchiare normalmente o inoculando i topi intracerebralmente con un estratto cerebrale di M 83 malato. Dopo che i topi sviluppano la malattia clinica e vengono sacrificati, le regioni cerebrali dei topi vengono dissezionate.
Successivamente, da ogni regione cerebrale vengono preparati omogeneizzati in tampone a elevato contenuto di sale e su tali omogeneizzati viene eseguita l'Eliza per quantificare l'alfa-sinucleina associata alla malattia in ogni regione cerebrale. I risultati Eliza mostrano che la forma associata alla malattia della proteina alfa-sinucleina si accumula principalmente nelle regioni cerebrali coddle, compresi il mesencefalo e il tronco cerebrale, nonché nel midollo spinale dei topi. Il principale vantaggio di questa tecnica Eliza rispetto ai metodi precedentemente disponibili come il western blot o l'immunoistochimica, è che fornisce una quantificazione rapida e affidabile dell'alfa-scle associata alla malattia.
In questo modello sperimentale, questo metodo può aiutare a monitorare l'accumulo e la propagazione di questa proteina nel sistema nervoso centrale di questi tre topi MA. Ciò suggerisce il coinvolgimento di un meccanismo simile al cervello fino allo sviluppo della scienza clinica. Ulteriori sviluppi di questo metodo potrebbero essere considerati in futuro per lo studio di vari campioni biologici come il liquido cerebrospinale o il sangue che possibilmente contengono anche forme alfa alterate che dimostrano che questa procedura sarà un tecnico del nostro laboratorio.
Tutte le procedure e i protocolli che coinvolgono animali erano in conformità con la direttiva CE 86 6 0 9 EEC e ratificati dal comm ETH, il Comitato Nazionale Francese. Per la Considerazione dell'Etica e della Sperimentazione Animale, gli animali sono stati alloggiati e curati in strutture sperimentali approvate da A e S a Leon Young dopo l'eutanazia dei topi e il prelievo del cervello e del midollo spinale. Secondo il protocollo di testo, posizionare un cervello intero in una piastra Petri su ghiaccio sotto una lente di ingrandimento a bassa potenza.
Iniziare separando uno dei due bulbi olfattori posizionando le forbici appena dietro il bulbo. Utilizzando un movimento verso il basso, staccarlo dal cervello, quindi rimuovere il secondo bulbo in modo simile. Ora, mentre si tiene il cervello in posizione con le forbici, inserire delicatamente una seconda coppia di forbici tra i cortici sinistro e destro e spostarle in avanti per dissociare le due metà.
Ora continuando a tenere il cervello in posizione. Posizionare la seconda forbice a due millimetri dietro il corteccia e mantenere la pressione verso l'alto per sollevare la corteccia dall'ippocampo. Quindi staccare la prima parte della corteccia iniziando dall'ippocampo e spostandosi verso la parte anteriore del cervello.
Ripetere con la seconda metà. Quindi, posizionare le forbici attorno a uno degli ippocampi. Quindi chiudere delicatamente le forbici nella parte inferiore dell'organo e rimuoverlo delicatamente.
Ripetere con il secondo ippocampo. Posizionare le forbici dietro uno degli striati e separarlo delicatamente dal cervello. Utilizzare le forbici per rimuovere qualsiasi corteccia rimanente dallo striato prima di rimuovere il secondo satu per separare il cervelletto dal resto del cervello con le forbici, deprimere delicatamente il contorno del cervelletto.
Quindi posizionare le forbici dietro il cervelletto e spostare le forbici in avanti per rimuoverlo utilizzando la parte larga delle forbici sollevate come cefalo, che è composta da quattro strutture rotonde per vedere chiaramente dove si unisce il tronco cerebrale. Quindi fare un'incisione verticale alla giunzione prima di rimuovere il tronco cerebrale posizionando le forbici dietro il mesencefalo e in dimensione verticale per separarlo completamente dal resto del cervello. Per preparare l'omogeneizzato cerebrale, aggiungere un volume adeguato di tampone HS alle regioni cerebrali dissezionate per raggiungere una percentuale prevista di omogeneizzato come mostrato nella tabella sotto.
Utilizzando un tritacarne composto da un tubo di vetro borosilicato e i pestelli A e B, versare una regione cerebrale da schiacciare nel tubo. Quindi, con il pestello A, omogeneizzare il tessuto 10 volte per dissociarlo. Quindi passare al pestello B e omogeneizzare altre 20 volte.
Con una pipetta di trasferimento, trasferire l'omogeneizzato in un tubo da 1,5 millilitri, ripetendo l'omogeneizzazione con i campioni cerebrali rimanenti. Centrifugare i campioni a 1000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, quindi raccogliere lo snat e dividerli in 200 microlitri Ali Watts. Conservare a meno 80 gradi Celsius per successiva analisi Eliza per effettuare Eliza su omogeneizzato cerebrale.
Iniziare utilizzando 50 micromolar di tampone carbonato per diluire l'anticorpo di rivestimento anti alfa-sinucleina, conigli policlonale o monoclonale clone 42 a 0,01 nanogrammi per millilitro con 100 microlitri della soluzione di rivestimento dell'anticorpo rivestire i pozzetti di 96. Pozzi micropiastre e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte il giorno successivo. Aggiungere 300 microlitri di PBST nei pozzetti e utilizzare un lavapiatti per lavare le piastre cinque volte mentre si lavora a temperatura ambiente.
Andando avanti, aggiungere 200 microlitri di tampone di bloccaggio T 20 PBS a ciascun pozzetto e scuotere le piastre a 150 RPM per un'ora prima di utilizzare PBST per lavare le piastre cinque volte utilizzando PBST 1%BSA diluire l'omogeneizzato cerebrale secondo le linee guida elencate qui e aggiungere 100 microlitri a ciascuno. Pozzetto, quindi incubare a temperatura ambiente e 150 RPM per due ore prima di utilizzare PBST per lavare le piastre. Cinque volte dopo il lavaggio finale, aggiungere gli anticorpi di rilevamento dell'alfa-sinucleina necessari diluiti in PBS BST e 1%BSA come elencato nella tabella due del protocollo di testo. Incubare a temperatura ambiente e 150 RPM per un'ora prima di lavare le piastre cinque volte come prima.
Successivamente, aggiungere anticorpi IgG HRP coniugati anti topo o anti coniglio diluiti a uno su 8.000 in PBST 1%BSA e incubare a 150 RPM per un'ora prima di lavare le piastre cinque volte. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione TMB a ciascun pozzetto e incubare a 150 RPM per 15 minuti al buio. Fermare la reazione aggiungendo 100 microlitri di un acido cloridrico normale per pozzetto.
Quindi utilizzare un lettore di micropiastre per misurare l'assorbanza a 450 nanometri per l'analisi dei dati. Sottrarre il valore di densità ottica ottenuto nel pozzetto vuoto contenente solo tamponi e reagenti dalla densità ottica.
I valori determinati dai campioni cerebrali effettuano un'analisi statistica secondo il protocollo di testo in questo studio, l'Eliza eseguita ha identificato specificamente l'alfa-sinucleina associata alla malattia pser 1 29 in omogeneizzato cerebrale da vecchi topi malati M 83. I topi non presenti nei giovani topi M 83. Ulteriori anticorpi testati come LB 5 0 9 hanno mostrato forti segnali nei topi malati ma non in quelli sani.
La sensibilità analitica dell'ELIZA descritta in questo video è stata confrontata con
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo metodo quantitativo ELISA per la rilevazione della α-sinucleina associata alla malattia in un modello murino transgenico di sinucleinopatia. La tecnica consente il monitoraggio dell'accumulo di α-sinucleina in diverse regioni cerebrali in seguito alla progressione della malattia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Modelli transgenici
Sfondo
- La α-sinucleina è implicata nelle sinucleinopatie come il morbo di Parkinson.
- Metodi tradizionali come il western blotting e l'immunohistochemia presentano limitazioni nella quantificazione.
- L'ELISA offre un'alternativa rapida e affidabile per la quantificazione delle proteine.
- Il modello murino transgenico M83 viene utilizzato per lo studio dell'evoluzione della malattia.
Scopo dello studio
- Quantificare l'accumulo di α-sinucleina associata alla malattia in regioni cerebrali specifiche.
- Confrontare l'efficacia dell'ELISA con i metodi tradizionali.
- Migliorare la comprensione della distribuzione dell'α-sinucleina nelle sinucleinopatie.
Metodi Utilizzati
- I topi transgenici sono stati lasciati non inoculati oppure inoculati con estratti cerebrali.
- I topi sono stati lasciati invecchiare o sviluppare la malattia clinica prima dell'eutanasia.
- Le regioni cerebrali sono state dissezionate e omogeneizzate in tampone ad alto contenuto salino.
- È stato eseguito un saggio ELISA per quantificare i livelli di α-sinucleina nei campioni.
Risultati principali
- È stato osservato un accumulo significativo di α-sinucleina associata alla malattia nelle regioni caudali del cervello.
- Livelli elevati sono stati rilevati nel mesencefalo, nel tronco encefalico e nei midolli spinali.
- L'ELISA ha fornito una quantificazione rapida e affidabile rispetto ai metodi tradizionali.
- I risultati supportano l'utilizzo dell'ELISA per lo studio dell'α-sinucleina nelle sinucleinopatie.
Conclusioni
- Il nuovo metodo ELISA è efficace per quantificare l'α-sinucleina in modelli transgenici.
- Questo approccio può facilitare ulteriori ricerche sulle sinucleinopatie.
- Studi futuri potrebbero esplorare interventi terapeutici mirati all'accumulo di α-sinucleina.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Il rilevamento quantitativo della α-sinucleina associata alle malattie è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione del bersaglio nella scoperta di farmaci per le sinucleinopatie. Un approccio basato su ELISA consente una quantificazione rapida e affidabile attraverso diverse regioni cerebrali, supportando decisioni di avanzamento o interruzione nei programmi preclinici. Questo metodo aumenta la sicurezza predittiva fornendo letture scalabili e riproducibili per studi meccanicistici e per il monitoraggio degli interventi terapeutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della patologia dell'α-sinucleina come bersaglio terapeutico nei modelli di malattia di Parkinson.
- Valore operativo: Fornisce letture quantitative e specifiche per anticorpo per chiarire l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico correlando l'accumulo molecolare con la progressione fenotipica della malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una quantificazione standardizzata e compatibile con l'analisi ad alto rendimento dell'α-sinucleina associata alla malattia.
- Valore operativo: Richiede soltanto 10 μg di equivalente cerebrale per il rilevamento, migliorando l'efficienza del saggio rispetto al Western blot.
- Valore di riproducibilità: Mostra risultati costanti in diverse condizioni di inoculazione e invecchiamento, consentendo un monitoraggio longitudinale affidabile.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita il monitoraggio della propagazione di tipo prionico nel sistema nervoso centrale, fornendo informazioni per modelli meccanicistici della diffusione della malattia.
- Valore operativo: Rileva l'accumulo nelle regioni caudali del cervello e nel midollo spinale, in linea con la patologia clinica.
- Valore traslazionale: Sostiene gli sforzi di qualificazione dei biomarcatori fornendo letture proteiche quantificabili associate alla malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo ELISA si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio fino ai test di efficacia preclinica, consentendo una valutazione iterativa di composti che modulano l'α-sinucleina.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'aggregazione dell'α-sinucleina e sulla neurotossicità in modelli transgenici.
- Screening: Permette sistemi biologici pronti per saggi con output quantitativi per la valutazione di librerie di composti.
- Analisi: Fornisce letture basate sull'assorbanza a 450 nm, consentendo il confronto statistico degli effetti dei trattamenti tra diverse regioni cerebrali.
- Ricerca traslazionale: Collega il rilevamento molecolare agli esiti fenotipici, supportando decisioni di avanzamento con valutazione del rischio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata per la quantificazione dell'α-sinucleina applicabile a diversi modelli di malattia e modalità terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione del bersaglio mediante la rilevazione specifica e quantitativa dell'α-sinucleina associata alla malattia.
- Valore operativo: Fornisce risultati rapidi (entro poche ore) rispetto ai giorni necessari per il Western blot, accelerando i tempi del progetto.
- Valore strategico: Riduce il rischio di fallimento nelle fasi avanzate consentendo decisioni tempestive di prosecuzione o interruzione basate sui meccanismi d'azione.
- Impatto sul portafoglio: Migliora l'efficienza del capitale prioritizzando i composti che dimostrano un effettivo legame al bersaglio in vivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'ottimizzazione dell'ELISA, nella validazione degli anticorpi e nell'omogeneizzazione del tessuto cerebrale.
- Dipende dalla preparazione di tamponi ad alta forza ionica e dall'accesso a un lettore di micropiastre per la misurazione dell'assorbanza.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per garantire procedure di gestione dei campioni e protocolli di incubazione costanti.
- L'adattamento ad altri sistemi modello potrebbe richiedere la validazione della specificità dell'anticorpo e dell'accessibilità dell'epitopo.
- Limite pratico: il rilevamento del segnale dipende dall'accumulo sufficiente di α-sinucleina associata alla malattia, che può variare in base al modello e all'età.
