Name: Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Scopri la coltura scalabile di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un robot di liquid handling programmabile in piastre a 96 pozzetti. Questo metodo automatizzato mantiene la pluripotenzialità e consente la differenziazione in cardiomiociti per applicazioni terapeutiche rigenerative.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Gli autori ringraziano il team tecnico e OEM a Gilson, INC per il supporto tecnico esteso.

Gli autori MKC, MJG, EEB, NJD e RO sono o erano al tempo dei dipendenti per lo sviluppo di InvivoSciences, INC che ha concepito e sviluppato dei protocolli robotici qui descritti. TW è il CSO per InvivoSciences INC. SH è un dipendente di Gilson INC.

Nel presente studio abbiamo sviluppato un metodo di coltura per la produzione robotizzata IPSC che miniaturizza e automatizza l&#39;alimentazione e il passaggio in un formato a 96 pozzetti mentre anche consentendo efficiente scale-up. Un robot liquido gestione è stato utilizzato per alimentare regolarmente le colonie IPSC e li passo a intervalli regolari da dissociazione enzimatica. Il robot è stato anche programmato per produrre lastre rivestite gel matrice extracellulare ed eseguire un gradiente di densità di semina. Quando fibroblasti e adiposo derivato iPSCs sono stati coltivati ​​in questo sistema per più di 20 passaggi, circa 3 mesi, pluripotenza è stata mantenuta, così come lo erano cariotipo stabili. Entrambe le linee di cellule erano in grado di differenziazione in cardiomiociti. Insieme, la collezione di protocolli qui descritta consente agli utenti con poca esperienza sulle cellule staminali cultura o accesso limitato alle attrezzature cultura specialistica, alle cellule staminali di coltura e di raggiungere una produzione di cellule o la manipolazione con il lavoro minimo e il costo su più righe. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; I protocolli robotici qui descritti forniscono un metodo per scale-up economico di produzione e nel trattamento IPSC. Un vantaggio è la cultura di cellule staminali e scalabile in un formato basato su piastra stabilito dimostrato qui e in precedenza 44,47 - 49 per mantenere la pluripotenza. Mentre gli altri formati di cellule pluripotenti scalabile di cellule staminali cultura rendimento 20,23,29 metodo basato questo piatto richiede essenzialmente nessun cambiamento nella disposizione della cultura, come adattamento alla sospensione, l&#39;uso di sostanze chimiche o antischiuma uso prolungato di Rho-chinasi inibitori 20. Questo metodo della piastra base può quindi rapidamente, e prevedibilmente, accogliere nuove linee in quanto le condizioni di coltura sono simili. Come l&#39;uso di iPSCs per la modellazione della malattia aumenta 4,6,19,50, nuove linee IPSC sono continuamente generate. Le tecniche qui descritte sono più adatti alla cultura nuova linee in medio-alto volume e la velocità perché la barriera di transizione sul formato è low. Questo è vero per la manodopera e apparecchiature necessarie per mantenere le colonie anche. Infine, perché il formato e la manipolazione sono simili per l&#39;ambiente utilizzata per ricavare e validare linee IPSC, le prestazioni della cultura, come la differenziazione diretta, è probabile che sia più prevedibile. La figura 8 illustra una strategia per scale up della produzione di cellule staminali in piastre da 96 pozzetti. Una piastra (Ciclo 0) è utilizzata per seminare robot 12 nuovi piatti, un aumento di 12 volte (Ciclo 0 a 1). Dopo diversi giorni di alimentazione, uno dei dodici piastre è diversi passaggi per seminare un&#39;altra serie di dodici piastre (ciclo 1 al ciclo 2). I rimanenti piastre undici sono ora disponibili per altri usi e rappresentano la componente produzione del sistema. A questo ritmo, il passaggio di una piastra fornirà 11 piatti ogni ciclo, o ogni 3-4 giorni. Questa metodologia può essere scalata maggiore quando più piastre sono diversi passaggi, come illustrato nel passaggio dal Ciclo 2 Ciclo 3. In Ciclo 3, due piastre sonosempre utilizzato per mantenere la colonia e delle sementi 24 nuovi piatti. I restanti 22 piastre sono quindi disponibili per l&#39;uso dopo ogni ciclo di passaggio. In qualsiasi punto del ciclo di manutenzione l&#39;utente può seminare più piastre per aumentare la produzione. Un esempio potrebbe essere quello di passaggio ogni colonna per due cicli di crescita. Il primo passaggio converte una piastra in dodici piastre, e ciascuno dei dodici piastre viene utilizzata per seminare 144 piastre. In questo caso, un utente inizia con una piastra e dopo due passaggi, o circa 1,5-2 settimane di coltura, di 144 piastre. Ad esempio, i fibroblasti e adipose linee IPSC producono circa 25-75.000.000 cellule per piastra a 96 pozzetti quando si è pronti per il passaggio. 144 piastre potrebbero quindi rappresentare circa 4-7 x 10 9 cellule. Qual è il peso del lavoro per la realizzazione di 144 piastre da 96 pozzetti robot? Uno degli obiettivi di questo lavoro è stata la produzione scalabile di cellule staminali che ha ridotto il lavoro rispetto ai tradizionali (targa ad esempio, 6 pozzetti) staminali coltura cellulare. Il robot accomplishes questo per alleviare la necessità di gestire fisicamente ogni piatto durante l&#39;alimentazione e passaging. Mentre a 96 pozzetti scale di produzione piatto linearmente come sarebbe in 6 pozzetti tradizionali, il tempo di un tecnico passa a lavorare con i piatti è molto meno con la cultura robotica. L&#39;efficienza di produzione della cultura robotica deriva da questa differenza (Figura 9). E &#39;stato trovato i tecnici hanno potuto rimuovere un 6-pozzetti dal termostato, controllare sul microscopio, poi aspirare e alimentare il piatto in circa 3,5 minuti. In confronto, i tecnici spendono circa 30 sec rimuovendo una piastra a 96 pozzetti da incubatore e ispezionandolo sul microscopio per la densità e la contaminazione prima dell&#39;immissione sul robot. Con un protocollo alimentazione espanso simile a quella sopra descritta, sei piastre a 96 pozzetti possono essere caricati e alimentati, che dura circa 21 min, o 3,5 min per piastra. Il tempo trascorso totale per alimentare un piatto è comparabile tra robotè richiesto ic e metodi manuali, ma per alimentazione mano 6 piatti di un tecnico per tutti i 21 minuti, mentre il tecnico spende gestire i sei piatti per il robot (un controllo 30 sec per piastra) a soli 3 minuti. Come mostra la figura 9 mostra, il tempo trascorre un tecnico movimentazione 144 piastre utilizzando il robot è di circa 1,2 ore, rispetto all&#39;8 hr manualmente il robot farà mai gestire un errore piastre o il trasferimento di liquidi. Le 96 pozzetti IPSC metodi di coltura qui descritti forniscono una piattaforma per le attività di screening trattabili complesse. Poiché ogni bene è geneticamente identici e testa di serie alla stessa densità dallo stesso pool iniziale, le variabili possono essere distribuiti in tutta la piastra e mantenuti dal robot con serbatoi disponibili in commercio per separare condizioni. Questo sarebbe utile per esperimenti come la crescita delle cellule staminali dei media sviluppo 34,35,47, substrato o condizione cultura test e studi di tossicità che utilizzano cellule staminali51. Dal momento che ogni linea di cellule staminali è unica in termini di requisiti ottimali dimensioni delle colonie e di passaggio, si può usare questo sistema per modulare la densità di semina, la frequenza di alimentazione e la manipolazione passaggio manipolando le colonne raccolte, l&#39;agitazione meccanica durante il passaggio e la frequenza di alimentazione. Iterazione attraverso queste variabili permette all&#39;utente di trovare rapidamente una serie di condizioni idonee per la cultura di una nuova linea o sviluppare nuove tecniche di coltura. Il sistema robotico è anche in grado di mantenere 96 colonie di cellule staminali parallele ma indipendenti. Quando IPSC sono derivati ​​da cellule somatiche o clonato dopo la manipolazione genetica, molti cloni paralleli sono proiettati per produrre potenziali linee IPSC. Una volta che le singole cellule vengono seminate in piastre a 96 pozzetti, il sistema può alimentare e di passaggio le piastre a 96 pozzetti mantenendo ogni colonia segregata. Ciò consente molto elevato throughput quando si seleziona potenziali cloni ed elimina la difficoltà di coltura fisicamente 96 linee parallele. Questo metodo inoltrellows scalati produzione di ogni clone in modo che il materiale è facilmente disponibile per l&#39;analisi in parallelo. Infine, prevediamo integrando tali tecniche di coltura con un sistema di traffico piatto robotico che trasporta piastre da e per l&#39;incubatore abilitazione coltura completamente automatizzato. Ciò potrebbe essere realizzato con più robotica complessi che consentono una maggiore espansione poiché i protocolli di base qui descritte sono trasferibili ad altri sistemi basati piastra. I primi passi fondamentali per affrontare nei protocolli sono quelli che impediscono e controllano per la contaminazione, come passi 1.5 e 4.2. Contaminazione, come discusso in precedenza, può essere evitato con successo se buona tecnica sterile e il buon senso sono utilizzati. E &#39;indispensabile, indipendentemente dal formato coltura di cellule staminali, che il controllo dell&#39;operatore di contaminazione e di farlo in questo protocollo i passi indicati ridurrà notevolmente il rischio di contaminazione. La corretta applicazione del gel matrice extracellulare è un secondo esspasso ziale per il successo globale di questo protocollo. Senza rivestimento adeguatamente le piastre a 96 pozzetti, le cellule staminali non crescerà. Un problema comune è il rivestimento ben incompleta. L&#39;esperienza ha dimostrato che le bolle d&#39;aria, attrazione elettrostatica e capillarità ostacolano rivestimento ben completa. La fase di pre-bagnatura (1.6) è stato sviluppato per migliorare significativamente il rivestimento ben inferiore e non deve essere ignorato. Questa fase di pre-bagnatura sembra ridurre l&#39;apparente idrofobicità della piastra a 96 pozzetti di plastica in modo che quando il rivestimento in gel matrice extracellulare viene applicato è uniformemente distribuito attraverso il ben inferiore e lati. Si raccomanda inoltre di toccare delicatamente le piastre a 96 pozzetti contro una mano pulita una volta rivestito per assicurare una distribuzione soluzione di gel matrice extracellulare anche. I parametri di dissociazione sono importanti anche per ottimizzare. Incubazione estesa con l&#39;enzima o il reagente di dissociazione base EDTA si tradurrà in singole cellule che possono o non possono essere l&#39;obiettivo durante il passaggio. Pertanto, l&#39;operatoredovrebbe prestare particolare attenzione a come il tempo di dissociazione, forza triturazione, e le ripetizioni di lavaggio influenzano la morfologia delle colonie e la salute e regolare di conseguenza. Comprendere i limiti alle tecniche qui descritte sono di fondamentale importanza per il funzionamento di successo. Come in qualsiasi altra impostazione coltura cellulare, l&#39;utilizzo di piastre a 96 pozzetti presenta un rischio relativamente alto di contaminazione. Come sopra descritto, un tecnico è gestire ogni piastra durante l&#39;alimentazione e passaging; per esempio, quando si apre il coperchio, mettere la piastra sulla base del robot, e controllando la piastra sul microscopio. Quindi, come indicato dopo passo 1.5, è imperativo non toccare la parte interna del coperchio qualsiasi piatto o esporre questa parte a qualsiasi superficie potenzialmente contaminati, come i blocchi riscaldanti inclinate o perni verticali sul letto. Durante lo sviluppo del protocollo questa limitazione è stato scoperto e ha dato l&#39;impulso per sviluppare un rack per contenere coperchi piastra per mantenere la sterilità. Allo stesso modo, i serbatoi di valle, puntali e other forniture sul liquido letto manipolazione robot sono potenziali fonti di contaminazione, perché sono aperti per l&#39;ambiente e la manipolazione da parte del tecnico. Pertanto, buona tecnica sterile deve essere applicato come la riduzione dei movimenti rispetto ai materiali della cultura esposti o liquidi aperti. Un altro limite è che quando il protocollo è calcificato, controllando visivamente ogni ben di&gt; 100 piastre a 96 pozzetti è ingombrante. Questo può essere affrontato da ispezionare visivamente tutta la piastra per i segni di contaminazione, come i media torbido, per identificare i pozzi sospetti. Per future scala up, verrà incorporata uso di un microscopio automatico e indicatore della crescita cellulare e la potenziale contaminazione. In sintesi, l&#39;high-throughput da 96 pozzetti piattaforma basata descritto qui offre un metodo fedeltà riproducibili, alto per la cultura e la produzione di cellule staminali in un formato piatto. Questo metodo riduce l&#39;esperienza richiesta, delle attrezzature necessarie e di lavoro dedicata per arginare coltura cellulare mentremantenendo i vantaggi di cultura tradizionale aderente.

L&#39;uso di cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) è aumentato in modo significativo dal loro derivazione nel 2007 1 per il test composto, medicina rigenerativa e modellazione malattia 2-6. Questa richiesta viene dalla capacità di IPSC per produrre un gran numero di cellule pluripotenti che possono essere differenziate in cellule somatiche in una quantità senza precedenti. Poiché le tecniche di differenziazione dirette migliorano 7-10 e lo sviluppo di cellule umane o di modellazione dei tessuti e terapia cellulare aumenta 11-14, così fa la richiesta di produzione di massa di iPSCs di alta qualità. E &#39;ampiamente citato che tra le altre malattie, l&#39;infarto miocardico o la sostituzione funzionale b-cellule richiederanno centinaia di milioni di miliardi di IPSC derivate cellule somatiche 15 - 18. Modellazione 3D dei tessuti, inoltre, sempre più complesso per la scoperta di farmaci e therapy chiederemo gran numero di cellule 9,13,19. In tutti questi esempi, definiti, uniforme e iPSCs riproducibili devono essere disponibili e semplice da produrre. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l&#39;ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. La produzione in scala di iPSCs si è concentrata sulla coltura in sospensione 20 - 25 o sospensione con l&#39;utilizzo di substrati microcarrier 26-28 anche perché queste tecniche vengono distribuiti con successo su larga scala, non IPSC, produzione con sede eucarioti. Diversi gruppi hanno dimostrato sistemi di coltura sospensione che producono cellule staminali pluripotenti 20,21,23,24,29. Tuttavia, questi approcci utilizzano sistemi costosi e complessi non immediatamente disponibili ai ricercatori in via di sviluppo programmi di differenziazione romanzo, guidando l&#39;ingegneria dei tessuti e facendo laboratricerca ory scala. Inoltre, sospensione e microcarrier IPSC culture richiedono un adeguamento e di tecniche o prodotti chimici che non si trovano in cultura tradizionale aderente iPSC come l&#39;uso continuo di inibitore di Rho-chinasi, agenti antischiuma e filtrazione per regolare aggregazione. Lo stress fisico alle cellule è più prevalente in coltura in sospensione, introdotto mediante agitazione meccanica e durante microcarrier collisione. Questi problemi limitano la prevedibilità e la velocità con cui appena generato linee di cellule staminali possono essere coltivate in sospensione. Altri hanno sviluppato sistemi di movimentazione piastra robotici che imitano piastra tecniche di coltura 30,31 ma queste piattaforme richiedono significativi investimenti per attrezzature e competenze per operare in aggiunta alle sfide fondamentali associati alla cultura di cellule staminali. Il seguente lavoro descrive lo sviluppo e la pratica di una soluzione scalabile sistema di coltura IPSC che utilizza un liquido robotica 8 canali standard di self-containedpiastre gestore e 96 pozzetti. Questo metodo è stato progettato per colmare scala di laboratorio cultura IPSC e ad alto volume di produzione IPSC (ad esempio, 10 7-1,5 x 10 9 cellule per settimana a tecnico) che permettono quelle sviluppo di nuove tecnologie IPSC di scalare facilmente la produzione senza grandi investimenti hardware o di lavoro. Questo metodo è relativamente poco costoso da installare, richiede poco o nessun coltura di cellule staminali, programmazione o ingegneria esperienza, ha un ingombro apparecchiatura senza la necessità di una cappa di coltura cellulare dedicato, e utilizza attrezzature di coltura cellulare standard per consentire medio ad alto rendimento automatizzato la produzione di cellule. L&#39;obiettivo era quello di sviluppare un sistema in grado di coltura di cellule staminali scalabile che può essere utilizzato da laboratori nuovi per arginare coltura cellulare, coloro che trovano la coltivazione manuale una barriera per sviluppare le proprie idee o coloro che desiderano un mezzo economico per la produzione di un gran numero di cellule staminali. La piattaforma presentata qui rimuove influenza tecnico sustaminali coltura cellulare e normalizza le modalità di alimentazione e di passaggio per consentire la produzione di cellule staminali coerente.

<table><tbody><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>a 96 pozzetti; Volume del pozzo: 360&nbsp; &#956; l; Area di crescita cellulare: 0,32&nbsp; cm2; Vasca</td></tr><tr><td>per cavalluccio marino</td> confezionata singolarmente <td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Serbatoio 4 parti trasparenti Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Punte Gilson</td><td>F167023</td><td></td><td>10 rack Gilson 96 punte D200 punte</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>polvere DMEM/F12.&nbsp; Risospendere in 1 L di acqua purificata per colture cellulari e filtro sterile.</td></tr><tr><td>Fattore di crescita ridotto Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Indicato come "gel della matrice extracellulare" nel testo. Matrigel GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 Kit completo per il mantenimento dell'hES.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>Kit TeSR-E8 per il mantenimento hESC/hiPSC</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Iniettore di roccia Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologie cellulari innovative</td><td>ACCUTASE</td><td>Indicato come "reagente di dissociazione proteolitico e collagenolitico" nel testo. Accutase 500&nbsp; ml di soluzione cellulare sterile</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS senza Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/confezione</td></tr><tr><td>Gilson PIPETMAX</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

scalabile piastra a 96 pozzetti based ipsc cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico liquid handling

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

Avanzamento continua in coltura di cellule staminali pluripotenti sta chiudendo il gap tra panchina e comodino per l&#39;utilizzo di queste cellule nella medicina rigenerativa, scoperta di nuovi farmaci e test di sicurezza. Per produrre staminali cellule derivate biofarmaceutica e cellule per l&#39;ingegneria dei tessuti e trapianti, una tecnologia delle celle di produzione-costo-efficacia è essenziale. Manutenzione di pluripotenza e prestazioni stabili delle cellule in applicazioni a valle (ad esempio, la differenziazione cellulare) nel tempo è fondamentale per la produzione di cellule su larga scala. Tuttavia che può essere difficile da raggiungere, soprattutto se le cellule sono coltivate manualmente quando l&#39;operatore può introdurre una significativa variabilità così come essere proibitivo in scala-up. Per abilitare high-throughput, su larga scala la produzione di cellule staminali e rimuovere l&#39;influenza dell&#39;operatore protocolli di coltura cellulare romanzo staminali utilizzando un banco multicanale movimentazione robot liquido sono stati sviluppati che richiedono il coinvolgimento tecnico minima o esperienza. Conqueste cellule staminali pluripotenti indotte umane protocolli (iPSCs) sono state coltivate in condizioni di assenza di alimentazione direttamente da un magazzino congelati e conservati in piastre da 96 pozzetti. A seconda linea cellulare e tasso scale-up desiderato, l&#39;operatore può facilmente determinare quando il passaggio sulla base di una serie di immagini che mostrano le densità colonia ottimali per spaccare. Poi i reagenti necessari sono pronti per eseguire una colonia divisione di nuove piastre senza una fase di centrifugazione. Dopo 20 passaggi (~ 3 mesi), due linee IPSC mantenuto cariotipi stabili, hanno espresso marcatori di cellule staminali, e differenziate in cardiomiociti ad alta efficienza. Il sistema può effettuare la successiva high-throughput screening di nuovi protocolli di differenziazione o la manipolazione genetica progettati per piastre a 96 pozzetti. Questa tecnologia consentirà di ridurre il carico di lavoro e tecniche per la produzione di un gran numero di cellule staminali identiche per una miriade di applicazioni.

I protocolli descritti consentono ai laboratori di eseguire colture di cellule staminali scalabili e aderenti ad alta produttività con un costo minimo di manodopera, esperienza e investimento in attrezzature utilizzando un robot programmabile per la manipolazione dei liquidi e piastre da 96 pozzetti. Le iPSC sono passate più di 20 volte su questo sistema, hanno mantenuto la pluripotenza, cariotipi normali e si sono differenziate in cardiomiociti.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stabilire in modo riproducibile una coltura cellulare pluripotente scalabile. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando un robot pre-programmato per la manipolazione di liquidi, che semina cellule staminali pluripotenti umane a diverse densità. In un secondo passaggio, su una piastra a 96 pozzetti, i pozzetti con densità ottimali di colonie vengono identificati visivamente per il confezionamento.Le cellule staminali pluripotenti indotte vengono quindi seminate su nuove piastre per l'alimentazione automatica e ulteriori operazioni di confezionamento. In definitiva, questa procedura consente la selezione delle migliori densità di semina per la moltiplicazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane, al fine della loro successiva differenziazione in cardiomiociti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di terapie personalizzate e rigenerative su scala intermedia.Il robot per colture potenti URI è adatto alla produzione di alcune centinaia di milioni di cellule staminali potenti URI in pochi giorni, che possono quindi essere differenziate in vari tipi cellulari per test farmacologici personalizzati o per terapie con impianto di cellule e tessuti. Sebbene questo metodo sia stato applicato alla selezione di densità di semina per l'espansione ottimale delle colture cellulari pluripotenti, può essere utilizzato anche per ottimizzare e identificare nuovi protocolli di differenziazione per diversi altri tipi cellulari. A dimostrare la procedura saranno gli scienziati farmaceutici, Neil Daily del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura di alimentazione, verificare la piastra da 96 pozzetti con colonie di cellule staminali per eventuali contaminazioni e confermare che la colonia cellulare sia al di sotto della densità ideale per il passaggio.Se le cellule sono in buone condizioni, posizionare la piastra nel letto. Posizionarne tre sul piano inclinato del robot per la movimentazione dei liquidi a 37 gradi Celsius e caricare il rack dei puntali nel letto. Posizionarne uno con puntali per pipetta a temperatura ambiente da 200 microlitri.Posizionare un serbatoio a quattro pozzetti nella posizione del letto due e riempire il pozzetto tre del serbatoio con otto millilitri di mezzo di crescita per cellule staminali fresco a temperatura ambiente, senza inibitore della chinasi RO. Trasferire quindi la piastra di piastrine nel supporto per piastre e, utilizzando il touch screen di controllo del robot, selezionare in sequenza Esegui il protocollo colony feed one plate e successivamente premere esecuzione prova per utilizzare la procedura guidata passo dopo passo per pretestare il programma selezionato. Una volta approvato il protocollo, selezionare esegui protocollo. Dopo il trattamento, recuperare la piastra a 96 pozzetti con le colonie di cellule staminali.Quindi registrare i dettagli dell'evento alimentare sul coperchio della piastra e riposizionarla nell'incubatrice per colture cellulari per 24 ore, fino al successivo alimentamento o passaggio. La scelta della pozzetta da suddividere dipende dalla densità delle colonie. Diversi giorni dopo aver impostato un gradiente di densità di semina su questa piastra, si osserva una pozzetta troppo densa per essere suddivisa, una densità ideale per il passaggio e una pozzetta troppo scarsa per essere passata dopo diversi cicli di alimentamento.Verificare che lo spazio tra la maggior parte delle colonie nella piastra a 96 pozzetti sia pari al 25% del diametro della colonia adiacente, altrimenti un successivo passaggio di alimentazione porterebbe le colonie a crescere unendosi tra loro. Successivamente, se la colonia non è contaminata, posizionare la piastra nel letto. Posizione tre sulla rampa a 37 gradi e inserire il portapunte nel letto.Posizionare un set di punte per pipetta da 200 microlitri a temperatura ambiente. Posizionare un pozzetto da quattro alloggiamenti nella posizione due del supporto, quindi, lasciando il pozzetto quattro vuoto, distribuire 8,5 millilitri di terreno di crescita per cellule staminali, integrato con l'inibitore della chinasi della catena leggera della miosina Y 27632, nel pozzetto tre; 3,5 millilitri di reagente dissociativo proteolitico e collagene-litico al 30% nel pozzetto due; e 4,5 millilitri di PBS nel pozzetto uno.Posizionare successivamente un nuovo pozzetto preriscaldato, rivestito con gel di matrice extracellulare a 37 gradi Celsius, in posizione cinque sul lettino; trasferire quindi i coperchi della piastra vecchia e di quella nuova sul supporto portacoperchi. Utilizzare ora il touch screen di controllo del robot per selezionare in sequenza l'esecuzione del protocollo "colony split one to 12 column one", seguito da "next". Quindi selezionare "test run" per utilizzare la procedura guidata passo-passo per pretestare il programma selezionato, seguita dall'esecuzione del protocollo.Al termine del protocollo di passaggio, recuperare entrambe le piastre. Etichettare la nuova piastra con le informazioni pertinenti e reinserire le piastre nell'incubatore. Per 24 ore, le cellule e le colonie dovrebbero aderire alla piastra entro due o tre ore dal passaggio, presentandosi molto distese a causa della presenza dell'inibitore della chinasi RO.Dopo il primo pasto senza inibitore della chinasi RO, le cellule si condenseranno e mostreranno la tipica morfologia a selciato delle cellule staminali. Le anomalie cromosomiche sono comunemente osservate durante la coltura di cellule staminali, ma potrebbero non influenzare la distribuzione dei marcatori di pluripotenza come quelli mostrati in queste immagini; in effetti, l'analisi del cariotipo di cellule coltivate mediante il protocollo appena dimostrato ha rivelato che entrambe le linee di cellule staminali pluripotenti indotte passaggiate roboticamente presentavano 46 cromosomi normali, suggerendo che il metodo di coltura robotico non ha introdotto instabilità cromosomica oltre quella che potrebbe verificarsi normalmente. Per analizzare i marcatori di espressione genica delle cellule staminali stabilite nelle linee di cellule staminali pluripotenti indotte coltivate roboticamente, è stato inoltre raccolto l'RNA totale.Entrambe le linee di cellule staminali pluripotenti indotte in questo esperimento hanno mostrato un'espressione simile dei marcatori di pluripotenza, mentre i cardiomiociti differenziati da ciascuna linea non l'hanno mostrata, così come non l'ha mostrata una linea separata di fibroblasti dermici umani. Inoltre, quando entrambe le linee di cellule staminali pluripotenti indotte sono state differenziate in cardiomiociti, hanno evidenziato una chiara formazione dei sarcomeri. Nel complesso, questi dati suggeriscono che tre mesi e oltre 20 passaggi di coltura robotica hanno prodotto cellule cromosomicamente normali che esprimono un programma trascrizionale coerente con la pluripotenza e che erano altresì in grado di differenziarsi in cardiomiociti.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare questo o un robot simile per il trattamento di liquidi per coltivare cellule pluripotenti in modo scalabile.

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Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.

Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Questo protocollo documenta la fabbricazione e l'assemblaggio di SPOT, una piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività, nei formati da 96 e 384 pozzetti. Descrive inoltre in dettaglio il processo di semina per SPOT, sia manuale che utilizzando un gestore di liquidi disponibile in commercio.

Produzione riproducibile di SPOT come piattaforma di coltura basata su scaffold ad alta produttività

Scopri la coltura scalabile di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un robot di liquid handling programmabile in piastre a 96 pozzetti. Questo metodo automatizzato mantiene la pluripotenzialità e consente la differenziazione in cardiomiociti per applicazioni terapeutiche rigenerative.

Scalabile piastra a 96 pozzetti Based iPSC cultura e di produzione utilizzando un sistema robotico Liquid Handling

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