Name: Lutilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri come utilizzare il sistema TetON per l'espressione genica condizionale e tessuto-specifica nella pinna caudale rigenerante di Danio rerio. Questo metodo permette di studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte per l&#39;assistenza tecnica. Il lavoro in laboratorio Weidinger è sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e dalla Deutsche Gesellschaft für Kardiologie tramite un Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare con successo molti organi interni e appendici. Una conoscenza approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede un&#39;analisi tessuto-specifica delle funzioni dei geni e vie di segnalazione. Verso questo, il sistema di Teton fornisce un efficace strumento per l&#39;espressione genica controllata spatiotemporally in zebrafish embrionali e adulte. I costrutti sistema Teton e metodologie descritte in questo manoscritto sono stati utilizzat...

Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell&#39;espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi. Attualmente, tre diversi sistemi sono stati utilizzati per realizzare condizionale, espressione tessuto-specifica del gene in rigenerazione organi di zebrafish adulto: il sistema Cre-lox, espressione mosaico di heat-shock transgeni inducibile mediante trasposoni mediata transgenesi somatica, e il sistema di Teton 1 -3. TETON riferisce ad una variante di un tetraciclina-CONTlaminati sistema di attivazione trascrizionale, dove l&#39;espressione viene attivato in presenza di tetraciclina o un suo derivato, ad esempio doxiciclina. Il sistema Cre-lox, come è finora stato utilizzato in pesci adulti, si basa su un ricombinasi Tamoxifen controllato Cre (CreERT2), la cui espressione è spazialmente limitata da elementi regolatori tessuto-specifici. Rimozione Cre-driven di una cassetta di STOP facilita l&#39;espressione del gene di interesse guidata da un promotore che deve essere attiva in tutti i tipi cellulari 1. Creazione Transposon mediata di transgeni somatiche mosaically espresse offre un sistema di espressione del transgene inducibile in linee cellulari individuali. Iniezione di embrioni di zebrafish con trasposone Tol2 che porta un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale di un shock termico risultati promotore in individui chimerici tipicamente portano il transgene solo in linee cellulari discreti di un organo rigenerante 2. Mentre entrambi i sistemi permettono condizionale tessuti speespressione genica fica, il sistema Cre-lox non è reversibile, e la strategia di utilizzo di etichettatura clonale basato trasposoni-risente della sua natura stocastica. Così, noi ed altri hanno recentemente adattato sistemi Teton transgenici per l&#39;utilizzo in zebrafish, che facilitano temporalmente e l&#39;espressione genica spazialmente controllata che si aggiunge sintonizzabile e reversibile 3-5. Il sistema di Teton qui utilizzato comprende una linea pilota transgenica (TetActivator), in cui un Doxiciclina (DOX) -inducible attivatore trascrizionale (migliorato transattivatore tetraciclina inverso, irtTA, breve Teta) è sotto il controllo di sequenze regolatorie genomiche tessuto-specifici. In secondo luogo, esso richiede una linea transgenica responder (TetResponder) che ospita un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale del gestore tetraciclina (Tet elemento di risposta; tetre) (Figura 1A). Pertanto, l&#39;uso di combinazioni specifiche di linee TetActivator e TetResponder consente condizionale tessuto-specificomanipolazione fic dell&#39;espressione genica. Abbiamo recentemente utilizzato il sistema di Teton a sondare per le funzioni di tessuto-specifici di Wnt segnalazione / beta-catenina nell&#39;adulto rigeneranti coda zebrafish fin 3. Nel protocollo descritto qui si descrive un flusso di lavoro per la messa a punto e l&#39;uso del sistema di Teton in zebrafish, in particolare per gli studi di rigenerazione fin. Questo include le istruzioni dettagliate su come generare linee TetActivator e TetResponder transgeniche stabili e di un protocollo per l&#39;induzione transgene in embrioni e zebrafish adulto. Inoltre, si descrivono tecniche per la verifica dell&#39;espressione genica tessuto-specifica nel rigenerato aletta, compreso un protocollo per la preparazione di criosezioni di pinne zebrafish adulti. Inoltre, si discute considerazioni per la progettazione del transgene TetActivator, la scelta di un metodo di transgenesi e rilevamento di espressione TetResponder. Quindi, l&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di servire da modelloprevista per il montaggio di un sistema téton funzionale zebrafish per ottenere l&#39;espressione genica condizionale tessuto-specifico, che può essere applicato a qualsiasi tessuto di interesse. Abbiamo creato un vettore TetActivator consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetActivator stabili utilizzando sequenze di regolazione genomica brevi (frammenti enhancer; Weidinger laboratorio banca dati plasmide no 1247;. Figura 1B). Questo costrutto contiene una cassetta TetActivator consistente della variante mutante M2 del dominio repressore Tet inverso fuso con il virus Herpes simplex VP16 transattivazione dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F)]. Espressione dei TetActivator (TETA) può essere facilmente monitorato dal momento che è co-espressa con il fluoroforo AmCyan dalla stessa griglia di lettura aperta; un peptide P2A media ribosomiale per saltare, che dovrebbe portare la produzione di Teta e AmCyan proteine ​​separate a un rapporto 1: 1 5,6. Il costrutto contiene anche un poylinker 5 &#39;del Tcassette etActivator per facilitare l&#39;inserimento di genomica sequenze regolatrici di interesse utilizzando metodi di clonazione convenzionali. Inoltre, abbiamo creato un costrutto costituito dal cassetto sopra descritto TetActivator più una cassetta di selezione kanamicina (Weidinger database di plasmide laboratorio no 1180;. Figura 1C), che possono essere ricombinati in un cromosoma artificiale batterico (BAC) contenente una grande regione genomica ( di solito nel codone di inizio di un gene la cui espressione modello deve essere imitata dal transgene). Entrambi i costrutti sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.

<table><tbody><tr><td>Scatole di allevamento</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza composta</td><td>, ad es. Leica, Zeiss</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per l'imaging di sezioni di tessuto fluorescenti</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>, ad es. Leica, Zeiss</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per l'imaging di sezioni di tessuto fluorescenti</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>, ad es. Leica, Thermo-Scientific</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per criosezione</td></tr><tr><td>4', 6- diamidino-2-fenilinodele (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>utilizzare 1/5.000 in PBS per la visualizzazione dei nuclei</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>preparare scorte in 50% EtOH a 50 mg/ml (97 mM) per TetResponder</td></tr><tr><td>induzione Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (p/v) di paraformaldeide in PBS, pH 7,5 per la fissazione</td></tr><tr><td>1x soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x Soluzione salina tampone fosfato + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS con 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus vetrini per microscopio ad adesione</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>per la raccolta di sezioni di tessuto</td></tr><tr><td>Microscopio a stereofluorescenza</td><td>, ad esempio Leica, Zeiss,</td><td>varia a seconda del produttore per la</td><td>genotipizzazione basata sulla fluorescenza</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>, ad esempio Biorad, Applied Biosystems</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per la genotipizzazione basata su PCR</td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento dei tessuti (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>per l'inclusione di tessuti campioni</td></tr><tr><td>Tricaina (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>per anestesia utilizzare a 1 mg/ml in terreno embrionale E3</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilizzo del sistema di teton per studiare meccanismi molecolari della rigenerazione zebrafish

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Il pesce zebra è diventato un organismo modello molto importante per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, della fisiologia, delle malattie e della rigenerazione dei tessuti. Una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede strumenti sperimentali che consentano la manipolazione inducibile e tessuto-specifica dell'espressione genica o delle vie di segnalazione. Pertanto, noi e altri abbiamo recentemente adattato il sistema TetON per l'uso nel pesce zebra. Il sistema TetON facilita l'espressione genica controllata temporalmente e spazialmente e abbiamo recentemente utilizzato questo strumento per sondare le funzioni tessuto-specifiche della segnalazione Wnt/beta-catenina durante la rigenerazione della pinna caudale del pesce zebra. Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere un'espressione genica inducibile e tessuto-specifica nella pinna caudale adulta che si rigenera di pesce zebra. Ciò include la generazione di linee transgeniche stabili TetActivator e TetResponder, l'induzione transgenica e le tecniche per la verifica dell'espressione genica tessuto-specifica nella pinna rigenerata. Pertanto, questo protocollo funge da modello per la creazione di un sistema TetON funzionale nel pesce zebra e il suo successivo utilizzo, in particolare per lo studio della rigenerazione delle pinne.

Per stabilire un sistema di Teton funzionale per l&#39;espressione del gene inducibile tessuto-specifica, TetActivator transgenici e linee TetResponder bisogno di essere generato (Figura 1A). Questo si ottiene microinjecting TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) costruisce in embrioni di zebrafish e la successiva integrazione della linea germinale. Costrutti TetActivator funzionali possono essere generati sia per clonazione di brevi se...

Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto che si rigenera.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di impostare un sistema TED funzionale nel pesce zebra per ottenere un'espressione genica condizionale e specifica per tessuto, come dimostrato nel video nella pinna caudale in rigenerazione. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando linee transgeniche di attivatore Tet che esprimono un attivatore trascrizionale inducibile alla tetraciclina marcato con am cyan nel tessuto di interesse e linee risponditrici Tet che contengono un gene di interesse con un marcatore YPE sotto il controllo di elementi responsivi al Tet. Successivamente vengono stabilite combinazioni specifiche di pesci doppio transgenici attivatore Tet e risponditore Tet.Successivamente, l'espressione del transgene rispondente al sistema Tet specifico per il tessuto viene indotta mediante somministrazione di doxiciclina. Infine, l'espressione del transgene rispondente al sistema Tet viene verificata preparando sezioni di tessuto di rigenerati della pinna. In ultima analisi, l'immunofluorescenza viene utilizzata per visualizzare l'espressione tissutale specifica del transgene rispondente al sistema Tet.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come l'espressione genica indotta da shock termico, è che il sistema DEED consente un'espressione genica inducibile e reversibile in maniera specifica per tessuto. Questo metodo può contribuire a ottenere una comprensione più approfondita delle reti di segnalazione molecolare che guidano la rigenerazione della pinna nei pesci S, poiché permette l'analisi del percorso di segnalazione e della funzione genica in tessuti singoli. Sebbene utilizziamo questa tecnologia per studiare la rigenerazione della pinna nel pesce zebra, essa può rivelarsi utile anche in molti altri contesti che richiedono la manipolazione specifica per tessuto della funzione genica.Dopo aver generato linee di pesci risponditori Tet seguendo il protocollo descritto nel testo, valutare l'integrazione nella linea germinale e l'inducibilità del transgene incrociando singoli pesci G zero con una linea precedentemente stabilita di attivatore Tet. Successivamente raccogliere gli embrioni e allevare fino a uno stadio in cui sia possibile valutare l'induzione del risponditore Tet. Preparare una soluzione madre di doxiciclina 2000 x utilizzando etanolo al 50% per sciogliere il dox fino a raggiungere una concentrazione di 50 milligrammi per millilitro.Conservare aliquote di docks al riparo dalla luce a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare il mezzo per embrioni E tre contenente docks a una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro. Poi, decantare la maggior parte del mezzo E tre dagli embrioni.Sostituirlo con dos contenenti E tre medium e riportare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per un minimo di sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per analizzare gli embrioni alla ricerca di fluorescenza Y pet. Stabilire diverse linee transgeniche stabili Tet responder da fondatori appena identificati.Scegliere linee che inducano in modo forte e mostrino una bassa mosaicizzazione all'interno del dominio di espressione previsto, nonché una ridotta variabilità tra singoli embrioni. Una volta stabilite le linee di pesci con attivatore Tet e risponditore Tet, incrociare i portatori dell'attivatore Tet con i portatori del risponditore Tet per generare organismi doppio transgenici. Selezionare gli embrioni portatori del transgene attivatore Tet analizzando la fluorescenza ciano-am in un microscopio stereoscopico e allevare gli embrioni positivi per la ciano-am fino all'età adulta.Identificare pesci adulti doppio transgenici che portano il risponditore Tet oltre all'attivatore Tet mediante genotipizzazione basata sulla PCR o in base alla loro capacità di indurre l'espressione del risponditore Tet nel tessuto di interesse per eseguire la rimozione della pinna caudale. Anestetizzare i pesci zebra adulti in un becher riempito con acqua per pesci contenente 160 microgrammi per millilitro di trica. Quando il pesce smette di muoversi, utilizzare pinzette per trasferirlo con attenzione su una piastra di Petri capovolta e usare un bisturi per eseguire un'amputazione parziale della pinna caudale da trattare con docs. Preparare scatole di riproduzione con un litro di acqua del sistema per pesci contenente 25 microgrammi per millilitro di doxiciclina.Come controllo negativo, aggiungere 250 microlitri di etanolo invece di doxiciclina in scatole di riproduzione contenenti un litro di acqua del sistema per pesci; trasferire fino a 10 pesci doppiamente transgenici in ciascuna scatola di riproduzione e collocare le scatole al buio per ridurre lo stress. Dopo un minimo di sei ore, anestetizzare e trasferire i pesci trattati in una capsula Petri rivestita con agar umido e utilizzare pinzette per distendere la pinna caudale. Successivamente, osservare i pesci al microscopio a fluorescenza per verificare la comparsa di Y PET nel tessuto in rigenerazione.Successivamente, i pesci possono essere utilizzati per ulteriori trattamenti o restituiti al sistema di allevamento per interrompere l'induzione del transgene risponditore dopo l'amputazione parziale della pinna e il trattamento con docs. Amputare nuovamente i rigenerati della pinna a circa quattro-cinque segmenti ossei prossimali rispetto al piano di amputazione iniziale e in un punto temporale che dipende dal vostro setup sperimentale, come descritto in precedenza in questo video. Con pinzette, maneggiando esclusivamente la parte del moncone del tessuto, posizionare con attenzione i rigenerati del tessuto in modo piatto in una piccola capsula di Petri contenente il 4% peso/volume di PFA in PBS e fissare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, utilizzare PBS per lavare i rigenerati due volte prima di trasferirli in E-D-T-A-P-B-S 0,5 M per decalcificare la matrice ossea a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Successivamente, incubare i rigenerati in una serie di soluzioni di saccarosio in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuna e infine in parti uguali di saccarosio al 30% in PBS e mezzo di congelamento per tessuti per ulteriori 30 minuti.Trasferire le pinne nel mezzo di congelamento per tessuti e incubare a quattro gradi Celsius per almeno due ore. Successivamente, posizionare gli stampi criogenici su un vetrino e riempirli con il mezzo di congelamento per tessuti. Trasferire i rigenerati negli stampi criogenici e orientare il tessuto per ottenere sezioni longitudinali o trasversali.Assicurarsi che il rigenerato sia dritto per facilitare il sezionamento. Insieme al vetrino, trasferire gli stampi criogenici su un supporto metallico posizionato su un letto di ghiaccio secco per avviare il processo di congelamento. Quando il mezzo è solidificato, riportare gli stampi criogenici a temperatura ambiente per consentire al mezzo di scongelarsi all'interfaccia tra plastica e mezzo.Quindi, utilizzando uno strumento come una penna, spingere il blocco congelato fuori dallo stampo criogenico e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al taglio con un microtomo criogeno. Raccogliere sezioni di 10-14 micrometri su vetrini adesivi per microscopio e conservare i vetrini a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per caratterizzare l'espressione del risponditore Tet su sezioni di pinna, trattare le sezioni con metanolo al 100% raffreddato a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti.Rimuovere con attenzione il liquido utilizzando un tovagliolo di carta. Quindi lavare le sezioni due volte con PBT e una volta con PBS per cinque minuti ciascuno. Incubare le sezioni per 10 minuti in dappy prima di lavarle due volte con PBS per 10 minuti ciascuno.Quindi utilizzare un mezzo di montaggio Antifa e un coprivetrino per montare i campioni prima di eseguire la microscopia a fluorescenza confocale o a campo ampio per acquisire le immagini dei campioni, dopo aver stabilito un sistema TET funzionale nei pesci zebra. Questo sistema può essere impiegato per verificare la funzione di geni o di vie di segnalazione in tessuti specifici. Come mostrato qui, l'attivatore tet sotto il controllo del promotore HER 4.3 induce l'espressione del risponditore TED solo in un sottoinsieme di tessuti: la fluorescenza di YFP viene rilevata nella blastema prossimale proliferativa, mentre la blastema distale e l'epidermide sono prive di espressione.L'espressione dell'antagonista WINT della beta-catenina agisce in uno dei domini HER 4.3 contenente le cellule proliferative della blasta, ma sorprendentemente non ha alcun effetto sulla proliferazione cellulare rigenerativa. Questo suggerisce che la segnalazione della wind betaina e delle cellule proliferative nella blastema prossimale non ha un ruolo essenziale nella regolazione della proliferazione delle cellule ML della blastema. Al contrario, l'uso della linea attivatrice Tet sotto il controllo del promotore dell'ubiquitina per indurre l'espressione di axin uno in tutti i tessuti della rigenerazione della pinna interferisce fortemente con la proliferazione cellulare rigenerativa.Inoltre, l'espressione di axon uno nel dominio HER 4.3, che non include gli osteoblasti, interferisce fortemente con la formazione ossea nel tessuto rigenerato. Pertanto, l'interferenza specifica per tessuto con la segnalazione di wind mediante il sistema TE on rivela funzioni indirette inattese della segnalazione di wind nella regolazione della proliferazione cellulare e nella rigenerazione ossea. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per ottenere un'espressione genica indotta e mirata in qualsiasi tessuto di interesse.Abbiamo applicato con successo questo metodo per indagare le funzioni specifiche dei tessuti nella segnalazione della nicotina nel letto del vento nella rigenerazione della pinna caudale del pesce S. L'utilizzo di questo metodo contribuirà a ottenere una comprensione più completa dei determinanti molecolari che regolano la rigenerazione dei tessuti.

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Noi descriviamo un metodo per abbattere condizionale l'espressione di una proteina bersaglio durante la rigenerazione adulto pinna zebrafish. Questa tecnica comporta micro-iniezione e electroporating Morpholinos oligonucleotide antisenso nel tessuto pinna, che consente di testare il ruolo della proteina in varie fasi di rigenerazione pinna, tra la guarigione della ferita, la formazione blastema, e escrescenza rigenerativa.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Il metodo qui presentato comprende il pregiudizio preciso di embrioni di zebrafish in diretta con alta energia impulsi laser e la successiva analisi di tali lesioni e il loro recupero con il tempo. Mostriamo anche come geneticamente etichettati singoli o gruppi di cellule muscolari scheletriche possono essere monitorati durante e dopo un danno luce laser indotto.

Laser-lesioni del muscolo scheletrico embrionale Zebrafish

Dopo la sezione spinale, zebrafish adulto ha recupero funzionale da sei settimane post-infortunio. Per usufruire di trasparenza larvale e recupero più veloce, vi presentiamo un metodo per sezionare il midollo spinale larvale. Dopo la resezione, osserviamo il recupero sensoriale che inizia a 2 giorni dopo l'infortunio, e il movimento C-bend per tre giorni post-infortunio.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Un metodo genetica inversa adattabile per zebrafish per valutare la funzione del gene durante le fasi successive di sviluppo e omeostasi fisiologica, come la rigenerazione dei tessuti utilizzando iniezioni intraventricolare di Morpholinos gene-specifici.

Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

Per far luce sui meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi e della rigenerazione adulta del pesce zebra, abbiamo sviluppato un protocollo per la chirurgia invasiva che causa lesioni meccaniche nel telencefalo adulto del pesce zebra e il successivo monitoraggio dei cambiamenti nell'emisfero pugnalato mediante immunoistochimica o ibridazione in situ.

Stab Ferita Lesione del Zebrafish adulti Telencefalo: Un metodo per Indagare vertebrati cervello neurogenesi e rigenerazione

Qui presentiamo un metodo affidabile per studiare la rigenerazione renale adulta inducendo un danno renale acuto mediante iniezione di gentamicina. Dimostriamo che il danno dipende dal dosaggio di gentamicina e dalla temperatura ambientale utilizzando l'ibridazione in situ per marcare lhx1a+ sviluppando nuovi nefroni.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

Presentiamo un protocollo per catturare la dinamica della rigenerazione della pinna caudale larvale del pesce zebra su una scala dell'intero tessuto utilizzando la stereomicroscopia basata sul campo chiaro. Questa tecnica consente di catturare le dinamiche di rigenerazione con la risoluzione di una singola cella. Questa metodologia può essere adattata a qualsiasi stereomicroscopio dotato di una telecamera CCD e di un software time-lapse.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Qui presentiamo un protocollo per trapiantare cellule con un'elevata risoluzione spaziale e temporale in embrioni e larve di zebrafish in qualsiasi fase tra almeno 1 e 7 giorni dopo la fecondazione.

Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Scopri come utilizzare il sistema TetON per l'espressione genica condizionale e tessuto-specifica nella pinna caudale rigenerante di Danio rerio. Questo metodo permette di studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione.

L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

Esplora altri video