Name: Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Impara la perfusione subnormotermica di fegati umani per la conservazione e il recupero funzionale dell'organo. Questa tecnica consente di valutare la vitalità epatica senza gli elevati consumi metabolici della perfusione normotermica.

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L&#39;uso di tessuti umani deve essere rivista da un comitato istituzionale (IRB) o equivalente. Il lavoro qui descritto è stato approvato e dichiarato esenti dal Massachusetts General Hospital Institutional Review Board (n 2011P001496). 1. Soluzione Preparazione <ol><li> Aggiungere asetticamente integratori per fenolo rosso-libero Williams &#39;medium E come indicato nella tabella 1. La soluzione deve essere preparato fresco prima dell&#39;uso. L&#39;insulina deve essere aggiunto al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2. Torna Tabella Preparazione del fegato <ol><li> Inserire un ciotola organo pieno di ghiaccio su una sterile superficie drappeggiato. Rimuovere il fegato dalla scatola, lasciando nel sacchetto di soluzione di conservazione a freddo. Tenere il fegato per lo più sommerso. </li><li> Identificare l&#39;arteria epatica (HA), che sarà situato distale alla patch aortica. Sezionare libera l&#39;arteria di rivelare diversi rami tagliati nel senso della lunghezza con le forbici Metzenbaum. Attenzione Dissect l&#39;intera lunghezza dell&#39;arteria per impedire recidere una nave che alimenta il fegato. Non tagliare o legare i rami che non hanno una fine visibile. </li><li> Tie off tutti i rami arteriosi non forniscono fegato con sutura di seta dimensioni che vanno da 0 a 4-0, a seconda della dimensione del vaso. Chiudi rami che sono troppo brevi per legare o fori nella arteria con un punto di 7-0 prolene. Tie e tagliare le arterie gastriche milza e di sinistra vicino alla loro origine sul tronco celiaco. </li><li> Rimuovere la patch aortica tagliando il tronco celiaco direttamente sotto la patch. Incannulare il tronco celiaco con la cannula aortica. </li><li> Identificare la vena porta (PV) e senza mezzi termini sezionarlo gratuito. Legare i rami e incannulare il fotovoltaico con il segmento preparata di dimensioni 24 tubi. </li><li> Rimuovere sezioni della membrana dalla vena cava sovraepatica, senza tagliare la vena stessa. Deflusso di fogna cavali direttamente nella camera di organo. </li><li> Cut 2 full-circonferenza ticampioni SSUE (2-3 mm di lunghezza) dalla fine del dotto biliare comune; SNAP congelare uno in azoto liquido (conservare a -80 ° C) e conservare l&#39;altra in 10% formalina tamponata, per il tessuto e l&#39;analisi istologica, rispettivamente. Incannulare il dotto biliare comune con la cannula nave e un tubo di scarico in tubolare di membrana ossigenatore. </li><li> Identificare e legare il dotto cistico con una cravatta di seta 0. Il dotto cistico si trova tra il dotto biliare comune e la cistifellea. </li><li> Collegare il tubo di colore impostato su borse di ghiaccio freddo di Ringer lattato (LR) e riempire il tubo, rimuovendo tutta l&#39;aria. </li><li> Impostare il regolatore di flusso sul tubo a filo con un filo lento. Prima di collegare il tubo filo alla cannula vena porta, occlude la vena porta con le dita al ilo e riempire la cannula e la vena con filo per rimuovere l&#39;aria dalla vena porta. Non elevare la borsa più di 20 cm sopra l&#39;altezza del fegato durante lavaggio fredda per evitare un&#39;eccessiva pressione sulvena. </li><li> Durante brevemente filo occludere il PV nel punto più basso. Esaminare il PV di perdite. Rami vaso può essere chiusa come descritto sopra. Lavare il fegato attraverso il PV con un totale di 2 L di LR ghiacciata. </li><li> Ripetere i punti 2.10, 2.11 per l&#39;HA con 1 L di LR. </li></ol> 3. Adescamento del sistema SNMP <ol><li> Prime dispositivo perfusione aggiungendo 2 L di perfusato (21 ° C) per la ciotola organo e avviare il dispositivo per riempire il tubo. Seguire le istruzioni del dispositivo di prepararsi per la perfusione, impostare la temperatura a 21 ° C. Iniziare con pressioni di 3 mmHg e 30 mmHg sul fotovoltaico e HA, rispettivamente. Aprire il serbatoio e regolato ad una portata di 3 L / min. </li><li> Prelevare un campione di sangue dal gas sia al flusso HA e PV tracciando un campione dai porti campione 0,3 ml e in esecuzione nella macchina emogasanalisi secondo le istruzioni del produttore. Conferma un&#39;adeguata ossigenazione (pO 2&gt; 700 mmHg) e pH (7,35-7,45). </li><li> Prima fegato è collegato prelevare un campione del perfusato 1,0 ml al = 0 misurazione in una provetta Eppendorf e conservare a -80 ° C. Tagliate due ± 250 biopsie cuneo mg dal fegato con una lama singola taglio di acciaio; SNAP congelare uno in azoto liquido (conservare a -80 ° C) e conservare l&#39;altra in 10% formalina tamponata. Pesare il fegato prima di perfusione. </li></ol> 4. umano Fegato Perfusion <ol><li> Trasferire il fegato al dispositivo. Collegare l&#39;afflusso PV alla cannula PV, dopo la rimozione dell&#39;aria dal PV come al punto 2.10. Collegare il HA in modo simile. Impostare PV e pressione HA a 3 e 30 mmHg. Il fegato dovrebbe essere quasi sommersa dal perfusato. Coprire tutte le superfici asciutte, compresi i vasi di afflusso, con bagnato garza sterile per prevenire la disidratazione </li><li> Lasciate che lo scarico tubo bile in un contenitore di raccolta. Assicurarsi che l&#39;apertura dello scarico bile è a livello del fegato o inferiore per consentire bile eseguire out liberamente. </li><li> Le portate di destinazione sono rispettivamente 275-325 ml / min.kg e 50-100 ml / min.kg per il fotovoltaico e HA una volta che il fegato si è riscaldata a 21 ° C. Poiché ogni fegato reagisce in modo diverso a perfusione, monitorare il flusso vicino durante i primi minuti. Aumentare o diminuire la pressione su una delle navi, se non sono raggiunte le portate di destinazione. Non superare i 50 mmHg sul HA e 5 mmHg sul fotovoltaico. </li><li> I campioni possono essere prelevati dal tessuto epatico, perfusato e bile presso la preferenza investigatori. Si consiglia come minimo il seguente regime di raccolta del campione durante la perfusione. <ol><li> Biopsie tissutali, n = 2 x 250 mg, ogni ora. Conservazione: scatto congelare uno in azoto liquido e conservare a -80 ° C a lungo termine. Inoltre, prendere un altro biopsia prima e dopo perfusione e fissare nel 10% formalina tamponata (n = 1) </li><li> Campioni perfusato, n = 2x 1 ml ogni 15 minuti per la prima ora e successivamente ogni 30 min. Disegnare campioni dalla inf PVbasso porta di campionamento. Conservazione: -80 ° C a lungo termine. </li><li> Analisi dei gas del sangue di PV e HA afflusso e deflusso vena cava. n = 3 x 0,3 ml ogni 30 min. Disegna campioni sia dal fotovoltaico e porti campione HA. Disegnare un campione dalla vena cava 0,3 ml inserendo una siringa nella vena ed eseguire direttamente nel emogasanalizzatore. Utilizzare l&#39;uscita per assicurare un&#39;adeguata ossigenazione e pH. </li><li> La produzione di bile, n = 1 x 1 ml, ogni ora. Visivamente quantificare la produzione di bile ogni ora e prendere un campione dal contenitore di raccolta. Rinnova il contenitore dopo il prelievo. Conservazione: il ghiaccio secco e -80 ° C a lungo termine. </li></ol></li><li> Continuare perfusione per 3 ore. Monitoraggio della pressione, pH e l&#39;ossigenazione e prendendo campioni in tutto. Regolare il pH che aggiungendo bicarbonato di sodio al perfusato. </li><li> Al termine della perfusione prendere campioni finali mentre il fegato viene perfuso. Scollegare il fegato e rimuovere la cannula dotto biliare. Take 2 campioni di tessuto post-perfusione deldotto biliare come descritto prima per lo stoccaggio a -80 ° C in 10% formalina tamponata. </li><li> Eliminare il fegato umano secondo le linee guida di smaltimento corretto rischio biologico. </li></ol>

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</ol>

DRS. ESSERE Uygun, K Uygun e Yarmush sono inventori su un attesa di brevetto che è rilevante per questo studio (WO / 2011/002926), e Drs. ESSERE Uygun, K Uygun e Yarmush sono inventori su un attesa di brevetto che è rilevante per questo studio (WO / 2011/35223). DRS. K Uygun e Bruinsma hanno una domanda provvisoria di brevetto relative a questo lavoro. Dr. K Uygun e BE Uygun hanno un interesse finanziario in Organo Solutions, una società focalizzata sullo sviluppo di tecnologie di conservazione degli organi. Dr. K Uygun e BE interessi Uygun sono gestite dal MGH and Partners HealthCare in conformità con il loro conflitto di interessi politiche.

Nel tentativo di recuperare fegati feriti durante ischemia abbiamo sviluppato un sistema SNMP che può essere impiegato dopo un periodo di conservazione frigorifera. Subnormothermic perfusione macchina offre una valida alternativa allo stoccaggio a freddo convenzionali, così come le modalità della macchina di perfusione ipotermia e normotermici. Esistono vari sistemi diversi; tutti offrono diversi vantaggi e svantaggi 3,9,20. SNMP permette di perfusione senza un vettore di ossigeno, come le richieste di ossigeno metaboliche a 21 ° C sono soddisfatte da ossigenazione attiva del perfusato. Anche se ridotte in condizioni subnormothermic, il metabolismo è sostanziale e richiede il supporto di una soluzione di perfusione ricco di sostanze nutritive. Soluzioni perfusione tradizionali, come la soluzione macchina perfusione Belzer, sono generalmente minima composizione e sono progettati per perfusione fredda. Williams &#39;medio E&#39; stato utilizzato come mezzo di coltura di epatociti per molti anni, e contiene componenti che sono universali per sostenere la funzione cellulare, in particolare in condizioni di caldo ex vivo. Misure effettuate durante macchina perfusione sono riflettenti della funzione dell&#39;organo. Parametri direttamente osservabili come la produzione di bile e consumo di ossigeno sono misurazioni in tempo reale che possono essere utilizzati per valutare il fegato pre-trapianto. Allo stesso modo, i marcatori di danno cellulare e ischemia (K +, il rilascio di lattato) possono essere misurati direttamente nella soluzione di perfusione e possono essere indicativi della funzione dell&#39;organo 20. Come la tecnologia della macchina di perfusione sviluppa ulteriormente e raggiunge più vasta applicazione clinica, correlazioni precise tra ex vivo la funzione e il risultato clinico possono essere fatte e parametri di perfusione saranno utili nel favorire decisioni di trapiantare o respingere fegati marginali qualità. Inoltre, come punto di assistenza strumenti analitici anticipo, un&#39;analisi più sofisticata sarà disponibile direttamente in macchina perfusione 21. In questo lavoro abbiamo dimostrato che i fegati possono essere supportati nel sistema SNMP con lesioni minime al fegato, riflessa da istologia e il rilascio di ALT. Il recupero funzionale del fegato è meglio riflessa da ATP, che ha dimostrato di correlare la redditività fegato ed è fortemente indicativi del successo del trapianto in modelli animali 22. Ex vivo e recupero pre-trapianto di fegati consentirebbe una significativa espansione del donatore piscina fegato, correggere la disparità tra domanda e offerta di fegati donatori nel trapianto.

Il trapianto di fegato è l&#39;unico trattamento curativo per decine di migliaia di pazienti che soffrono di malattia epatica allo stadio terminale. Per facilitare il trapianto successo, conservazione ottimale del fegato dal momento in cui viene procurato dal donatore fino al momento in cui viene impiantato nel ricevente è necessaria per evitare un rapido deterioramento del trapianto. L&#39;attuale standard per la conservazione del fegato è chiamato &#39;frigoconservazione static&#39;: il fegato viene raffreddato in una soluzione di conservazione ghiacciata, riducendo così il metabolismo del fegato e rallentare gli effetti deleteri di ischemia. Sebbene questa tecnica di stoccaggio a freddo ha permesso per il trapianto di successo, gli organi di qualità marginale, come organi DCD danneggiati da ischemia calda o steatosi spettacolo paziente inferiore esiti 1. C&#39;è un corpo in rapida espansione di prove che ex vivo macchina perfusione di fegati come modalità di conservazione alternativo può potenzialmente imdimostrare i risultati per questi organi marginali 2,3. Il trapianto di fegato è diventato una vittima del suo stesso successo. Far più pazienti sono indicati per il trapianto di fegati sono disponibili, e di morire in lista d&#39;attesa negli Stati Uniti ogni anno. Data la realtà della scarsità fegato del donatore e il crescente utilizzo di fegati di qualità non ottimale per i destinatari bisognosi, è opinione diffusa che ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato prima dell&#39;impianto mantiene la promessa di un cambiamento di paradigma nel trapianto di fegato. C&#39;è stato un notevole aumento di interesse della ricerca in questo tema negli ultimi anni 4-8. In diversi centri europei e nordamericani macchina ipotermico perfusione ha fatto una clinica introduzione 8 e normotermica macchina perfusione a temperature fisiologiche è stata recentemente applicata al fegato umano scartati e viene tradotto in uso clinico e 9.Ampia sviluppo ha portato allo sviluppo di diversi protocolli, mentre l&#39;ottimizzazione continua identifica i parametri della perfusione ottimale 10-12. L&#39;uso di innesti marginale qualità è aumentato più di 10 volte negli ultimi dieci anni 13. Quando confrontato con l&#39;attuale standard per la conservazione del fegato (celle frigorifere statiche), ex vivo macchina di perfusione offre numerosi vantaggi potenziali, i quali si traducono in tanto necessaria espansione della piscina organo e potenzialmente diminuire l&#39;incidenza di complicanze post-trapianto. In particolare, le complicazioni biliari che attualmente affliggono fegati non ottimale di qualità dopo il trapianto rimangono una questione sostanziale 14-18. Macchina perfusione a condizioni subnormothermic fornisce una finestra di tempo per valutare la funzione del trapianto oggettivamente per idoneità al trapianto 19. Mentre il fegato viene perfuso in un circuito ex vivo, sia il perfusato unnd la bile prodotta durante la perfusione può essere campionato per la misurazione dei marker della funzione dell&#39;organo. In questo modo &#39;gravemente compromesse&#39; fegati che vengono scartati per il trapianto in base ai criteri attuali possono essere oggettivamente valutati in merito alla loro idoneità per il trapianto. Valutazione della vitalità economica potenzialmente permette per molti di questi organi da utilizzare per il trapianto. Un altrettanto potente beneficio della macchina perfusione è la riparazione e il miglioramento della fegati che sono stati danneggiati da caldo / freddo ischemia. ATP è esaurito molto rapidamente durante ischemia fredda calda e successiva e può essere repleted durante un periodo di macchina di perfusione prima dell&#39;impianto del fegato 20. Il fegato, con le sue riserve di energia e lo stato metabolico rifornito, è condizionato e meglio preparati per gli effetti pregiudizievoli del danno da riperfusione dopo l&#39;impianto nel ricevente. Questo lavoro descrive un metodo ex vivo macchina perfusione del fegato umano grafts in laboratorio, che saranno utili per i ricercatori che vogliono studiare sia la tecnica e effetti benefici della macchina perfusione ex vivo. Noi facciamo uso di fegati donatori umani che sono state diminuite per il trapianto e sono quindi destinati a fini di ricerca. Standard tecnica appalti fegato comporta in filo arteriosa situ del fegato dopo clampaggio aortico in donatori morti cerebrali (DBD) o dopo l&#39;arresto circolatorio in donatori circolatori morte (DCD), descritti in dettaglio altrove 20. Inoltre, il fegato è raffreddato durante il prelievo riempiendo cavità addominale del donatore con ghiaccio. Preferenze soluzione Flush variano tra le regioni, con la maggior parte degli appalti con l&#39;Università del Wisconsin o soluzione istidina-triptofano-chetoglutarato (HTK). Un ulteriore back-tavolo a filo della vena porta migliora la washout di sangue residuo. Livers sono spesso acquistati lasciando un sur segmento aorticoarrotondando il tronco celiaco. La colecisti è incisa, la bile viene aspirato, e il dotto biliare viene svuotata. I fegati sono confezionati in sacchetti sterili contenenti soluzione di conservazione ghiacciata e trasportati in scatole o refrigeratori designati. Per risultati rappresentativi tempo di ischemia calda e fredda dovrebbe essere limitato a 60 min e 12 ore, rispettivamente. Nonostante lo screening sierologico di routine per gli agenti patogeni trasmissibili, precauzioni standard devono essere prelevati al momento della consegna di organi umani, campioni ottenuti da organi umani, e tutti i prodotti di scarto. Il protocollo qui descritto perfusione macchina subnormothermic utilizzando un dispositivo di perfusione del fegato in commercio. L&#39;uso di un tale dispositivo permette di traduzione più rapida l&#39;impostazione clinica e cross-validazione di diversi protocolli e le impostazioni del dispositivo tra i gruppi di ricerca e centri di trapianto.

<table><tbody><tr><td>Dispositivo di perfusione Liver Assist</td><td>Organ Assist B.V.</td><td>Liver Assist</td><td></td></tr><tr><td>Set monouso Liver Assist Organ</td><td>Assist B.V.</td><td>Liver Assist monouso</td><td></td></tr><tr><td>Williams' Medio E Sigma</td><td></td><td>W1878&ndash; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina 5.000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>MGH farmacia</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di gas Carbogen 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore per gas speciali</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Ringer lattato' s soluzione</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina tamponata neutra</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Adson dentate</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti Debakey, 7,75", 2,25 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Metzenbaum 7" Curvo SureCut Tungsteno</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Porta aghi 5.5&ndash; 7 pollici</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 suture di seta intrecciate nere</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura in nylon, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per l'analisi dei gas ematici</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>Scatola di visualizzazione della pressione</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>Set di display di pressione monouso</td><td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr><tr><td>Termometro a termocoppia portatile e sonda</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-91500-04 e EW-08516-55</td><td></td></tr><tr><td>Cannula per recipienti con punta di ghianda, 4 mm</td><td>Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr><tr><td>Set di irrigazione tubo di risciacquo</td><td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr><tr><td>Ciotola di miscelazione, 4 L</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

umana funzionale fegato conservazione e recupero mediante subnormothermic macchina di perfusione

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

Attualmente c'è una grave carenza di innesti epatici disponibili per il trapianto. Sono necessarie nuove tecniche di conservazione degli organi per espandere il pool di fegati dei donatori. La perfusione meccanica degli innesti di fegato del donatore è un'alternativa alla tradizionale conservazione a freddo del fegato ed è molto promettente come modalità per espandere il pool di organi del donatore. Abbiamo recentemente descritto il potenziale beneficio della perfusione meccanica subnormotermica dei fegati umani. I fegati perfusi meccanicamente hanno mostrato un miglioramento della funzione e il ripristino dei livelli tissutali di ATP. Inoltre, la perfusione meccanica di innesti epatici a temperature subnormotermiche consente una valutazione obiettiva della funzionalità e dell'idoneità di un fegato per il trapianto. In questo modo un gran numero di fegati che in precedenza erano stati scartati a causa della loro qualità non ottimale possono essere salvati attraverso gli effetti riparatori della perfusione meccanica e utilizzati per il trapianto. Qui descriviamo in dettaglio questa tecnica di perfusione meccanica subnormotermica. Gli innesti di fegato umano assegnati alla ricerca vengono perfusi attraverso l'arteria epatica e la vena porta con un perfusato ossigenato acellulare a 21 °C.

Un certo numero di osservazioni e analisi può essere eseguita sul fegato durante la perfusione, comprese osservazioni dirette in tempo reale, quali portate e produzione di bile; misurazioni in tempo reale, come l&#39;analisi dei gas del perfusato, e le misure post-hoc che sono fatti dopo la raccolta del campione compresa l&#39;analisi biochimica del perfusato e tessuti e l&#39;analisi istologica. I risultati qui menzionati sono da 22 perfuso fegato umano. I fegati sono state respinte per il trapianto per vari motivi, tra cui l&#39;età del donatore, eccessivo tempo di ischemia calda, risultati della biopsia (steatosi, infiammazione, fibrosi) e per motivi logistici. 18 fegati sono stati acquistati dopo la morte cardiaca, e 4 dopo la morte cerebrale. In entrambi i casi, i donatori sono stati pretrattati con 30.000 unità di eparina e lavati in situ e la tabella indietro con la soluzione UW. Il tempo medio di ischemia fredda era 531 ± 237 (SD) min e il tempo di ischemia calda media era 27 ± 10 (SD) min, misurata dal ritiro di vitasupporto a filo freddo. Osservazioni tempo reale e misurazioni possono essere utilizzati per valutare fegato durante la perfusione, mentre misurazioni post-hoc vengono rivelate dopo la perfusione. Aggiornamento in tempo reale Flusso attraverso il fegato inizia inferiore le portate di destinazione, come risultato di una maggiore resistenza nel fegato freddo. Utilizzando una pressione di 3 mmHg sul PV e 30 mmHg in HA flussi destinazione possono generalmente essere raggiunto quando gli fegato è scaldato fino a 21 &#160; ° C dopo 60 min di perfusione (Figura 1A). Il flusso di bile può essere generalmente rispettato entro 10 min di perfusione ed è prodotto costantemente durante la perfusione (Figura 1B). Bile quantità dipende dalla qualità del fegato e varia da 0,3 ml / h / kg di fegato a 18 ml / min / kg. In fegatini con più tempo di ischemia calda, il flusso biliare tenderà a diminuire, mentre brevi calde risultati in tempo ischemici in un più stabile o addirittura in aumentola produzione di bile. Misurazioni in tempo reale Misura diretta e frequente del perfusato mediante analisi dei gas del sangue in essenziale sia per scopi sperimentali e mantenere condizioni di perfusione adeguate, soprattutto ossigenazione e pH. Disciolto pressione parziale di ossigeno dovrebbe essere maggiore di 700 mmHg sull&#39;afflusso sia del PV e HA. Pressione di ossigeno Outflow, misurata nella vena cava, generalmente diminuisce con perfusione più, riflettendo un consumo di ossigeno crescente. Tassi di assorbimento di ossigeno possono essere calcolate come descritto in precedenza 13 e variava 0,5-2,2 ml O 2 / min / kg all&#39;inizio della perfusione di 2,4-9,7 ml O 2 / min / kg a t = 3 ore (Figura 1C). Una goccia del pH si osserva nei primi 30 min (Figura 1D), principalmente per effetto del rilascio di lattato nel perfusato. Questo può essere sostenuto da supplementazione con 8,4% di sodio bicarbonate e dopo circa 90 minuti il ​​pH ricade nel range di normalità. Comunemente, 30-50 ml di 8,4% di bicarbonato di sodio è richiesto. Concentrazione aumenta rapidamente lattato nel primo 15-30 min, ma comincia a decesso dopo la prima ora (Figura 1E). Misurazioni post-hoc Transaminasi epatiche, come ALT possono essere misurate nel perfusato. Nei primi 30 minuti un grande aumento di ALT è generalmente osservato che riflette il dilavamento di ALT che è stato rilasciato durante ischemia (Figura 1F). ALT ha dimostrato di correlare bene con il caldo tempo ischemico 13. Perfusione macchina aumentato contenuto di ATP 2,8 volte, riflettendo lo stato di energia di recupero (Figura 1G). H &amp; E l&#39;analisi istologica rivela alcun pregiudizio addizionale subito durante macchina di perfusione (Figura 1H, I). Va notato che il regime biopsia proposto in questo protocollo è per resfinalità earch e non possono essere applicabili per scopi clinici. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> Figura 1:. La valutazione di fegati umani durante macchina perfusione flusso attraverso il fotovoltaico e HA durante SNMP (A), la produzione di bile, quantificato per ora di perfusione (B), l&#39;ossigeno tasso uprate (OUR), calcolata in base alla differenza di afflusso (PV + HA) e deflusso (vena cava), interrotte le linee mostrano pressioni parziali di ossigeno nel in- e deflusso durante perfusione (C), pH e del lattato durante perfusione (D, E), rilascio di ALT nel perfusato (F), ATP contenuto misurata nel tessuto da biopsie orarie (G) e H &amp; E macchie di fegato (54 anni DCD, 19 min ischemia calda, 559 min ischemia fredda) prima (H) e dopo (I) perfusione. I risultati sono presentati come media ± SEM. <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Descriviamo un metodo di ex vivo macchina perfusione di innesti di fegato umano a temperatura subnormothermic (21 ° C).

Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una macchina termica subnormale, una perfusione del fegato umano ai fini della conservazione, del recupero e della valutazione dell'organo. In un contesto di ricerca preclinica, ciò si ottiene innanzitutto preparando il fegato per il collegamento al dispositivo. Nel secondo passaggio, il sistema di perfusione viene preparato, il fegato viene collegato e, nell'ultimo passaggio, la perfusione viene avviata.Il fegato perfuso meccanicamente diventerà funzionalmente attivo a uno stato termico subnormale e produrrà bile. In definitiva, i campioni raccolti dal fegato durante la perfusione possono essere analizzati per studiare il recupero metabolico e la funzionalità dell'organo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi di conservazione esistenti, come la perfusione fredda e la perfusione termica normale, è che la perfusione meccanica termica subnormale consente il recupero funzionale e la valutazione della vitalità del fegato, senza dover soddisfare le elevate richieste metaboliche della perfusione a temperatura corporea.Molti aspetti di questa tecnica richiedono esperienza o una dimostrazione per essere eseguiti con successo. Ad esempio, la dimostrazione della preparazione al tavolo posteriore del fegato, che comprende la dissezione dell'arteria, della vena e del dotto biliare, può essere utile per ricercatori privi di formazione chirurgica precedente. Dopo aver ricevuto il fegato, posizionare una bacinella per organi riempita di ghiaccio su una superficie sterile coperta con un telo e rimuovere il fegato dalla scatola di trasporto, lasciandolo per la maggior parte immerso nel sacco contenente la soluzione di conservazione fredda. Successivamente, utilizzare forbici Metzenbaum per evidenziare i diversi rami del sistema arterioso che irrora il fegato, dall'aorta all'arteria epatica propria.Quindi dissezionare con attenzione il resto dell'arteria per evitare di recidere i vasi che irriganano il fegato, senza tagliare o legare i rami che non presentano un'estremit&agrave; visibile. Una volta isolata l'arteria, utilizzare punti di sutura in seta di calibro da zero a quattro zero per legare tutti i rami arteriosi che non irriganano il fegato. Legare e recidere le arterie splenica e gastrica il pi&ugrave; vicino possibile alla loro origine sul tronco celiaco.Tagliare una porzione di aorta intorno al tronco celiaco. Quindi utilizzare una cannula per perfusione arteriosa per cannuolare il tronco celiaco. Ora dissezionare liberamente la vena porta, legando eventuali rami collaterali o suturando eventuali fori nella vena, e cannuolarla con una cannula per perfusione della vena porta.Rimuovere sezioni del diaframma dalla vena cava sopraepatica senza recidere la vena stessa. Quindi praticare due campioni di tessuto di due-tre millimetri di lunghezza e circonferenza completa dall'estremità del dotto biliare comune. I campioni devono essere maneggiati con delicatezza.Congelare rapidamente un campione in azoto liquido per la conservazione a meno 80 gradi Celsius e conservare l'altro in formalina al 10% tampone. Quindi, cannuccolare il dotto biliare comune con una cannula vascolare e collegare un tubo di drenaggio realizzato con tubo di piccolo diametro. Successivamente, legare il dotto cistico con un legaccio di seta zero.Collegare il set di tubi per il lavaggio a sacche di soluzione di Ringer lattato ghiacciata e primeare i tubi per rimuovere l'aria. Impostare il regolatore di flusso del tubo di lavaggio su un flusso lento e occludere la vena porta a livello del peduncolo per eliminare qualsiasi aria presente nel vaso. Riempire ora la cannula nella vena con la soluzione di lavaggio per rimuovere l'aria dalla vena porta, avendo cura di non sollevare la sacca a più di 20 centimetri sopra l'altezza del fegato per evitare una pressione eccessiva sulla vena.Quindi lavare il fegato con un totale di due litri di soluzione fredda di Ringer lattato ICEC. Durante il lavaggio, occludere brevemente la vena porta nel punto più basso per verificare la presenza di perdite, quindi ripetere il lavaggio per l'arteria epatica con un litro di soluzione come appena dimostrato. Mentre il fegato viene lavato, preparare il sistema di perfusione aggiungendo due litri di soluzione profusa otto a temperatura ambiente nella bacinella per organi e avviare il dispositivo per preparare i tubi. Impostare la temperatura a 21 gradi Celsius.Quindi impostare una pressione di tre millimetri di mercurio sulla vena porta e di 30 millimetri di mercurio sull'arteria epatica. Aprire la bombola di gas carbogeno e regolarla su un flusso di tre litri al minuto. Successivamente, prelevare un campione di gas del sangue dai porti di campionamento dell'afflusso della vena porta e dell'arteria epatica ed eseguire l'analisi nei campionatori di gas ematici seguendo le istruzioni del produttore per confermare un'adeguata ossigenazione e pH.Utilizzare bicarbonato di sodio o acido cloridrico per correggere il pH, se necessario. Successivamente, prima che il fegato venga collegato, raccogliere un campione di un millilitro della perfusione come misurazione al tempo zero e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. In questo momento, utilizzare una lama d'acciaio a tagliente singolo per prelevare due biopsie a cuneo di circa 250 milligrammi ciascuna dal fegato.Congelare rapidamente un campione in azoto liquido per il successivo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e fissare l'altro campione in formalina al 10% tampone. Prima di iniziare la perfusione, pesare il fegato, quindi trasferire l'organo nella camera dell'apparecchio e rimuovere l'aria dalle cannule. Come appena dimostrato.Una volta inserite le cannule, collegare gli afflussi della vena porta e dell'arteria epatica alle rispettive cannule. Iniziare la perfusione assicurandosi che il fegato sia completamente immerso nel perfusato, coprendo con garza sterile bagnata eventuali superfici asciutte, inclusi i vasi di afflusso. Per prevenire la disidratazione, lasciare che il tubo della bile dreni in un contenitore di raccolta.Assicurarsi che l'apertura del drenaggio della bile sia a livello del fegato o più in basso, in modo da permettere al flusso biliare di scorrere liberamente. Una volta che il fegato ha raggiunto la temperatura di 21 gradi Celsius, impostare le portate rispettivamente a 275-325 e 50-100 millilitri al minuto per chilogrammo per la vena porta e l'arteria epatica. Durante la perfusione, prelevare campioni dal tessuto epatico perfuso e dalla bile, secondo necessità.Proseguire la perfusione per tre ore, monitorando la pressione, il pH e l'ossigenazione e aggiustando il pH con bicarbonato di sodio secondo necessità. Al termine della perfusione, raccogliere i campioni finali, scollegare il fegato e rimuovere la cannula del dotto biliare. Infine, raccogliere due campioni di tessuto post-perfusione del dotto biliare come appena dimostrato e scartare il fegato umano.Seguire le corrette linee guida per lo smaltimento dei rifiuti biologici. Il flusso inizia basso a causa di una maggiore resistenza nel fegato freddo, utilizzando una pressione di tre millimetri di mercurio sulla vena porta e di 30 millimetri di mercurio sull'arteria epatica. Le portate target possono generalmente essere raggiunte una volta che il fegato si è riscaldato fino a 21 gradi Celsius dopo 60 minuti di perfusione; la misurazione frequente del perfusato mediante analisi dei gas del sangue è essenziale sia per scopi sperimentali sia per mantenere condizioni di perfusione adeguate.Ad esempio, la pressione parziale di ossigeno disciolto dovrebbe essere superiore a 700 millimetri di mercurio in entrata sia nella vena porta che nell'arteria epatica. Al contrario, la pressione di ossigeno in uscita misurata nella vena cava dovrebbe generalmente diminuire con una perfusione più lunga, riflettendo un aumento dell'assorbimento di ossigeno. Anche le transaminasi epatiche possono essere misurate nel PERFU otto, ad esempio.Un aumento dell'alanina, della transaminasi o della a LT viene generalmente osservato nei primi 30 minuti della perfusione, con un ulteriore lieve incremento durante il resto della perfusione. Un'ulteriore valutazione della produzione di a TP nel fegato sottoposto a perfusione meccanica rivela un aumento di 2,8 volte del contenuto epatico di a TP, indicativo di un recupero dello stato energetico. Inoltre, l'analisi istologica ematossilina ed eosina non rivela ulteriori lesioni insorte durante la procedura.Seguendo questa procedura è possibile effettuare un'analisi approfondita del fegato isolato, ottenendo informazioni uniche sulla fisiologia e patologia epatica. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come mantenere un fegato umano durante la perfusione meccanica suberica per facilitare la valutazione della sua funzionalità al di fuori del corpo.

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Innesti marginali, come fegati grassi, innesti da donatori di età superiore o fegati prelevati dopo la morte cardiaca (DCD) tollerano stoccaggio statico convenzionale, freddo solo male. Abbiamo sviluppato un nuovo modello di subnormothermic ex vivo perfusione epatica per la conservazione, la valutazione, e la riparazione di fegati marginali prima del trapianto.

Tecnica di Subnormothermic<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fegato perfusione per la Conservazione, valutazione e riparazione dei marginali fegato innesti

Qui vi presentiamo un protocollo che descrive ossigenato ex situ macchina di perfusione di fegati donatore. Questo articolo contiene un passo per passo protocollo di procurarsi e preparare il trapianto di fegato per la macchina di perfusione, preparare il liquido di perfusione, primo la macchina di perfusione ed eseguire ossigenato normotermica macchina perfusione del trapianto di fegato.

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

C'è una carenza significativa donatore di fegato, e i criteri per i donatori di fegato sono stati ampliati. Perfusione normotermica ex vivo del fegato (NEVLP) è stato sviluppato per valutare e modificare la funzione dell'organo. Questo studio dimostra un modello del ratto di NEVLP e verifica la capacità di pegylated-catalasi, per attenuare la lesione di conservazione del fegato.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

Il modello suino di perfusione meccanica normotermica epatica (NMP), qui descritto, può essere utilizzato con successo per studiare l'NMP come strategia di conservazione, strumento per la valutazione della vitalità e piattaforma per la riparazione d'organo. Ha un alto valore traslazionale, tuttavia è tecnicamente impegnativo e laborioso.

Perfusione epatica isolata normotermica suina

È stato creato un sistema di perfusione epatica normotermica ex vivo (NEVLP) per i fegati di topo. Questo sistema richiede esperienza in microchirurgia, ma consente risultati di perfusione riproducibili. La capacità di utilizzare fegati di topo facilita lo studio dei percorsi molecolari per identificare nuovi additivi perfufulati e consente l'esecuzione di esperimenti incentrati sulla riparazione degli organi.

Perfusione della macchina epatica Normothermic Ex Vivo nel topo

Questo protocollo delinea la metodologia per stabilire un modello suino che utilizza la perfusione meccanica (MP) a temperatura variabile e controllata per la conservazione del fegato del donatore, seguita dal trapianto di fegato ortotopico (OLTx). Mira a promuovere il tasso di successo di OLTx utilizzando la donazione di donatori dopo la morte circolatoria (DCD) del fegato e stabilire un modello stabile.

Conservazione della donazione suina dopo morte circolatoria (DCD) Fegato mediante perfusione e trapianto ortotopico di fegato

Qui, presentiamo un protocollo per un sistema di perfusione normotermico ex vivo open source e modificabile, progettato per superare l'alto costo e la limitata flessibilità delle piattaforme esistenti, consentendo un uso più accessibile, economico e iterativo nella ricerca biomedica preclinica.

Un sistema di perfusione normotermica open-source progettato per i ricercatori

Lo scopo è quello di presentare un nuovo metodo, respirazione-controllo stimolazione elettrica (BreEStim) per il trattamento del dolore neuropatico e spasticità.

Respirazione controllata stimolazione elettrica (BreEStim) per la gestione del dolore neuropatico e spasticità

I meccanismi che portano allo sviluppo di iperplasia intimale (IH) e il fallimento del trapianto vena sono ancora poco conosciuti. Questo studio descrive un sistema ex vivo di perfusione vene umane sotto flusso e pressione controllata. Inoltre l'efficienza di rinforzo maglia esterna per limitare lo sviluppo di IH è stata valutata.

Procedura per la safena umane Veins Ex Vivo Perfusione e rinforzo esterno

Qui, presentiamo un protocollo su come eseguire una perfusione epatica isolata (IHP) con melfalan e discutiamo anche l'IHP come opzione di trattamento per le metastasi epatiche del melanoma uveale.

Isolata epatica perfusione come Trattamento di metastasi epatiche di melanoma uveale

Impara la perfusione subnormotermica di fegati umani per la conservazione e il recupero funzionale dell'organo. Questa tecnica consente di valutare la vitalità epatica senza gli elevati consumi metabolici della perfusione normotermica.

Umana Funzionale Fegato Conservazione e recupero mediante Subnormothermic macchina di perfusione

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