Imaging Whole-animale e di citometria a flusso tecniche di analisi di Antigen-specific CD8 + cellule T Risposte dopo nanoparticelle vaccinazione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sintetizzare e caratterizzare nanoparticelle lipidiche per vaccini e valutarne la capacità di indurre in vivo l'espansione di linfociti T citotossici specifici per l'antigene. Questo viene ottenuto progettando vescicole multilamellari interbiliari reticolate, o I CMVs, che mimickano i patogeni e sono caricate contemporaneamente con antigene e adjuvante, per la vaccinazione di topi naïve. Trasferiti adottivamente con linfociti T positivi per il CD8 e specifici per l'antigene che esprimono la luciferasi.

Nel secondo passaggio, l'espansione delle cellule T CD8 positive specifiche per l'antigene viene valutata mediante imaging in vivo sull'intero organismo. Le cellule mononucleate del sangue periferico ottenute dagli animali immunizzati con ICMV vengono quindi marcate con tetramer marcati fluorescentemente e analizzate mediante citometria a flusso per quantificare la frequenza delle cellule T CD8 positive specifiche per l'antigene endogeno nel compartimento sistemico. In definitiva, l'imaging bioluminescente può essere utilizzato per monitorare l'espansione dei linfociti T citotossici specifici per l'antigene in risposta al vaccino a base di nanoparticelle.

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande preliminari fondamentali nella progettazione di vaccini, come ad esempio quale sia l'entità dell'espansione dei linfociti T citotossici e come queste cellule si distribuiscano nei vari tessuti in risposta alla vaccinazione con nanoparticelle. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi in-situ dei linfociti T dopo la necroscopia dei tessuti, è che l'imaging in vivo della risposta dei linfociti T è non invasivo. Per iniziare, mescolare un rapporto molare uno a uno di DOPC e MPB in cloroformio, mantenendo una quantità totale di lipidi pari a 1,26 micromoli per ogni lotto in un vial di vetro da 20 millilitri.

Successivamente, aggiungere il carico lipofilico alla soluzione lipidica alla concentrazione desiderata e spurgare la soluzione con gas azoto secco aggiuntivo per rimuovere completamente il solvente organico. Porre il campione sotto vuoto per tutta la notte; il mattino seguente, aggiungere 200 microlitri di BTP 10 millimolare contenente il carico idrosolubile di interesse per idratare il film lipidico; sottoporre la soluzione risultante a vortex per 10 secondi ogni 10 minuti per un'ora a temperatura ambiente. Trasferire quindi il contenuto in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Successivamente, posizionare il tubo in un bagno di ghiaccio con sonificazione continua utilizzando l'impostazione di intensità al 40% su una punta a sonda da 125 watt e 20 kilohertz. Dopo cinque minuti, aggiungere quattro microlitri di DTT 150 millimolare al tubo, vortexare per mescolare e centrifugare il campione in un microcentrifugo. Quindi, aggiungere 40 microlitri di cloruro di calcio 200 millimolare al campione, seguito dalla cross-linking degli strati lipidici contenenti MPB con DTT a 37 gradi Celsius per un'ora.

Al termine dell'incubazione, centrifugare la soluzione tre volte, aggiungendo 200 microlitri di acqua bidistillata durante la seconda e la terza centrifugazione, per rimuovere il cloruro di calcio residuo, il DTT non reagito e i materiali del carico non incapsulati dal sopranatante. Dopo l'ultima centrifugazione, sospendere i I CMVs in 100 microlitri di pegolo appena preparato per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, lavare le vescicole altre due volte con acqua bidistillata.

Risospendere il pellet finale in PBS e conservare le ICM VS a quattro gradi Celsius. Per caratterizzare le particelle, mescolare la sospensione fredda di ICMV prima di diluire un piccolo aliquota del campione in un volume totale di un millilitro di acqua bidistillata. Successivamente, posizionare le ICMV in una cella per zeta sizer e utilizzare un sistema di misurazione della diffusione dinamica della luce e del potenziale zeta per determinare, secondo le istruzioni del produttore, la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersione e il potenziale zeta dei campioni.

Per isolare le cellule T CD8 positive che esprimono la luciferasi specifiche per le ova, innanzitutto prelevare le milze da topi transgenici OT1 luciferasi. Posizionare i tessuti in cinque millilitri di PBS freddo con ghiaccio e 2% di FBS, quindi in una cappa a flusso laminare.

Utilizzare lo stantuffo di una siringa da tre millilitri per macerare fino a tre milze contemporaneamente attraverso un filtro da 70 micron in un tubo conico da 15 millilitri. Lavare lo stantuffo e il filtro con PBS e FBS al 2%. Successivamente, portare il volume totale della sospensione cellulare a 10 millilitri per milza.

Determinare il numero totale di cellule, quindi centrifugare le cellule. Successivamente, utilizzare un kit commerciale di selezione negativa magnetica per isolare le cellule spleniche CD eight positive secondo le istruzioni del produttore. Quindi lavare i linfociti T in PBS.

Contarli e incubare da due a tre volte 10 alla quinta di cellule in 20 microlitri di anticorpo bloccante CD1632 murino. Dopo 10 minuti, aggiungere 20 microlitri di anticorpo anti-CD8a PC alle cellule per 30 minuti e valutare la purezza della popolazione di linfociti T CD8 positivi isolati con perline magnetiche mediante citometria a flusso. Successivamente, trasferire adottivamente da uno a 10 volte 10 alla quinta cellule T CD8 positive OT1 luciferasi in topi C57 neri sei albini rasati naïve in 200 microlitri di PBS mediante iniezione endovenosa nella vena della coda; 24 ore dopo, somministrare il vaccino al numero appropriato di giorni successivi alla vaccinazione.

Iniettare negli animali 150 milligrammi per chilogrammo di Lucifer dopo 10 minuti, acquisire il segnale di bioluminescenza per cinque-dieci minuti mediante un sistema di imaging su animali interi per visualizzare le cellule T OT one Lucifer CD eight positive e determinare il numero di cellule T CD eight positive specifiche per l'antigene al momento appropriato. Dopo la vaccinazione, raccogliere circa 100 microlitri di sangue dai topi vaccinati mediante la tecnica di prelievo ematico sottomandibolare in un tubo rivestito con EDTA potassico, capovolgere il tubo diverse volte per prevenire la coagulazione. Successivamente, trasferire 100 microlitri di sangue in un tubo da microcentrifuga e aggiungere un millilitro di buffer di lisi CK.

Dopo due o tre minuti, centrifugare le cellule ed eliminare il sopranatante. Lavare i PBMC rimanenti in un millilitro di tampone fax e bloccare il legame non specifico con CD16/32 come appena dimostrato. Dopo 10 minuti, dividere la sospensione cellulare in provette fax rotonde da quattro millilitri e aggiungere 20 microlitri di soluzione PE di tetramero H2-Kb secondo le specifiche del produttore a ciascun campione.

Dopo 30 minuti sul ghiaccio, aggiungere 20 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato a ciascun campione sperimentale e agli anticorpi di controllo singoli per ciascun marcatore tetramer o anticorpo fluoro quattro a ciascun campione di controllo. Infine, dopo un'ulteriore incubazione di 20 minuti, lavare tutti i campioni in buffer fax, risospendere i pellet in buffer fax integrato con DPI e analizzare i campioni mediante citometria a flusso. I CMV co-caricati con antigeni proteici fluoro quattro e coloranti lipofili fluorescenti permettono la visualizzazione in vivo del rilascio di antigeni e nanoparticelle. Ad esempio, l'immagine ottenuta mediante microscopia confocale indica che l'antigene solubile somministrato per via sottocutanea alla base della coda raggiunge i linfonodi di drenaggio entro quattro ore dall'amministrazione e viene eliminato entro 24 ore.

Al contrario, i CMV sovraccarichi sono inizialmente rilevati alla periferia dei linfonodi drenanti già a 24 ore dall'amministrazione, con un accumulo continuo che determina un ampio deposito di CMV-I-ova nel tessuto linfatico drenante. Già al quarto giorno, infatti, l'immagine bioluminescente di topi C57BL/6 sottoposti a trasferimento adottivo di cellule T CD8 positive OT1-Luciferasi nel giorno della vaccinazione mostra un livello di fondo minimo di cellule T OT1-luciferasi al quarto giorno successivo alla vaccinazione. Tuttavia, i topi immunizzati con i CMV-MPI-ova mostrano un segnale bioluminescente intenso nei linfonodi inguinali drenanti.

I topi vaccinati con ova solubile, d'altra parte, mostrano un'espansione molto ridotta delle cellule T OT one Lucifer CD8 positive nei linfonodi drenanti. Ulteriori topi immunizzati con ova solubile e MPLA, senza alcun trasferimento adottivo di cellule T specifiche per l'antigene, non mostrano un'espansione apprezzabile di cellule T CD8 positive specifiche per ova, come indicato dal monitoraggio settimanale dei PBMC. La vaccinazione con ICMV, tuttavia, induce una risposta endogena di cellule T CD8 positive significativamente più forte, raggiungendo un picco del 28% di cellule T tetramero positive specifiche per syn fecal all'interno del compartimento delle cellule T CD8 positive nei PBMC entro il giorno 41. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare nanoparticelle a base lipidica, eseguire immunizzazioni e visualizzare e quantificare l'espansione delle cellule T citotossiche in vivo.

Questi metodi possono essere ulteriormente modificati per rivelare informazioni aggiuntive sulla risposta dei linfociti T citotossici. Ad esempio, il saggio di colorazione teer può essere integrato con marcatori aggiuntivi come CD127, BCL2 e Klrg1 per valutare il fenotipo di memoria delle cellule.