Name: Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Impara a sintetizzare nanoparticelle lipidiche vaccinali e analizzare l'espansione di linfociti T CD8+ antigen-specifici in vivo mediante imaging e citometria a flusso in modelli murini.

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Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere 1K22AI097291-01 e dal Centro Nazionale per l&#39;avanzamento delle Scienze di traslazione del National Institutes of Health sotto Premio Numero UL1TR000433. Riconosciamo inoltre Prof. Darrell Irvine al MIT e il Prof. Matthias Stephan Fred Hutchinson Cancer Center per il loro contributo al lavoro iniziale sulle nanoparticelle vaccino e OT-I / Luc topi transgenici.

Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Università sull&#39;uso e la custodia degli animali (UCUCA) presso l&#39;Università del Michigan ed eseguito secondo le politiche e le linee guida stabilite. 1. Sintesi e caratterizzazione di ICMVs Co-caricato con proteine ​​antigene e adiuvante Molecole <ol><li> Mescolare 1: 1 rapporto molare di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) in cloroformio, mantenendo la quantità totale di lipidi a 1,26 mmol per batch (cioè, 500 mg di DOPC e 630 pg di MPB) in una fiala di vetro da 20 ml (diametro = 28 mm e altezza = 61 mm). </li><li> Aggiungere farmaci lipofili, come monofosforil lipide A (MPLA) o coloranti lipofili (ad esempio, DID), alla soluzione lipidica a concentrazione desiderata. Rimuovere accuratamente il solvente organico da spurgo con nitroge extra dryn gas e ponendo i campioni sotto vuoto O / N. </li><li> Idratare il film lipidico aggiungendo 200 ml di 10 mM bis-tris propano (BTP, pH 7.0) contenente idrosolubili farmaci (ad esempio, antigeni proteici). Vortex per 10 sec ogni 10 min per 1 ora a RT. </li><li> Trasferire il contenuto della fiala di vetro in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, posto i campioni in un bagno di acqua e ghiaccio, e sonicare continuamente per 5 minuti con l&#39;impostazione su una 125 W / 20 kHz sonda punta sonicatore intensità del 40%. </li><li> Aggiungere 4 ml di ditiotreitolo 150 mm (DTT) per ogni lotto (Concentrazione di impiego 2,4 mm), vortex e centrifugare brevemente con una microcentrifuga da tavolo. </li><li> Aggiungere 40 ml di 200 mM CaCl 2 e mescolare con la pipetta (Concentrazione di impiego 33 mm). Incubare i campioni a 37 ° C per 1 ora per permettere la reticolazione di MPB contenenti strati lipidici con DTT. </li><li> Campioni centrifugare a 20.000 g per 15 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in 200 ml di ddiH 2 O. </li><li> Ripetere il passaggio 1.7 e centrifugare di nuovo dopo il secondo ddiH 2 O lavaggio per rimuovere CaCl 2, che non ha reagito DTT, e materiali di carico non incapsulate dal surnatante. </li><li> Preparare 10 mg / ml di 2 kDa polietilenglicole-tiolo (PEG-SH) in ddiH 2 O. Risospendere ogni campione ICMV in 100 ml di soluzione di PEG-SH e incubare a 37 ° C per 30 min. </li><li> Eseguire due ddiH 2 O lavaggi (passo 1,7) e risospendere il pellet ICMV finale in PBS e conservare a 4 ° C. Prima dell&#39;uso, mescolare la sospensione ICMV, come particelle possono depositarsi sul fondo dopo una conservazione prolungata. </li><li> Per la caratterizzazione di particelle, rimuovere una piccola aliquota (~ 10%) di ICMVs da ogni lotto e diluire singolarmente in un volume totale di 1 ml di ddiH 2 O. Mettere un unico campione in una dimensione Zetasizer cellulare e misura delle particelle, indice di polidispersità, e il potenziale zeta dei campioni con un sistema di misura e DLS potenziale zeta (secondo il protocollo del produttore). </li></ol> 2. Esame del linfonodo drenante di ICMVs fluorescenza-etichettato con Microscopia confocale <ol><li> Preparazione di ICMVs caricato con l&#39;antigene fluoroforo marcatura ed colorante fluorescente lipofile <ol><li> Preparare proteina fluoroforo-tag, come ovalbumina reagito con Alexa Fluor 555-succinimidile estere, seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Per preparare ICMVs taggati con fluoroforo nella shell di lipidi, aggiungere colorante fluorescente lipofile, (ad esempio, 1,1&#39;-diottadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) durante la preparazione del film lipidico (Step 1.2) al 0,05% dell&#39;importo di lipidi molare. Per lipidi idratazione pellicola (Step 1.3), tampone uso contenente antigene fluoroforo-tag, e completa la sintesi ICMV come indicato dal passo 1,4-1,11. </li></ol></li><li> La somministrazione sottocutanea di nanoparticelle a base di coda <ol><li> Anestetizzare mouse usando un vaporizzatore flusso controllato dotato di una camera di induzione urazie 3% isoflurano e 1.5 L / min di flusso di ossigeno secondo un protocollo approvato IACUC animale. Una volta che il mouse è inconscia, effettuare le seguenti operazioni rapidamente prima dell&#39;anestesia indossa off per consentire l&#39;accesso ottimale al sito di iniezione e minimizzare il disagio per l&#39;animale. In alternativa, utilizzare un adeguato cono adatto per mantenere l&#39;anestesia. Se i topi vengono anestetizzati per più di 5 minuti, applicare lubrificante necessario per ridurre al minimo l&#39;irritazione degli occhi dopo la procedura. </li><li> Spruzzare la base della coda con il 70% di etanolo per disinfettare e bagnare la parte pelliccia capelli bagnati evidenziare una piccola zona di pelle visibile, che può essere usato per visualizzare l&#39;ago sotto la pelle. </li><li> Preparare sospensione iniettabile contenente particelle desiderata quantità di antigene e adiuvante per 100 ml di dose vaccinale in PBS (es, 10 mg e 0,3 mg OVA MPLA per 100 ml di dosaggio di iniezione è stato utilizzato in passato 6,9). </li><li> Disegnare il int sospensione di particellesiringa oa con un ago G 27-29 e inserire l&#39;ago alla base della coda (~ 5 mm dalla linea sottile) con lo smusso rivolto verso l&#39;alto e iniettare 50 ml di sospensione di particelle 22. </li><li> Attendere qualche secondo per la pressione di pareggiare per evitare un eccessivo riflusso ed estrarre l&#39;ago. Ripetere l&#39;iniezione sul lato opposto della base della coda di indirizzare entrambi drenanti LNs inguinali. </li></ol></li><li> Preparazione di criosezioni linfonodali e l&#39;esame con la microscopia confocale. <ol><li> Euthanize il mouse con CO 2 asfissia seguita da pneumotorace indotta secondo un protocollo approvato IACUC animale. Estrarre LNs inguinali secondo il protocollo dimostrato in Bedoya 23 e lavare il sangue ponendo i tessuti in 1 ml di 4 ° C PBS. </li><li> Assorbire il PBS dai tessuti con i tessuti e posizionare il tessuto in cryomolds tessuto (10 x 10 x 5 mm 3) pre-riempita fino all&#39;orlo con ottobre congelamento media 24. Snap congelare il tiscitare blocco in azoto liquido per 30 sec. In alternativa, posizionare blocco tessuto in ghiaccio secco per 30 min. Conservare tessuti congelati in -80 ° C freezer. </li><li> Tagliare sezioni di tessuto di spessore 5-10 micron di un criostato fissato a -20 ° C 24. </li><li> Se necessario, eseguire l&#39;etichettatura immunofluorescenza, ed esaminare il tessuto con la microscopia confocale come precedentemente dimostrato 24. </li></ol></li></ol> 3. Monitoraggio espansione di antigene-specifica, luciferasi che esprimono CD8 + cellule T dopo nanoparticelle vaccinazione con Whole Animal Imaging <ol><li> Isolamento di OVA 257-264 -specific, le cellule-luciferasi che esprimono CD8 + T da OT-I / Luc topi transgenici <ol><li> Eutanasia di un topo transgenico OT-I / Luc con CO 2 asfissia e indurre un pneumotorace secondo un protocollo approvato IACUC animale. Raccolto milza in modo sterile accedendo cavità peritoneale e staccare il tessuto dal pancreas 23 accuratamente, eposto in 5 ml di 4 ° C PBS + 2% FBS per trasferimento a cappa coltura tissutale. </li><li> Posizionare la milza su un nylon colino 70 micron su un 50 ml conica tubo da centrifuga (fino a 3 milze alla volta). Utilizzando un pistone da una siringa da 3 ml, macinare le cellule attraverso il filtro. </li><li> Lavare il pistone e il filtro con PBS + 2% FBS e scartare. Portare il volume totale di 10 ml / milza nel tubo 50 ml, prelevare un piccolo campione della sospensione cellulare a contare con un emocitometro e centrifugare per 10 min a 300 x g. </li><li> Utilizzando un kit magnetico selezione negativa in commercio, isolare la popolazione di cellule T CD8 +, seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Dopo aver lavato le cellule con PBS, contare il numero di isolate cellule T CD8 +. Per valutare la purezza delle isolate cellule T CD8 +, incubare ~ 20.000-30.000 cellule in 20 ml di topo CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) per 10 minuti, quindi aggiungere 20 ml di anticorpi αCD8-APC (0,005 mg / ml) e incubare per 30 min. Perform tutte le incubazioni a 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Eseguire l&#39;analisi di citometria di flusso 25. </li></ol></li><li> Trasferimento adottivo di isolate cellule T CD8 + e la visualizzazione della loro vaccinazione posto espansione <ol><li> Eseguire trasferimento adottivo di cellule isolate OT-I / Luc CD8 + T in naive C57BL / 6 topi somministrando 1-10 × 10 5 cellule in un volume di 200 microlitri di PBS via endovenosa coda vena 22 (giorno -1). Considerando che in pelliccia e pelle nera patch in topi C57BL / 6 può interferire con il segnale bioluminescente, albini rasato C57BL / 6 topi sono l&#39;ideale per questi studi. </li><li> Dopo una giornata (giorno 0), somministrare il vaccino, come descritto in precedenza (paragrafo 2.2). </li><li> Somministrare 150 mg di luciferina per kg di peso corporeo per via intraperitoneale topo in un volume di 300 ml di PBS. Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con isoflurano (come al punto 2.2.1) e visualizzare le cellule OT-I / Luc CD8 + T con l&#39;acquisizione del segnale di bioluminescenza per 5-10 min wesimo un intero sistema di imaging animale (IVIS, fare riferimento a Wilson 26 per istruzioni dettagliate). Ripetere se necessario per studi longitudinali. </li></ol></li></ol> 4. Peptide-MHC Tetramero colorazione di PBMC per l&#39;analisi di Antigen-specific cellule T CD8 + Nota: La seguente procedura di protocollo può essere effettuata sia utilizzando i topi C57BL / 6 adoptively trasferiti con cellule OT-I / Luc CD8 + T o C57BL / 6 topi senza il trasferimento adottivo. <ol><li> In un punto di tempo desiderato dopo la vaccinazione, raccogliere circa 100 ml di sangue (4-6 gocce) di topi tramite sottomandibolare tecnica sanguinamento 27 in un tubo rivestito di K 2 EDTA e capovolgere più volte per impedire la coagulazione. </li><li> Trasferire 100 ml di sangue in una provetta, aggiungere 1 ml di tampone di lisi, e incubare per 2-3 minuti per rimuovere i globuli rossi (RBC). Campioni di centrifugazione per 5 min a 1500 xg e rimuovere il surnatante. Se il pellet ancorappears rossi (che indicano la rimozione incompleta di globuli rossi), ripetere il passo lisi con una breve incubazione (&lt;1 min) di tampone di lisi. </li><li> Lavare le rimanenti PBMC con 1 ml di tampone FACS (PBS + 1% w / v BSA) e centrifugare a 1500 xg per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il campione in 20 ml di topo CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) per bloccare il legame degli anticorpi specifici e FCR-mediata. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le cellule da microprovette in 4 ml tubi FACS con fondo arrotondato. Aggiungere 20 ml di H-2K b soluzione OVA Tetramero-SIINFEKL-PE secondo le specifiche del costruttore per ogni campione e incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li><li> Preparare il cocktail di anticorpi (ad esempio, αCD8-APC, αCD44-FITC e αCD62L-PECy7 anticorpi (0.005, 0.005, e 0.002 mg / ml di concentrazione, rispettivamente)). Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione sperimentale, e incubare per 20 min in ghiaccio. Preparare controlli singoli fluorofori per labeling cellule con ogni tetramero fluoroforo-tag o anticorpi alla concentrazione sopra indicato. </li><li> Lavare 2 volte con tampone FACS e risospendere il pellet finale in tampone FACS contenente 2 mg / ml di DAPI. Le cellule sono ora pronti per citometria a flusso di analisi (dettagli ed esempi possono essere trovati in Scheffold 25). </li></ol>

Perkin Elmer a condizione che il costo di produzione sostenuti durante la pubblicazione di questo articolo.

Il protocollo fornito in questo articolo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un nuovo sistema di nanoparticelle a base lipidica, chiamato ICMVs, e fornisce il processo di convalida dell&#39;efficacia delle formulazioni di vaccino a base di nanoparticelle di indurre risposte delle cellule CD8 + T antigene-specifiche. Sintesi ICMV si completa in tutte le condizioni acquosa, che è un importante vantaggio rispetto ad altri sistemi comunemente utilizzati polimerici nanoparticelle (ad esempio, poli (lattide...

Sviluppo di un vaccino tradizionale è principalmente impiegato l&#39;approccio empirico di tentativi ed errori. Tuttavia, con il recente sviluppo di una vasta gamma di biomateriali e scoperta di determinanti molecolari di attivazione immunitaria, è ora possibile progettare razionalmente formulazioni di vaccino con spunti biofisici e biochimici derivati ​​da agenti patogeni 1,2. In particolare, diverse piattaforme di distribuzione di droga di particolato sono stati esaminati come portatori di vaccini in quanto possono essere co-caricati con antigeni subunità e agenti immunostimolanti, proteggere i componenti del vaccino dal degrado, e migliorare la loro co-consegna all&#39;antigene cellule presentanti (APC) residente in linfa nodi (LNS), massimizzando in tal modo la stimolazione immunitaria e l&#39;attivazione 3-5. In questo rapporto, descriviamo la sintesi di un sistema di nanoparticelle &quot;-patogeno imitando&quot;, chiamato interbilayer reticolato vescicole multilamellari (ICMVs), che sono stati precedentemente dimostrato come platfor potente vaccinom per lo scatenamento di robusta linfociti T citotossici (CTL) e le risposte immunitarie umorali in entrambi i compartimenti sistemiche e delle mucose 6-9. In particolare, la vaccinazione con ICMVs ottenuti in sostanzialmente migliorata livelli di IgG sieriche contro un antigene della malaria, in confronto con la vaccinazione con adiuvanti convenzionali (ad esempio, allume e Montanide) 7 e anche suscitato risposte CTL potenti contro le cellule tumorali e modelli sfida virali nei topi 9. Qui, utilizzando ICMVs come sistema di nanoparticelle modello di vaccino, si descrivono i metodi per la caratterizzazione di vaccini nano-formulazioni, tra cui le dimensioni delle particelle e le misure di potenziale zeta e il monitoraggio del traffico di particelle per LNs drenanti (dLNs) utilizzando confocale dei tessuti cryosectioned 7. Inoltre, vi presentiamo un metodo basato imaging intero animale di analizzare l&#39;espansione delle risposte CTL nei topi dopo il trasferimento adottivo di antigene-specifiche cellule T CD8 +-luciferasi che esprimono 9,10. Infine, describa tetramero colorazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per la quantificazione longitudinale risposte delle cellule T endogene nei topi vaccinati con nanoparticelle 6,9. ICMVs sono una formulazione di nanoparticelle a base lipidica sintetizzata da fusione controllata di liposomi multilamellari semplici in strutture, che vengono poi stabilizzati chimicamente mediante gruppi di testa di fosfolipidi maleimmide-funzionalizzati reticolanti all&#39;interno di strati lipidici con ditiolo reticolanti 6. Una volta che sono sintetizzati ICMVs, una piccola frazione di nanoparticelle può essere utilizzata per determinare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta (cioè, carica superficiale di particelle) con un sistema di dispersione dinamica della luce (DLS) e un analizzatore di potenziale zeta. DLS misura le variazioni nella diffusione della luce in sospensioni di particelle, permettendo la determinazione del coefficiente di diffusione e la dimensione idrodinamica delle particelle 11. Il raggiungimento di dimensioni coerente delle particelle da lotto a lotto sintesi è fondamentaledal momento che la dimensione delle particelle è uno dei principali fattori che influenzano drenaggio linfatico di particelle di vaccini per dLNs e la successiva captazione cellulare da APC 12,13. Inoltre, il potenziale zeta può essere ottenuto misurando la velocità della particella quando viene applicata una corrente elettrica, che permette di determinare la mobilità elettroforetica di particelle e superficie delle particelle di carica 11. Assicurare coerenti valori di potenziale zeta delle particelle è importante poiché carica superficiale delle particelle determina stabilità colloidale, che ha un impatto diretto sulla dispersione di particelle durante la conservazione e dopo somministrazione in vivo 14,15. Al fine di monitorare la localizzazione delle particelle di dLNs, ICMVs possono essere etichettati con fluorofori desiderati incluse tinture lipofile e antigeni covalente-tag. A seguito di vaccinazione, i topi possono essere sacrificati in vari momenti, dLNs asportato, cryosectioned, e analizzati con microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione di Drai linfaticaning di entrambi i vettori di vaccino nanoparticelle e antigene dLNs. Le sezioni di tessuto possono inoltre essere marcate con fluorescenza etichettati anticorpi e utilizzati per ottenere ulteriori informazioni, come i tipi di cellule associate con l&#39;antigene e formazione di centri germinali come abbiamo mostrato in precedenza 7. Una volta che la sintesi delle particelle è ottimizzata e la tratta ai dLNs è confermato, è importante per convalidare elicitation in vivo espansione CTL. Al fine di analizzare scatenamento di cellule antigene-specifiche T CD8 + in risposta alla vaccinazione delle nanoparticelle, abbiamo utilizzato un modello di antigene ovalbumina (OVA), con OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) immunodominante epitopi delle cellule T CD8 +, che permette analisi dettagliate immunologici di risposte delle cellule T antigene-specifiche per iniziale 16,17 lo sviluppo di vaccini. In particolare, per interrogare le dinamiche di espansione e la migrazione delle cellule antigene-specifiche CD8 + T, abbiamo generato undoppio modello di topo transgenico incrociando lucciola luciferasi che esprimono topi transgenici (Luc) con OT-I topi transgenici che possiedono le cellule CD8 + T con recettore delle cellule T (TCR) specifico per SIINFEKL (in associazione con H-2K b). Da questi topi OT-I / Luc, luciferasi che esprimono, le cellule OT-I T CD8 + possono essere isolati e preparati per il trasferimento adottivo in naïve topi C57BL / 6. Una volta seminato, l&#39;immunizzazione con successo nanoparticelle-OVA contenente comporterà l&#39;espansione delle cellule T trasferiti che possono essere monitorati dal monitoraggio del segnale bioluminescenza con un intero sistema di imaging 9,10 animale. Questa tecnica di imaging corpo intero non invasiva è stato usato con altri antigeni virali o tumorali in passato 18-20, processi di espansione delle cellule T nei tessuti linfoidi e diffusione ai tessuti periferici in modo longitudinale rivelare. Complementare all&#39;analisi di adoptively cellule T CD8 + antigene-specifici trasferiti, endogenole risposte delle cellule T a noi dopo la vaccinazione può essere esaminata con il complesso peptide-maggiore di istocompatibilità (MHC) test tetramero 21, in cui un complesso tetramero peptide-MHC, composta da quattro MHC di classe fluoroforo-tagged molecole I caricato con epitopi peptidici, è impiegato di legare TCR ed etichettare le cellule T CD8 + in modo antigene-specifica. Il test tetramero peptide-MHC può essere effettuata sia in studi della necroscopia terminali per identificare le cellule CD8 + T antigene-specifiche in linfoidi e tessuti periferici o in studi longitudinali con le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti da sangue di serie pareggi. Dopo la colorazione linfociti con peptide-MHC tetramero, citofluorimetria analisi viene eseguita per analisi dettagliate sul fenotipo di CTL o la quantificazione della loro frequenza tra cellule T CD8 +.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Sintesi e caratterizzazione di ICMV co-caricati con antigene proteico e molecole adiuvanti</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramide] (sale sodico) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Monofosforil Lipide A (Sintetico) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro da 20 ml</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Forno Sottovuoto</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbumina (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propano (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator (125&nbsp; W/20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Polietilenglicole Tiolato (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Cuvette</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Esame del drenaggio linfonodale di ICMV marcati con fluorescenza con microscopia confocale</td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3',3'-Tetramethylindodicarbbocianine, sale 4-clorobenzensolfonato (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT freezing medium&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Criostampi tissutali</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. Monitoraggio dell'espansione delle cellule T CD8+ antigene-specifiche, che esprimono luciferasi, dopo vaccinazione con nanoparticelle con imaging di tutto l'animale</td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 topi</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 topi</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m filtro in nylon</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit di isolamento delle cellule T CD8+ per topi</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; sistema di imaging per animali interi</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Colorazione con tetramero peptide-MHC di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per l'analisi citofluorimetrica di cellule T CD8+ antigene-specifiche</td></tr><tr><td>K2EDTA</td><td></td><td></td> tampone per lisi BD 365974 <td></td></tr><tr><td>ACK</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Block</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetramero</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6- Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn Citometro a flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di antigen-specific cd8 + cellule t risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Gli adiuvanti tradizionali dei vaccini, come l'allume, suscitano risposte subottimali delle cellule T CD8+. Per affrontare questa importante sfida nello sviluppo di vaccini, vari sistemi di nanoparticelle sono stati ingegnerizzati per imitare le caratteristiche dei patogeni per migliorare la consegna dell'antigene ai linfonodi drenanti e aumentare l'assorbimento dell'antigene da parte delle cellule presentanti l'antigene, portando a nuove formulazioni di vaccini ottimizzate per l'induzione di risposte delle cellule T CD8+ specifiche per l'antigene. In questo articolo, descriviamo la sintesi di un sistema di nanoparticelle "che imita i patogeni", chiamato vescicole multilamellari reticolate interbistrato (ICMV) che può fungere da efficace vettore di vaccini per la co-somministrazione di antigeni di subunità e agenti immunostimolatori e l'elicitazione di potenti risposte citotossiche dei linfociti T CD8+ (CTL). Descriviamo i metodi per caratterizzare le dimensioni idrodinamiche e la carica superficiale delle nanoparticelle di vaccino con diffusione dinamica della luce e analizzatore di potenziale zeta e presentiamo una procedura basata sulla microscopia confocale per analizzare la somministrazione di antigene mediata da nanoparticelle ai linfonodi drenanti. Inoltre, mostriamo una nuova tecnica di imaging a bioluminescenza di interi animali che utilizza il trasferimento adottivo di cellule T CD8+ antigene-specifiche che esprimono luciferasi in topi riceventi, seguito dalla vaccinazione con nanoparticelle, che consente l'interrogazione non invasiva dei modelli di espansione e traffico di CTL in tempo reale. Descriviamo anche la colorazione dei tetrameri e l'analisi citofluorimetrica delle cellule mononucleate del sangue periferico per la quantificazione longitudinale delle risposte endogene delle cellule T nei topi vaccinati con nanoparticelle.

I passi necessari per la sintesi di ICMVs sono illustrati in Figura 1 6. In breve, un film lipidico contenenti farmaci lipofili o coloranti fluorescenti è idratata in presenza di farmaci idrofili. Cationi divalenti, quali Ca 2+, si aggiungono a guidare fusione dei liposomi anionici in vescicole multilamellari. Ditiolo crosslinker, come DTT, è aggiunto il &quot;fiocco&quot; lipidi maleimmide-funzionalizzati su apposing strati lipidici, e, infine, rimanendo gruppi maleimmide esterne ...

Descriviamo tecniche basate sull'imaging di animali interi e citometria a flusso per monitorare l'espansione delle cellule T CD8+ antigene-specifiche in risposta all'immunizzazione con nanoparticelle in un modello murino di vaccinazione.

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sintetizzare e caratterizzare nanoparticelle lipidiche per vaccini e valutarne la capacità di indurre in vivo l'espansione di linfociti T citotossici specifici per l'antigene. Questo viene ottenuto progettando vescicole multilamellari interbiliari reticolate, o I CMVs, che mimickano i patogeni e sono caricate contemporaneamente con antigene e adjuvante, per la vaccinazione di topi naïve. Trasferiti adottivamente con linfociti T positivi per il CD8 e specifici per l'antigene che esprimono la luciferasi.Nel secondo passaggio, l'espansione delle cellule T CD8 positive specifiche per l'antigene viene valutata mediante imaging in vivo sull'intero organismo. Le cellule mononucleate del sangue periferico ottenute dagli animali immunizzati con ICMV vengono quindi marcate con tetramer marcati fluorescentemente e analizzate mediante citometria a flusso per quantificare la frequenza delle cellule T CD8 positive specifiche per l'antigene endogeno nel compartimento sistemico. In definitiva, l'imaging bioluminescente può essere utilizzato per monitorare l'espansione dei linfociti T citotossici specifici per l'antigene in risposta al vaccino a base di nanoparticelle.Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande preliminari fondamentali nella progettazione di vaccini, come ad esempio quale sia l'entità dell'espansione dei linfociti T citotossici e come queste cellule si distribuiscano nei vari tessuti in risposta alla vaccinazione con nanoparticelle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi in-situ dei linfociti T dopo la necroscopia dei tessuti, è che l'imaging in vivo della risposta dei linfociti T è non invasivo. Per iniziare, mescolare un rapporto molare uno a uno di DOPC e MPB in cloroformio, mantenendo una quantità totale di lipidi pari a 1,26 micromoli per ogni lotto in un vial di vetro da 20 millilitri.Successivamente, aggiungere il carico lipofilico alla soluzione lipidica alla concentrazione desiderata e spurgare la soluzione con gas azoto secco aggiuntivo per rimuovere completamente il solvente organico. Porre il campione sotto vuoto per tutta la notte; il mattino seguente, aggiungere 200 microlitri di BTP 10 millimolare contenente il carico idrosolubile di interesse per idratare il film lipidico; sottoporre la soluzione risultante a vortex per 10 secondi ogni 10 minuti per un'ora a temperatura ambiente. Trasferire quindi il contenuto in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Successivamente, posizionare il tubo in un bagno di ghiaccio con sonificazione continua utilizzando l'impostazione di intensità al 40% su una punta a sonda da 125 watt e 20 kilohertz. Dopo cinque minuti, aggiungere quattro microlitri di DTT 150 millimolare al tubo, vortexare per mescolare e centrifugare il campione in un microcentrifugo. Quindi, aggiungere 40 microlitri di cloruro di calcio 200 millimolare al campione, seguito dalla cross-linking degli strati lipidici contenenti MPB con DTT a 37 gradi Celsius per un'ora.Al termine dell'incubazione, centrifugare la soluzione tre volte, aggiungendo 200 microlitri di acqua bidistillata durante la seconda e la terza centrifugazione, per rimuovere il cloruro di calcio residuo, il DTT non reagito e i materiali del carico non incapsulati dal sopranatante. Dopo l'ultima centrifugazione, sospendere i I CMVs in 100 microlitri di pegolo appena preparato per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare le vescicole altre due volte con acqua bidistillata.Risospendere il pellet finale in PBS e conservare le ICM VS a quattro gradi Celsius. Per caratterizzare le particelle, mescolare la sospensione fredda di ICMV prima di diluire un piccolo aliquota del campione in un volume totale di un millilitro di acqua bidistillata. Successivamente, posizionare le ICMV in una cella per zeta sizer e utilizzare un sistema di misurazione della diffusione dinamica della luce e del potenziale zeta per determinare, secondo le istruzioni del produttore, la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersione e il potenziale zeta dei campioni.Per isolare le cellule T CD8 positive che esprimono la luciferasi specifiche per le ova, innanzitutto prelevare le milze da topi transgenici OT1 luciferasi. Posizionare i tessuti in cinque millilitri di PBS freddo con ghiaccio e 2% di FBS, quindi in una cappa a flusso laminare.Utilizzare lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per macerare fino a tre milze contemporaneamente attraverso un filtro da 70 micron in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare lo stantuffo e il filtro con PBS e FBS al 2%. Successivamente, portare il volume totale della sospensione cellulare a 10 millilitri per milza.Determinare il numero totale di cellule, quindi centrifugare le cellule. Successivamente, utilizzare un kit commerciale di selezione negativa magnetica per isolare le cellule spleniche CD eight positive secondo le istruzioni del produttore. Quindi lavare i linfociti T in PBS.Contarli e incubare da due a tre volte 10 alla quinta di cellule in 20 microlitri di anticorpo bloccante CD1632 murino. Dopo 10 minuti, aggiungere 20 microlitri di anticorpo anti-CD8a PC alle cellule per 30 minuti e valutare la purezza della popolazione di linfociti T CD8 positivi isolati con perline magnetiche mediante citometria a flusso. Successivamente, trasferire adottivamente da uno a 10 volte 10 alla quinta cellule T CD8 positive OT1 luciferasi in topi C57 neri sei albini rasati naïve in 200 microlitri di PBS mediante iniezione endovenosa nella vena della coda; 24 ore dopo, somministrare il vaccino al numero appropriato di giorni successivi alla vaccinazione.Iniettare negli animali 150 milligrammi per chilogrammo di Lucifer dopo 10 minuti, acquisire il segnale di bioluminescenza per cinque-dieci minuti mediante un sistema di imaging su animali interi per visualizzare le cellule T OT one Lucifer CD eight positive e determinare il numero di cellule T CD eight positive specifiche per l'antigene al momento appropriato. Dopo la vaccinazione, raccogliere circa 100 microlitri di sangue dai topi vaccinati mediante la tecnica di prelievo ematico sottomandibolare in un tubo rivestito con EDTA potassico, capovolgere il tubo diverse volte per prevenire la coagulazione. Successivamente, trasferire 100 microlitri di sangue in un tubo da microcentrifuga e aggiungere un millilitro di buffer di lisi CK.Dopo due o tre minuti, centrifugare le cellule ed eliminare il sopranatante. Lavare i PBMC rimanenti in un millilitro di tampone fax e bloccare il legame non specifico con CD16/32 come appena dimostrato. Dopo 10 minuti, dividere la sospensione cellulare in provette fax rotonde da quattro millilitri e aggiungere 20 microlitri di soluzione PE di tetramero H2-Kb secondo le specifiche del produttore a ciascun campione.Dopo 30 minuti sul ghiaccio, aggiungere 20 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato a ciascun campione sperimentale e agli anticorpi di controllo singoli per ciascun marcatore tetramer o anticorpo fluoro quattro a ciascun campione di controllo. Infine, dopo un'ulteriore incubazione di 20 minuti, lavare tutti i campioni in buffer fax, risospendere i pellet in buffer fax integrato con DPI e analizzare i campioni mediante citometria a flusso. I CMV co-caricati con antigeni proteici fluoro quattro e coloranti lipofili fluorescenti permettono la visualizzazione in vivo del rilascio di antigeni e nanoparticelle. Ad esempio, l'immagine ottenuta mediante microscopia confocale indica che l'antigene solubile somministrato per via sottocutanea alla base della coda raggiunge i linfonodi di drenaggio entro quattro ore dall'amministrazione e viene eliminato entro 24 ore.Al contrario, i CMV sovraccarichi sono inizialmente rilevati alla periferia dei linfonodi drenanti già a 24 ore dall'amministrazione, con un accumulo continuo che determina un ampio deposito di CMV-I-ova nel tessuto linfatico drenante. Già al quarto giorno, infatti, l'immagine bioluminescente di topi C57BL/6 sottoposti a trasferimento adottivo di cellule T CD8 positive OT1-Luciferasi nel giorno della vaccinazione mostra un livello di fondo minimo di cellule T OT1-luciferasi al quarto giorno successivo alla vaccinazione. Tuttavia, i topi immunizzati con i CMV-MPI-ova mostrano un segnale bioluminescente intenso nei linfonodi inguinali drenanti.I topi vaccinati con ova solubile, d'altra parte, mostrano un'espansione molto ridotta delle cellule T OT one Lucifer CD8 positive nei linfonodi drenanti. Ulteriori topi immunizzati con ova solubile e MPLA, senza alcun trasferimento adottivo di cellule T specifiche per l'antigene, non mostrano un'espansione apprezzabile di cellule T CD8 positive specifiche per ova, come indicato dal monitoraggio settimanale dei PBMC. La vaccinazione con ICMV, tuttavia, induce una risposta endogena di cellule T CD8 positive significativamente più forte, raggiungendo un picco del 28% di cellule T tetramero positive specifiche per syn fecal all'interno del compartimento delle cellule T CD8 positive nei PBMC entro il giorno 41. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle a base lipidica, eseguire immunizzazioni e visualizzare e quantificare l'espansione delle cellule T citotossiche in vivo.Questi metodi possono essere ulteriormente modificati per rivelare informazioni aggiuntive sulla risposta dei linfociti T citotossici. Ad esempio, il saggio di colorazione teer può essere integrato con marcatori aggiuntivi come CD127, BCL2 e Klrg1 per valutare il fenotipo di memoria delle cellule.

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Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione (Video) | JoVE Journal

Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

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