Applicazione del DNA-Specific Stain metile Verde al Fluorescent Etichettatura degli embrioni
2 maggio 2015
Viene descritto un metodo per la colorazione fluorescente di materiale biologico fisso con l'etichetta specifica del DNA verde metile. Il verde metile viene utilizzato in una soluzione acquosa diluita ed è molto resistente al fotosbiancamento. La sua emissione a lontano rosso consente l'imaging profondo del campione, rendendolo particolarmente adatto per gli embrioni interi.
In questo video, mostreremo come la colorazione istologica molto comune verde metile possa essere utilizzata come etichetta nucleare estremamente conveniente nella microscopia fluorescente con le applicazioni speciali nella microscopia confocale laser di campioni biologici spessi come embrioni interi. Dopo aver brevemente introdotto il verde metile come colorante specifico per il DNA, descriveremo il metodo per preparare le soluzioni stock e di lavoro per la colorazione fluorescente. Mostreremo quindi la procedura sperimentale per ottenere la colorazione nucleare e trattenere diversi embrioni di pesce ed esempi di immagini confocali ottenute.
Infine, verranno dimostrate e discusse le eccellenti proprietà fisico-chimiche dei verdi metilici. Freddy Misha scoprì il DNA nel 1869 e pochi anni dopo dimostrò che formava precipitati con un annal relativamente nuovo e una colorazione di verde metilico. Il verde metile ha due cariche positive che gli consentono di interagire fortemente con il DNA nel suo gruppo principale, legandosi preferenzialmente alle regioni di raggiungimento.
L'uso più esteso del verde metilico è stata la sua combinazione in una soluzione nasale con la perina di RNA, un metile sviluppato da UNA e Poppen Heim all'inizio del 20° secolo. Molto poco è stato analizzato, però, sulle proprietà fluorescenti del verde metilico, ed è per questo che abbiamo deciso di testare la possibilità che potesse essere utilizzato come etichetta fluorescente ad altissima affinità e specifica. Per il DNA sulle cellule.
Il verde metile è una colorazione di al metano con sette radici metiliche. Questo settimo gruppo si perde facilmente e ritorna al cristallovioletto. Per questo motivo, c'è una quantità di cristallovioletto mescolato con verde metile per rimuovere il cristallo.
La soluzione di verde metile viola può essere lavata con cloroformio per estrarre il cristallovioletto. Come mostreremo subito a questo scopo, prepariamo una soluzione di ACU al 4% sotto una cappa aspirante. Lo mescoliamo con almeno due parti di cloroformio e centrifughiamo per accelerare la separazione di fase.
Dopo la centrificazione, otteniamo una fase acquosa con verde metile e una fase organica inferiore con cloroformio e cristallovioletto. Abbiamo recuperato la fase superiore e ripetuto fino a quando la fase inferiore non appare chiara. Al termine, la fase superiore viene recuperata e diluita.
Questa soluzione è una stalla sul banco di lavoro per mesi. Ora mostreremo come procedere per tendere l'intero MO nello strato di embrioni con il verde metanfetamina. Per il microing confocale, utilizzeremo l'embrione di pesce ad alto trapianto.
Ad esempio, procurati embrioni di pesce zebra e lava via i detriti con un colino. Incubarli allo stadio desiderato nell'acqua dell'acquario o nel mezzo embrionale. Rimuovere il corium con una pinzetta sottile, fissare gli embrioni al 4% di formaldeide per queste poche ore o durante la notte.
Quindi lavare gli embrioni in PBST per diverse volte. Preparare una soluzione di lavoro verde metile diluendo la soluzione madre da cinque a 10.000 volte in PBST. Incubare gli embrioni nella soluzione per almeno tre ore a temperatura ambiente o durante la notte di quattro gradi Celsius diminuiti.
In questo esempio, le immagini confocali saranno ottenute in un microscopio confocale minore dotato di rivelatori spettrali. L'eccitazione massima si ottiene con un laser a 633 nanometri e il rivelatore è impostato su un'ampia gamma. Nell'area rossa dello spettro visibile.
L'emissione di rosso verde metile consente di ottenere immagini nucleari di buona qualità anche da campioni profondi come embrioni interi con una perdita di segnale minima. Questa prima serie mostra la retina di un pesce zebra i cui nuclei sono stati colorati con una colorazione di DNA ben consolidata a pro tre. Dopo un minuto ci allontaniamo.
Una regione di scansione ABL diventa evidente quando eseguiamo lo stesso esperimento con il verde metilico, non si vede alcuno sbiancamento evidente. Nelle serie seguenti, mostriamo risultati rappresentativi di ciò che può essere ottenuto utilizzando il protocollo qui descritto, cellula mitotica da epidermide di zebrafish in cui si possono osservare figure mitotiche. Nucleo IIC dallo stesso esemplare in cui si può vedere l'architettura nucleare.
Ricostruzione 3D di una parte di una cellula epidermica di larve di zebrafish marcata con amalino verde metile, una visione più panoramica di diverse forme nucleari entro una fecondazione di 48 ore, pesciolini d'argento, br retina. Abbiamo mostrato qui un modo semplice per preparare una colorazione di DNA fluorescente estremamente economica che può essere utilizzata nell'etichetta nucleare, anche se mostriamo solo come esempio, il di tenere diversi. Questa tecnica può essere applicata ai tuoi embrioni o tessuti, sia interi che sezionali.
Può essere utilizzato anche per la colorazione del DNA in gel e per la determinazione del DNA in soluzione mediante fotometria.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per la colorazione fluorescente di materiale biologico fissato mediante metilene verde, un marcatore specifico per il DNA. L'emissione nel vicino infrarosso del metilene verde consente un'immagine approfondita dei campioni, rendendolo adatto per l'analisi di embrioni interi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microscopia fluorescente
- Colorazione istologica
- Immagini biologiche
Sfondo
- Il verde metile è un colorante istologico comune.
- Interagisce fortemente con il DNA, legandosi preferenzialmente alle regioni ricche di AT.
- Fu scoperto nel contesto della ricerca sul DNA alla fine del XIX secolo.
- Il colorante è resistente allo sbiancamento fotochimico, aumentandone l'utilità in microscopia.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'uso del verde metile come marcatura nucleare nella microscopia fluorescente.
- Fornire un metodo per la preparazione di soluzioni stock e di lavoro per la colorazione.
- Illustrare l'imaging confocale di campioni biologici spessi.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di soluzioni stock e di lavoro di verde metile.
- Colorazione fluorescente di materiale biologico fissato.
- Applicazione della microscopia confocale a laser.
- Acquisizione di immagini di embrioni interi e analisi delle immagini confocali.
Risultati principali
- Colorazione nucleare riuscita di embrioni di pesce mediante l'uso del verde di metile.
- Dimostrazione di ottime capacità di imaging grazie alle proprietà del verde di metile.
- Le immagini confocali ottenute mostrano un'etichettatura nucleare chiara.
- È stata confermata la resistenza del verde di metile allo sbiancamento fotoindotto.
Conclusioni
- Il verde metile è un efficace marcatore nucleare per la microscopia fluorescente.
- Le sue proprietà lo rendono adatto all’imaging di campioni biologici spessi.
- Il metodo può essere applicato a diversi contesti di ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'etichettatura fluorescente del nucleo con verde metile consente un'analisi ad alta risoluzione dei nuclei in campioni biologici spessi, supportando le fasi iniziali della scoperta e la validazione degli obiettivi. La sua stabilità, specificità per il DNA e compatibilità con la microscopia confocale offrono un'elevata affidabilità predittiva per analisi a livello cellulare e tissutale. Questa capacità migliora il processo decisionale nei portafogli, permettendo un'analisi robusta e riproducibile in sistemi modello complessi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette una visualizzazione precisa del nucleo per studi basati su ipotesi in cellule e tessuti fissati.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio consentendo un'identificazione chiara dell'architettura nucleare.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica nei modelli cellulari mediante etichettatura specifica del DNA.
- Consente una selezione affidabile dei bersagli candidati sulla base di dati di imaging ad alta fedeltà.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto successivi.
- Fornisce una marcatura nucleare riproducibile e quantitativa, essenziale per la standardizzazione dei saggi.
- Supporta la scalabilità e il riutilizzo della piattaforma grazie alla stabilità e al basso costo del verde di metile.
- Permette una valutazione affidabile dei composti riducendo al minimo lo sbiancamento fotostatico e la perdita di segnale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi modello pertinenti per le malattie, permettendo l'acquisizione di immagini in embrioni interi e tessuti spessi.
- Mantiene la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie a un'etichettatura nucleare robusta.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio fornendo risultati di imaging coerenti tra diversi modelli.
- Migliora la riduzione del rischio predittiva grazie alla compatibilità con protocolli di colorazione multiplex.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La marcatura fluorescente con verde metile si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale delle ipotesi all’imaging preclinico, sostenendo flussi di lavoro che richiedono una visualizzazione nucleare robusta in campioni complessi.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi e la chiarificazione di percorsi mediante imaging nucleare specifico per il DNA.
- Screening: Fornisce un'etichettatura nucleare pronta all'uso e riproducibile per piattaforme di screening ad alto contenuto.
- Analisi: Offre letture quantitative e fotostabili per l'analisi comparativa delle condizioni cellulari.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori e la continuità nei modelli rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo aziendale: Offre una soluzione di etichettatura stabile ed economicamente vantaggiosa, adattabile a diversi programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nell'imaging nucleare.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità nei flussi di lavoro di imaging.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione e l'efficienza del capitale consentendo la generazione di dati robusti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di programmi di scoperta adeguati al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia confocale e tecniche di imaging fluorescente.
- Necessita dell'accesso a rivelatori spettrali e sorgenti di eccitazione laser compatibili (ad esempio, 633 nm).
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di colorazione e di acquisizione delle immagini per garantire la riproducibilità.
- Adattabile a diversi sistemi modello fissati, inclusi embrioni interi e sezioni di tessuto.
- Limitato a campioni fissati; non adatto all'imaging nucleare in cellule vive.
