L'utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di impostare un sistema TED funzionale nel pesce zebra per ottenere un'espressione genica condizionale e specifica per tessuto, come dimostrato nel video nella pinna caudale in rigenerazione. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando linee transgeniche di attivatore Tet che esprimono un attivatore trascrizionale inducibile alla tetraciclina marcato con am cyan nel tessuto di interesse e linee risponditrici Tet che contengono un gene di interesse con un marcatore YPE sotto il controllo di elementi responsivi al Tet. Successivamente vengono stabilite combinazioni specifiche di pesci doppio transgenici attivatore Tet e risponditore Tet.

Successivamente, l'espressione del transgene rispondente al sistema Tet specifico per il tessuto viene indotta mediante somministrazione di doxiciclina. Infine, l'espressione del transgene rispondente al sistema Tet viene verificata preparando sezioni di tessuto di rigenerati della pinna. In ultima analisi, l'immunofluorescenza viene utilizzata per visualizzare l'espressione tissutale specifica del transgene rispondente al sistema Tet.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come l'espressione genica indotta da shock termico, è che il sistema DEED consente un'espressione genica inducibile e reversibile in maniera specifica per tessuto. Questo metodo può contribuire a ottenere una comprensione più approfondita delle reti di segnalazione molecolare che guidano la rigenerazione della pinna nei pesci S, poiché permette l'analisi del percorso di segnalazione e della funzione genica in tessuti singoli. Sebbene utilizziamo questa tecnologia per studiare la rigenerazione della pinna nel pesce zebra, essa può rivelarsi utile anche in molti altri contesti che richiedono la manipolazione specifica per tessuto della funzione genica.

Dopo aver generato linee di pesci risponditori Tet seguendo il protocollo descritto nel testo, valutare l'integrazione nella linea germinale e l'inducibilità del transgene incrociando singoli pesci G zero con una linea precedentemente stabilita di attivatore Tet. Successivamente raccogliere gli embrioni e allevare fino a uno stadio in cui sia possibile valutare l'induzione del risponditore Tet. Preparare una soluzione madre di doxiciclina 2000 x utilizzando etanolo al 50% per sciogliere il dox fino a raggiungere una concentrazione di 50 milligrammi per millilitro.

Conservare aliquote di docks al riparo dalla luce a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare il mezzo per embrioni E tre contenente docks a una concentrazione finale di 25 microgrammi per millilitro. Poi, decantare la maggior parte del mezzo E tre dagli embrioni.

Sostituirlo con dos contenenti E tre medium e riportare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius per un minimo di sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare un microscopio stereoscopico a fluorescenza per analizzare gli embrioni alla ricerca di fluorescenza Y pet. Stabilire diverse linee transgeniche stabili Tet responder da fondatori appena identificati.

Scegliere linee che inducano in modo forte e mostrino una bassa mosaicizzazione all'interno del dominio di espressione previsto, nonché una ridotta variabilità tra singoli embrioni. Una volta stabilite le linee di pesci con attivatore Tet e risponditore Tet, incrociare i portatori dell'attivatore Tet con i portatori del risponditore Tet per generare organismi doppio transgenici. Selezionare gli embrioni portatori del transgene attivatore Tet analizzando la fluorescenza ciano-am in un microscopio stereoscopico e allevare gli embrioni positivi per la ciano-am fino all'età adulta.

Identificare pesci adulti doppio transgenici che portano il risponditore Tet oltre all'attivatore Tet mediante genotipizzazione basata sulla PCR o in base alla loro capacità di indurre l'espressione del risponditore Tet nel tessuto di interesse per eseguire la rimozione della pinna caudale. Anestetizzare i pesci zebra adulti in un becher riempito con acqua per pesci contenente 160 microgrammi per millilitro di trica. Quando il pesce smette di muoversi, utilizzare pinzette per trasferirlo con attenzione su una piastra di Petri capovolta e usare un bisturi per eseguire un'amputazione parziale della pinna caudale da trattare con docs. Preparare scatole di riproduzione con un litro di acqua del sistema per pesci contenente 25 microgrammi per millilitro di doxiciclina.

Come controllo negativo, aggiungere 250 microlitri di etanolo invece di doxiciclina in scatole di riproduzione contenenti un litro di acqua del sistema per pesci; trasferire fino a 10 pesci doppiamente transgenici in ciascuna scatola di riproduzione e collocare le scatole al buio per ridurre lo stress. Dopo un minimo di sei ore, anestetizzare e trasferire i pesci trattati in una capsula Petri rivestita con agar umido e utilizzare pinzette per distendere la pinna caudale. Successivamente, osservare i pesci al microscopio a fluorescenza per verificare la comparsa di Y PET nel tessuto in rigenerazione.

Successivamente, i pesci possono essere utilizzati per ulteriori trattamenti o restituiti al sistema di allevamento per interrompere l'induzione del transgene risponditore dopo l'amputazione parziale della pinna e il trattamento con docs. Amputare nuovamente i rigenerati della pinna a circa quattro-cinque segmenti ossei prossimali rispetto al piano di amputazione iniziale e in un punto temporale che dipende dal vostro setup sperimentale, come descritto in precedenza in questo video. Con pinzette, maneggiando esclusivamente la parte del moncone del tessuto, posizionare con attenzione i rigenerati del tessuto in modo piatto in una piccola capsula di Petri contenente il 4% peso/volume di PFA in PBS e fissare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, utilizzare PBS per lavare i rigenerati due volte prima di trasferirli in E-D-T-A-P-B-S 0,5 M per decalcificare la matrice ossea a quattro gradi Celsius per tutta la notte. Successivamente, incubare i rigenerati in una serie di soluzioni di saccarosio in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti ciascuna e infine in parti uguali di saccarosio al 30% in PBS e mezzo di congelamento per tessuti per ulteriori 30 minuti.

Trasferire le pinne nel mezzo di congelamento per tessuti e incubare a quattro gradi Celsius per almeno due ore. Successivamente, posizionare gli stampi criogenici su un vetrino e riempirli con il mezzo di congelamento per tessuti. Trasferire i rigenerati negli stampi criogenici e orientare il tessuto per ottenere sezioni longitudinali o trasversali.

Assicurarsi che il rigenerato sia dritto per facilitare il sezionamento. Insieme al vetrino, trasferire gli stampi criogenici su un supporto metallico posizionato su un letto di ghiaccio secco per avviare il processo di congelamento. Quando il mezzo è solidificato, riportare gli stampi criogenici a temperatura ambiente per consentire al mezzo di scongelarsi all'interfaccia tra plastica e mezzo.

Quindi, utilizzando uno strumento come una penna, spingere il blocco congelato fuori dallo stampo criogenico e conservarlo a meno 80 gradi Celsius fino al taglio con un microtomo criogeno. Raccogliere sezioni di 10-14 micrometri su vetrini adesivi per microscopio e conservare i vetrini a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. Per caratterizzare l'espressione del risponditore Tet su sezioni di pinna, trattare le sezioni con metanolo al 100% raffreddato a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti.

Rimuovere con attenzione il liquido utilizzando un tovagliolo di carta. Quindi lavare le sezioni due volte con PBT e una volta con PBS per cinque minuti ciascuno. Incubare le sezioni per 10 minuti in dappy prima di lavarle due volte con PBS per 10 minuti ciascuno.

Quindi utilizzare un mezzo di montaggio Antifa e un coprivetrino per montare i campioni prima di eseguire la microscopia a fluorescenza confocale o a campo ampio per acquisire le immagini dei campioni, dopo aver stabilito un sistema TET funzionale nei pesci zebra. Questo sistema può essere impiegato per verificare la funzione di geni o di vie di segnalazione in tessuti specifici. Come mostrato qui, l'attivatore tet sotto il controllo del promotore HER 4.3 induce l'espressione del risponditore TED solo in un sottoinsieme di tessuti: la fluorescenza di YFP viene rilevata nella blastema prossimale proliferativa, mentre la blastema distale e l'epidermide sono prive di espressione.

L'espressione dell'antagonista WINT della beta-catenina agisce in uno dei domini HER 4.3 contenente le cellule proliferative della blasta, ma sorprendentemente non ha alcun effetto sulla proliferazione cellulare rigenerativa. Questo suggerisce che la segnalazione della wind betaina e delle cellule proliferative nella blastema prossimale non ha un ruolo essenziale nella regolazione della proliferazione delle cellule ML della blastema. Al contrario, l'uso della linea attivatrice Tet sotto il controllo del promotore dell'ubiquitina per indurre l'espressione di axin uno in tutti i tessuti della rigenerazione della pinna interferisce fortemente con la proliferazione cellulare rigenerativa.

Inoltre, l'espressione di axon uno nel dominio HER 4.3, che non include gli osteoblasti, interferisce fortemente con la formazione ossea nel tessuto rigenerato. Pertanto, l'interferenza specifica per tessuto con la segnalazione di wind mediante il sistema TE on rivela funzioni indirette inattese della segnalazione di wind nella regolazione della proliferazione cellulare e nella rigenerazione ossea. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per ottenere un'espressione genica indotta e mirata in qualsiasi tessuto di interesse.

Abbiamo applicato con successo questo metodo per indagare le funzioni specifiche dei tessuti nella segnalazione della nicotina nel letto del vento nella rigenerazione della pinna caudale del pesce S. L'utilizzo di questo metodo contribuirà a ottenere una comprensione più completa dei determinanti molecolari che regolano la rigenerazione dei tessuti.