Name: Lutilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri come utilizzare il sistema TetON per l'espressione genica condizionale e tessuto-specifica nella pinna caudale rigenerante di Danio rerio. Questo metodo permette di studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione.

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Gli autori ringraziano Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte per l&#39;assistenza tecnica. Il lavoro in laboratorio Weidinger è sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e dalla Deutsche Gesellschaft für Kardiologie tramite un Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
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<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
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<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
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<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare con successo molti organi interni e appendici. Una conoscenza approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede un&#39;analisi tessuto-specifica delle funzioni dei geni e vie di segnalazione. Verso questo, il sistema di Teton fornisce un efficace strumento per l&#39;espressione genica controllata spatiotemporally in zebrafish embrionali e adulte. I costrutti sistema Teton e metodologie descritte in questo manoscritto sono stati utilizzat...

Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell&#39;espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi. Attualmente, tre diversi sistemi sono stati utilizzati per realizzare condizionale, espressione tessuto-specifica del gene in rigenerazione organi di zebrafish adulto: il sistema Cre-lox, espressione mosaico di heat-shock transgeni inducibile mediante trasposoni mediata transgenesi somatica, e il sistema di Teton 1 -3. TETON riferisce ad una variante di un tetraciclina-CONTlaminati sistema di attivazione trascrizionale, dove l&#39;espressione viene attivato in presenza di tetraciclina o un suo derivato, ad esempio doxiciclina. Il sistema Cre-lox, come è finora stato utilizzato in pesci adulti, si basa su un ricombinasi Tamoxifen controllato Cre (CreERT2), la cui espressione è spazialmente limitata da elementi regolatori tessuto-specifici. Rimozione Cre-driven di una cassetta di STOP facilita l&#39;espressione del gene di interesse guidata da un promotore che deve essere attiva in tutti i tipi cellulari 1. Creazione Transposon mediata di transgeni somatiche mosaically espresse offre un sistema di espressione del transgene inducibile in linee cellulari individuali. Iniezione di embrioni di zebrafish con trasposone Tol2 che porta un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale di un shock termico risultati promotore in individui chimerici tipicamente portano il transgene solo in linee cellulari discreti di un organo rigenerante 2. Mentre entrambi i sistemi permettono condizionale tessuti speespressione genica fica, il sistema Cre-lox non è reversibile, e la strategia di utilizzo di etichettatura clonale basato trasposoni-risente della sua natura stocastica. Così, noi ed altri hanno recentemente adattato sistemi Teton transgenici per l&#39;utilizzo in zebrafish, che facilitano temporalmente e l&#39;espressione genica spazialmente controllata che si aggiunge sintonizzabile e reversibile 3-5. Il sistema di Teton qui utilizzato comprende una linea pilota transgenica (TetActivator), in cui un Doxiciclina (DOX) -inducible attivatore trascrizionale (migliorato transattivatore tetraciclina inverso, irtTA, breve Teta) è sotto il controllo di sequenze regolatorie genomiche tessuto-specifici. In secondo luogo, esso richiede una linea transgenica responder (TetResponder) che ospita un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale del gestore tetraciclina (Tet elemento di risposta; tetre) (Figura 1A). Pertanto, l&#39;uso di combinazioni specifiche di linee TetActivator e TetResponder consente condizionale tessuto-specificomanipolazione fic dell&#39;espressione genica. Abbiamo recentemente utilizzato il sistema di Teton a sondare per le funzioni di tessuto-specifici di Wnt segnalazione / beta-catenina nell&#39;adulto rigeneranti coda zebrafish fin 3. Nel protocollo descritto qui si descrive un flusso di lavoro per la messa a punto e l&#39;uso del sistema di Teton in zebrafish, in particolare per gli studi di rigenerazione fin. Questo include le istruzioni dettagliate su come generare linee TetActivator e TetResponder transgeniche stabili e di un protocollo per l&#39;induzione transgene in embrioni e zebrafish adulto. Inoltre, si descrivono tecniche per la verifica dell&#39;espressione genica tessuto-specifica nel rigenerato aletta, compreso un protocollo per la preparazione di criosezioni di pinne zebrafish adulti. Inoltre, si discute considerazioni per la progettazione del transgene TetActivator, la scelta di un metodo di transgenesi e rilevamento di espressione TetResponder. Quindi, l&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di servire da modelloprevista per il montaggio di un sistema téton funzionale zebrafish per ottenere l&#39;espressione genica condizionale tessuto-specifico, che può essere applicato a qualsiasi tessuto di interesse. Abbiamo creato un vettore TetActivator consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetActivator stabili utilizzando sequenze di regolazione genomica brevi (frammenti enhancer; Weidinger laboratorio banca dati plasmide no 1247;. Figura 1B). Questo costrutto contiene una cassetta TetActivator consistente della variante mutante M2 del dominio repressore Tet inverso fuso con il virus Herpes simplex VP16 transattivazione dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F)]. Espressione dei TetActivator (TETA) può essere facilmente monitorato dal momento che è co-espressa con il fluoroforo AmCyan dalla stessa griglia di lettura aperta; un peptide P2A media ribosomiale per saltare, che dovrebbe portare la produzione di Teta e AmCyan proteine ​​separate a un rapporto 1: 1 5,6. Il costrutto contiene anche un poylinker 5 &#39;del Tcassette etActivator per facilitare l&#39;inserimento di genomica sequenze regolatrici di interesse utilizzando metodi di clonazione convenzionali. Inoltre, abbiamo creato un costrutto costituito dal cassetto sopra descritto TetActivator più una cassetta di selezione kanamicina (Weidinger database di plasmide laboratorio no 1180;. Figura 1C), che possono essere ricombinati in un cromosoma artificiale batterico (BAC) contenente una grande regione genomica ( di solito nel codone di inizio di un gene la cui espressione modello deve essere imitata dal transgene). Entrambi i costrutti sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.

<table><tbody><tr><td>Scatole di allevamento</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza composta</td><td>, ad es. Leica, Zeiss</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per l'imaging di sezioni di tessuto fluorescenti</td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>, ad es. Leica, Zeiss</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per l'imaging di sezioni di tessuto fluorescenti</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>, ad es. Leica, Thermo-Scientific</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per criosezione</td></tr><tr><td>4', 6- diamidino-2-fenilinodele (Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>utilizzare 1/5.000 in PBS per la visualizzazione dei nuclei</td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>preparare scorte in 50% EtOH a 50 mg/ml (97 mM) per TetResponder</td></tr><tr><td>induzione Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4% (p/v) di paraformaldeide in PBS, pH 7,5 per la fissazione</td></tr><tr><td>1x soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>1,7 mM KH2PO4, 5,2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7,5</td></tr><tr><td>1x Soluzione salina tampone fosfato + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS con 0,1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus vetrini per microscopio ad adesione</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>1014356190</td><td>per la raccolta di sezioni di tessuto</td></tr><tr><td>Microscopio a stereofluorescenza</td><td>, ad esempio Leica, Zeiss,</td><td>varia a seconda del produttore per la</td><td>genotipizzazione basata sulla fluorescenza</td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>, ad esempio Biorad, Applied Biosystems</td><td>varia a seconda del produttore</td><td>per la genotipizzazione basata su PCR</td></tr><tr><td>Mezzo di congelamento dei tessuti (TFM)</td><td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td>per l'inclusione di tessuti campioni</td></tr><tr><td>Tricaina (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>per anestesia utilizzare a 1 mg/ml in terreno embrionale E3</td></tr></tbody></table>

l&#39;utilizzo del sistema di teton per studiare meccanismi molecolari della rigenerazione zebrafish

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Il pesce zebra è diventato un organismo modello molto importante per lo studio dello sviluppo dei vertebrati, della fisiologia, delle malattie e della rigenerazione dei tessuti. Una comprensione approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede strumenti sperimentali che consentano la manipolazione inducibile e tessuto-specifica dell'espressione genica o delle vie di segnalazione. Pertanto, noi e altri abbiamo recentemente adattato il sistema TetON per l'uso nel pesce zebra. Il sistema TetON facilita l'espressione genica controllata temporalmente e spazialmente e abbiamo recentemente utilizzato questo strumento per sondare le funzioni tessuto-specifiche della segnalazione Wnt/beta-catenina durante la rigenerazione della pinna caudale del pesce zebra. Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere un'espressione genica inducibile e tessuto-specifica nella pinna caudale adulta che si rigenera di pesce zebra. Ciò include la generazione di linee transgeniche stabili TetActivator e TetResponder, l'induzione transgenica e le tecniche per la verifica dell'espressione genica tessuto-specifica nella pinna rigenerata. Pertanto, questo protocollo funge da modello per la creazione di un sistema TetON funzionale nel pesce zebra e il suo successivo utilizzo, in particolare per lo studio della rigenerazione delle pinne.

Per stabilire un sistema di Teton funzionale per l&#39;espressione del gene inducibile tessuto-specifica, TetActivator transgenici e linee TetResponder bisogno di essere generato (Figura 1A). Questo si ottiene microinjecting TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) costruisce in embrioni di zebrafish e la successiva integrazione della linea germinale. Costrutti TetActivator funzionali possono essere generati sia per clonazione di brevi se...

Qui descriviamo il flusso di lavoro per l'utilizzo del sistema TetON per ottenere l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale del pesce zebra adulto che si rigenera.

L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di impostare un sistema TED funzionale nel pesce zebra per ottenere un'espressione genica condizionale e specifica per tessuto, come dimostrato nel video nella pinna caudale in rigenerazione. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando linee transgeniche di attivatore Tet che esprimono un attivatore trascrizionale inducibile alla tetraciclina marcato con am cyan nel tessuto di interesse e linee risponditrici Tet che contengono un gene di interesse con un marcatore YPE sotto il controllo di elementi responsivi al Tet. Successivamente vengono stabilite combinazioni specifiche di pesci doppio transgenici attivatore Tet e risponditore Tet.Successivamente, l'espressione del transgene rispondente al sistema Tet specifico per il tessuto viene indotta mediante somministrazione di doxiciclina. Infine, l'espressione del transgene rispondente al sistema Tet viene verificata preparando sezioni di tessuto di rigenerati della pinna. In ultima analisi, l'immunofluorescenza viene utilizzata per visualizzare l'espressione tissutale specifica del transgene rispondente al sistema Tet.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri m

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