Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

L'obiettivo generale di questa procedura è ridurre al minimo lo stress della raccolta del sangue dai ratti mediante campionamento attraverso la vena laterale della coda. Ciò si ottiene trattenendo prima il ratto e riscaldando la coda. Nella seconda fase, un catetere a farfalla viene inserito in una delle vene laterali dilatate della coda, quindi il sangue viene prelevato nella fase finale.

Il catetere viene rimosso e il flusso sanguigno dal sito di puntura viene interrotto. In definitiva, il campionamento del sangue dalla vena laterale della coda provoca uno stress minimo al ratto durante la raccolta del sangue, riducendo l'influenza della risposta acuta allo stress sulla composizione del sangue. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'amputazione della punta della coda per quanto riguarda il campionamento dalla vena laterale della coda, sono molto meno angoscianti per l'animale e consentono di ripetere il campionamento all'interno del soggetto.

La procedura sarà dimostrata da due membri del mio laboratorio, Graham Lee, un postdoc ed Elia Harmatz, un tecnico Per iniziare, collegare un catetere a farfalla alla siringa, mantenendo lo scudo della siringa sopra l'ago per proteggere la punta. Quindi prelevare un volume di eparina leggermente superiore al volume di sangue che verrà raccolto. Staccare la siringa e riempirla d'aria.

Ricollegare la siringa al catetere ed espellere tutte le quantità di soluzione di eparina dal tubo, dall'ago e dalla siringa. Quindi posizionare il catetere e la siringa su una superficie sterile. Ora, fissa rapidamente il ratto in un panno pulito, facendo attenzione che le quattro zampe e quelle posteriori siano in una posizione comoda e che la respirazione sia libera.

Fissare l'involucro con nastro a strappo. Quindi, su una superficie di lavoro solida, chiedi a un assistente di trattenere delicatamente e saldamente il ratto per l'addome e la base della coda con la coda che pende dal bordo del bancone per ottenere il campione di sangue. Quindi, dilatare i vasi sanguigni della coda in acqua a 42 gradi Celsius per 40-50 secondi.

Quindi asciugare la coda con un tovagliolo di carta e ruotare tutto il corpo con la coda per individuare la vena della coda destra o sinistra, lateralmente all'arteria per il sanguinamento. Colpire una sezione della vena nella parte inferiore della coda e pulire l'area con una soluzione antisettica di clorexidina al 2%. Successivamente, estrarre lo stantuffo della siringa da zero a circa 50 microlitri per creare una pressione negativa nella siringa e afferrare delicatamente e saldamente la coda vicino alla punta per mantenere la coda dritta durante la raccolta del campione.

Ora, inserisci lentamente il catetere nella vena con un angolo poco profondo, a circa cinque centimetri dalla punta della coda. Quando la vena viene penetrata, il sangue fluirà nel catetere, ritirerà lentamente lo stantuffo della siringa per raccogliere il volume desiderato a una velocità costante di circa 20 microlitri al secondo. Per facilitare il flusso sanguigno, far scorrere un dito lungo la lunghezza della vena dalla base verso la punta della coda rimanendo a più di due centimetri dalla punta dell'ago inserito per mungere il sangue.

Se il sangue non può essere raccolto con successo dal sito iniziale di penetrazione del catetere, reinserire l'ago più in alto nella vena. Quando è stato raccolto un volume di campione adeguato, scollegare e ricollegare il catetere per rilasciare la pressione nella siringa. Quindi estrarre l'ago dalla vena e applicare brevemente una pressione sul sito di inserimento per fermare l'emorragia quando l'emorragia si è fermata.

Pulisci l'area con una soluzione antisettica e riporta l'animale nella sua gabbia di casa. Per elaborare il campione di sangue, aspirare l'aria per assicurarsi che non rimanga sangue all'interno dell'ago del catetere e utilizzare le forbici per tagliare il tubo del catetere appena sopra l'ago. Rimuovere l'ago, quindi raccogliere il plasma sanguigno ed espellere il sangue in provette da microcentrifuga contenenti EDTA.

Come anticoagulante. Muovere delicatamente la provetta per miscelare l'anticoagulante nel sangue e quindi posizionare i campioni sul ghiaccio. Entro 10 minuti dal prelievo, centrifugare il sangue intero ed eluire il plasma, facendo attenzione a non disturbare gli strati dei globuli rossi e bianchi per raccogliere il siero del sangue.

Mettere il sangue in provette da microcentrifuga senza anticoagulante a temperatura ambiente per un massimo di 30 minuti. Quindi, dopo che il sangue si è coagulato, centrifugare le provette di raccolta in una centrifuga refrigerata ed eluire il siero. Entrambi i tipi di campioni possono quindi essere utilizzati immediatamente o conservati a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un anno.

Il plasma sanguigno raccolto dalla vena laterale della coda, come dimostrato, fornisce un campione di plasma traslucido e di aspetto giallo pallido. Se si è verificata un'emolisi, al plasma verrà impartita una tinta rossa. Una risposta acuta allo stress può alterare rapidamente la composizione di un campione di sangue.

Ad esempio, la concentrazione circolante di corticosterone aumenta notevolmente entro 10 minuti dall'esposizione a un fattore di stress, come in questo esperimento rappresentativo. È importante, tuttavia, che il basso livello basale di corticosterone ottenuto con questo metodo prima dell'esposizione al fattore di stress riveli che la procedura di campionamento in sé non è una fonte significativa di stress. Ti suggeriamo di esercitarti con questa procedura su animali anestetizzati fino a quando non avrai padroneggiato l'inserimento dell'ago e la raccolta del sangue.

Quindi, una volta padroneggiata, la tecnica può essere completata in cinque minuti se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo qualsiasi potenziale fonte di stress, come il rumore ambientale, e di completare la procedura il più rapidamente possibile.