Name: Una tecnica di arricchimento Ottimizzato per lisolamento di Arthrobacter Batteriofago Specie campione di terreno Isolati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: Scopri un protocollo di arricchimento ottimizzato per isolare batteriofagi di Arthrobacter da campioni di terreno. Questo metodo garantisce risultati rapidi e riproducibili per la ricerca in virologia.

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I finanziamenti per lo sviluppo di questo protocollo è stato fornito dal Consorzio Pennsylvania sud-est per l&#39;istruzione superiore e il Dipartimento di Scienze Cabrini College. Il finanziamento e il sostegno aggiuntivo provenivano da Arcadia University e Immacolata University. Abbiamo particolarmente Ringraziamo il Dr. Karen Snetselaar al St. Joseph University per prendere gentilmente le immagini al microscopio elettronico dei nostri fagi isolati. Ulteriore supporto è stato fornito dai Cacciatori Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance fagi Advancing Genomica e Evolutionary Science programma (SEA-fagi).

1. Preparazione di cellule Arthobacter per Phage Isolation <ul><li> Cultura Arthrobacter sp. KY3901 colonie striati su Luria Bertaini (LB) piastra agar incubata a 30 ° C per 2-3 giorni. Scegli una colonia e utilizzare un&#39;ansa sterile per aggiungerlo a 250 ml di brodo LB in un pallone di coltura sconcertato e incubare in un incubatore agitazione a 225 rpm a 30 ° C. </li><li> Lasciare circa 24 ore di crescita per ottenere cellule in fase esponenziale fine / inizio stazionarie per esperimenti di infezione fagi. Monitorare lo stato di crescita batterica strettamente per evitare che le cellule di entrare nel centro di stato di crescita stazionaria tardiva. NOTA: la crescita delle cellule deve essere composto da un OD densità ottica di 600 tra 0,5 .0.7 per le procedure di isolamento fago e purificazione / passaggi di seguito descritti. </li></ul> 2. Raccolta dei fagi da campioni di suolo <ol><li> Raccogliere 200-400 g di suolo da posizione desiderata. Nota: Poiché i batteri nel Arthrobagenere CTER sono batteri del suolo comuni che e fagi che li infettano possono trovare in e sono presenti in quasi tutti i tipi di terreno. </li><li> Aggiungere almeno 400 ml di Phage Buffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5)] al terreno e miscelare in un matraccio abbastanza grande in modo che almeno 200 ml di PB è nel surnatante ed è in grado di essere estratto. </li><li> Mescolare agitando o agitando delicatamente fino a quando il terreno è sospeso e lasciare il sedimento terreno di stabilirsi, di solito 30 min. </li><li> Passare il &quot;estratto terreno&quot; su carta da filtro per filtrazione a gravità per rimuovere i detriti detriti sedimenti. </li><li> Aggiungere la polvere LB e miscelare per ottenere una soluzione al 2% (4 g LB polvere in 200 ml di estratto suolo). </li><li> Far passare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 micron per filtrazione sotto vuoto per ottenere un filtrato sterile. Se possibile, passare alla fase 2.7 immediatamente. Se del caso, conservare i campioni filtrati a 4 ° C per una settimana prima di procedere, tuttavia, il numero di particelle fagiche vitalisarà ridotto. </li><li> Aliquota più 50 ml di miscela di estratto LB / terreno filtro sterilizzato in singole da 250 ml sterile agitando cultura palloni sconcertato utilizzando tecniche asettiche. Aggiungere sterile M CaCl soluzione 2.0 2 alle concentrazioni finali desiderati (0-50 mm) in quanto diversi fagi Arthrobacter crescono in modo ottimale in diverse CaCl 2 condizioni. NOTA: Troviamo che la maggioranza dei fagi Arthrobacter individuati da noi sono all&#39;interno della gamma di 1 mM-2.5 mM CaCl 2. Tuttavia, molti dei fagi isolati cresciuto da noi esclusivamente a 0 mM CaCl 2 .o ad altissima CaCl 2 concentrazioni. Procedere immediatamente al punto 3.1. </li></ol> 3. Phage isolamento <ol><li> Aggiungere 1 e 2,5 ml di ritardo esponenziale / inizio stazionaria coltura batterica di fase a ciascuno dei flaconi. Per un OD 600 0,5-0,7, utilizzare 1 ml di cellule. Per una OD 600 superiore un OD di 0,7 utilizzare 2,5 ml dicellule. NOTA: Le cellule in fase di crescita esponenziale in genere producono più fagi e titoli superiori rispetto alle cellule in crescita fase stazionaria. </li><li> Agitare beute a 250 rpm a 30 ° C per circa 24 ore in un incubatore agitazione. </li><li> Dopo un periodo di incubazione 24 ore rimuovere fiaschi di arricchimento dal termostato scuotimento e diluire i campioni di arricchimento di dieci volte in tampone fago. </li><li> Istituito tubi di coltura con 0,5 ml di ritardo esponenziale / inizio stazionario coltura batterica di fase e aggiungere diverse quantità di coltura di arricchimento (5 ml a 500 ml di una diluizione 10 -1 in PB) ai tubi di coltura. NOTA: Si consiglia di testare una vasta gamma di concentrazioni dal momento che ogni campione di suolo genera diversi titoli fagi dopo arricchimento. </li><li> Aggiungere CaCl 2 per provette di coltura per effettuare una concentrazione finale pari alla concentrazione presente nel pallone arricchimento originale. Utilizzare una gamma di CaCl 2 concentrazioni di selezionare per molti fagi wesima variabile CaCl 2 dipendenze. NOTA: La maggior parte dei fagi saranno isolati all&#39;interno della gamma CaCl 2 di 1-2,5 mm, ma ci sono fagi isolati più in modo ottimale ovunque 0-50 mM CaCl 2 concentrazioni. Per questo motivo è meglio controllare una gamma di CaCl 2 concentrazioni per massimizzare il numero di unici isolati fagi Arthrobacter. </li><li> Mescolare 4,5 ml di LB top agar nel tubo cultura e versare il composto su una piastra di agar LB. Agitare delicatamente per distribuire attraverso la piastra in modo uniforme e consentire top agar a solidificare per circa 15 min. NOTA: Top agar può essere preparato in lotti più grandi (250 ml) e top agar extra può essere conservato a temperatura ambiente e riutilizzato per successivi esperimenti per almeno due settimane. Anche se ci sono diverse formule utilizzate per fare top agar, facciamo top agar utilizzando 7g / L di agar mescolato con LB. Inserire superiore agar in un bagno di acqua 60 ° C per mantenere allo stato liquido durante il corso di un esperimento. </li><li> Inverti tegli piastra e incubare a temperatura desiderata (temperatura di 30 ° C) O / N a 48 hr. Vary queste condizioni per ottimizzare i fagi attuali. Fagi più isolati provengono da piastre incubate a 30 ° C a 1-2.5 CaCl 2 mM concentrazione dopo una incubazione di 24 ore. </li></ol> 4. Phage Purificazione <ol><li> Dopo un controllo di incubazione 24 ore per la formazione della placca sui piatti. Continuare l&#39;incubazione per un massimo di 72 ore se non placche sono evidenti o per determinare se appariranno targhe supplementari. Se necessario, le piastre negozio con targhe putativi per un massimo di una settimana a 4 ° C prima di procedere. NOTA: Non è raro trovare una varietà di differenti morfologie placca su una piastra. Trovare placche dopo 3 giorni di incubazione è possibile ma rara. </li><li> Purificare fagi desiderati da placche chiaramente isolati con il metodo striscia targa. Toccare una targa con un bastone di legno sterile. Streak la targa eseguendo un bastone di legno con una fiamma, allowing bastone raffreddare brevemente, e poi strofinando il bastone sulla piastra di agar nel moto dolce come mostrato in Figura 1. Ripetere questo utilizzando uno scovolo per ogni passaggio. </li><li> In alternativa, utilizzare il tradizionale saggio di placca titolo di isolare i singoli placche fagi. Il saggio di placca titolo richiede l&#39;uso di più reattivi come LB agar LB e superiore agar e materiali come piastre Petri per l&#39;isolamento fago placca. Abbiamo avuto un grande successo con il metodo striscia targa ma è tecnicamente più facile isolare singole placche utilizzando il saggio di placca titolo. </li><li> Una volta che la piastra di agar LB è striata almeno tre volte, segnare l&#39;area con la più bassa concentrazione di particelle fagiche putativi e delicatamente applicano 0,5 ml di Arthrobacter e 4,5 ml di LB agar fuso superiore (contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio come la piastra madre ) e permettono di diffondere in modo uniforme in tutto il piatto. </li><li> Capovolgere e incubare piastra O / N. Ripetere la targa strisciatecnica per almeno tre iterazioni per assicurare una specie fagi puri è isolato. Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di una settimana, se necessario tra strisce senza una significativa perdita di redditività fago. </li><li> Placche volta desiderati sono stati coltivati ​​e isolato sul piatto striscia finale, toccare uno ben isolato targa con una punta micropipetta e risospendere in 100 microlitri PB. Serialmente diluire questa soluzione 10 0 fuori della diluizione 10 -8 passando 20 microlitri del campione in 180 ml ​​di PB fresco. </li><li> Aggiungere 10 ml di ciascuna diluizione di 0,5 ml di Arthrobacter cresciuto in una provetta per 5 a 10 min a temperatura ambiente e la piastra mescolando i batteri infettati con 4,5 ml di LB agar fuso superiore contenente la stessa concentrazione di CaCl 2 utilizzati per isolare il fago dal campione originale suolo. Salvare tutte le diluizioni effettuate a 4 ° C fino al giorno successivo. </li><li> Determinare la diluizione in serie fago necessario per fare un modello web utilizzando il tradizionale titolo placcadire. Lo scopo del saggio di placca titolo è determinare il titolo fago necessario per ottenere una placca modello web. Identificare un modello piastra tela come in gran parte privi di batteri, ma contenente resti di batteri che non sono ancora stati lisati per fagi. Aggiungere 5 ml di cultura Arthrobacter stazionario esponenziale / inizio tardi per un 50 ml pallone di coltura sterile. <ol><li> Aggiungere 100 ml di diluizione (che ha dato un modello web alla cultura Arthrobacter) nel pallone di coltura e permettono fagi di infettare le cellule batteriche per 5 a 10 minuti a RT. Mescolare con fusa superiore agar LB contenente la stessa concentrazione di CaCl 2 come utilizzato per identificare inizialmente fago e piastra 5 ml di questa miscela su 10 piastre LB fresco. Lasciar solidificare ed incubare le piastre capovolte a 30 ° C. </li></ol></li><li> Il giorno successivo, inondare le placche modello web con 5 ml di PB e negozio O / N a 4 ° C o 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Filtrare il lisato fago attraverso un filtro siringa da 0,22 microne conservare a 4 ° C. Utilizzare questo fago magazzino finale per ulteriori esperimenti come le immagini di microscopia elettronica di particelle dei fagi, fago isolamento DNA genomico per l&#39;analisi di restrizione del DNA enzima e il sequenziamento genomico utilizzando le procedure standard. Per la conservazione a lungo termine del fago magazzino, aggiungere una quantità uguale di lisato fago di glicerolo sterile in piccole fiale per azione archiviazione a -80 ° C. NOTA: Per chi non sperimentato con queste tecniche fagi, una grande risorsa è il sito online www.phagesdb.org accessibili. </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli">http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli</a> (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Nonostante i molti precedenti tentativi di isolare i fagi in grado di infettare gli host Arthrobacter, abbiamo avuto poco successo utilizzando le procedure di arricchimento standard. Il metodo generalizzato di arricchimento batterica sviluppato e adattato da van Twest e Kropinski 10 per arricchire fagi da campioni ambientali resta la base per la maggior parte delle procedure di arricchimento. Prove da studi precedenti suggeriscono che i metodi di placcatura diretta hanno prodotto placche rilevabili s...

L&#39;ubiquità di specie Arthrobacter in ambienti di terreno offre un vasto numero e la diversità dei fagi che possono essere isolati da questa specie di batteri ospiti. Membri batteriche della famiglia Acintobacteriaceae sono più notevole per i loro percorsi catabolici di degradare composti recalcitranti come l&#39;atrazina e vari altri pesticidi e diserbanti 1,2,3. Sebbene la maggior parte della ricerca è stata effettuata utilizzando ceppi ambientali di Arthrobacter, isolati clinici di questo genere si trova nel sangue, urine, gli occhi, e molte altre fonti umane tutte espongono eterogeneità filogenetico 4. Mentre vi è un corpo piuttosto ampio di ricerche sui batteri Arthrobacter, solo pochi studi riportano sui fagi capaci di infettare i membri di questo genere vario. Interessante notare, però, il lavoro fatto in precedenza su Arthrobacter fagi tocca diversi argomenti distinti chiave come la tipizzazione del suolo &lt;em&gt; specie Arthrobacter 5, usi industriali con lo scopo di ridurre la schiuma deleterio in attivati ​​impianti di trattamento dei fanghi 6, e il lavoro evidenziando ricombinazione sito specifico e geni integrasi 7. Vari protocolli tecnica di arricchimento sono stati impiegati per generare pura fagi isolati nelle specie Arthrobacter. Procedure I primi comprendono incubazione del terreno con l&#39;aggiunta di agenti tossici, come i sali di nicotina per periodi di oltre un anno 8 dando luogo a fagi capaci di infettare solo A. globiformis. Studi condotti utilizzando terreno percolati con sostanze organiche labili sembravano produrre fagi rilevabili attraverso tecniche di analisi della placca, omettendo i periodi di incubazione lunghi 8. Interessante notare, però, una tecnica simile a semina diretta è stata utilizzata in passato ha dato origine a diversi fagi, pur avendo un tasso di successo notevolmente basso dagli investigatori 5, citando studi precedenti con basse percentuali di successo <sup&gt; 8. In generale, le tecniche di isolamento utilizzate in passato sono stati notevoli per avere poca efficacia nella pratica, nonostante le genere Arthrobacter rappresentano il terreno aerobico più comune isolare in natura 4,9,, Van Twest e Kropinski 10 attuali metodi di arricchimento per isolare i fagi da acqua e suolo adattato dalle tecniche precedenti utilizzate per arricchire isolati batterici ambientali, ma queste tecniche di arricchimento dimostrato inefficiente a isolare fagi Arthrobacter. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di mostrare &quot;proof of concept&quot;, che i metodi di arricchimento primi possono essere adattati per isolare in modo coerente ed efficace fagi Arthrobacter, superando precedenti sfide tecniche associate a isolare fagi da questo genere di batteri.

<table><tbody><tr><td>LB Brodo in polvere</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>È meglio ordinarli all'ingrosso.</td></tr><tr><td>Agar Fisher granulato</td><td></td><td>BP1423-2</td><td>È meglio ordinarli all'ingrosso.</td></tr><tr><td>Filtri per siringa da 0,22 um</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Filtri buchner da 0,22 um</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>È possibile ottenere più di 50 ml di liquido sostituendo accuratamente il tubo di ricezione.</td></tr><tr><td>Eppendorf Provette</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 5 ml individuali</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 ml</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 ml</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 10 ml singole</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>Pipette da 25 ml singole</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro qualitativa Whatman</td><td>Fisher</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

una tecnica di arricchimento ottimizzato per l&#39;isolamento di<em&gt; arthrobacter</em&gt; batteriofago specie campione di terreno isolati

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

L'isolamento dei batteriofagi da campioni ambientali è stato eseguito per decenni utilizzando i principi stabiliti dai pionieri della microbiologia. L'isolamento dei fagi che infettano gli ospiti di Arthrobacter è stato limitato, forse a causa del basso tasso di successo di molte tecniche di isolamento precedenti, con il risultato di un gruppo sottorappresentato di fagi Arthrobacter disponibili per lo studio. La tecnica di arricchimento qui descritta, a differenza di molte altre, utilizza un estratto filtrato privo di batteri contaminanti come base per la crescita dei batteri indicatori, Arthrobactersp. KY3901, in particolare. Rimuovendo prima i batteri del suolo, i fagi bersaglio non sono ostacolati dalla competizione con i batteri nativi del suolo presenti nei campioni iniziali del suolo. Questo metodo di arricchimento ha portato a dozzine di fagi unici da diversi tipi di terreno e ha persino prodotto diversi tipi di fagi dallo stesso campione di suolo isolato arricchito. L'uso di questa procedura può essere esteso alla maggior parte dei terreni aerobici ricchi di nutrienti per l'isolamento dei fagi in una vasta gamma di batteri ospiti interessanti.

Per dimostrare la riproducibilità della tecnica di arricchimento migliorata per fagi Arthrobacter, 30 diversi campioni di terreno sono stati utilizzati in tempi e luoghi diversi durante la primavera e l&#39;estate del 2014. Di questi campioni di suolo 30 fagi Arthrobacter unici sono stati ottenuti da 22 campioni di terreno raccolti utilizzando questo arricchimento procedura. La procedura standard di arricchimento prodotto fagi unici da 3 degli stessi campioni di suolo. I campioni di arricchimento posso...

Presentiamo un protocollo di arricchimento per l'isolamento di batteriofagi che infettano batteri del genere Arthrobacter. Questo protocollo di arricchimento produce risultati rapidi e riproducibili per l'isolamento e l'amplificazione dei fagi di Arthrobacter da isolati del suolo.

Una tecnica di arricchimento Ottimizzato per l&#39;isolamento di<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Batteriofago Specie campione di terreno Isolati

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare fasi batteriche di Arthrobacter da campioni di suolo utilizzando un protocollo di arricchimento. Ciò si ottiene innanzitutto raccogliendo campioni di suolo e isolando particelle fagiche vitali da microorganismi del suolo contaminanti. Il secondo passaggio consiste nell'infectare cellule batteriche ospiti di Arthrobacter con le particelle fagiche isolate.Successivamente, le cellule batteriche infette vengono seminate su piastre con agar per identificare i fagi, evidenziati dalla formazione di placche. L'ultimo passaggio consiste nel purificare i fagi desiderati da placche chiaramente isolate, utilizzando il metodo della striatura su piastra. In definitiva, questa tecnica di arricchimento è ottimizzata per l'isolamento relativamente semplice di fagi di Arthrobacter a partire dalla specie Arthrobacter KY 3 9 0 1.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi di arricchimento esistenti consiste nell'aggiunta di un campione di suolo finemente filtrato a una coltura pura di batteri ospiti, al fine di evitare la crescita di batteri competitori. Sebbene questo metodo si sia dimostrato efficace per l'isolamento di fagi di Arthrobacter, dovrebbe essere applicabile anche all'isolamento di fagi da altri batteri ospiti. Abbiamo concepito per la prima volta questa metodica quando abbiamo appreso che altri ricercatori incontravano difficoltà nel trovare fagi di Arthrobacter.Con tecniche di arricchimento tradizionali. I miei studenti dimostreranno le tecniche utilizzate per isolare con successo i fagi di Arthrobacter. Le cellule di Arthrobacter vengono coltivate da colonie seminate su una piastra in agar LB e incubate a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.Utilizzare un’ansa sterile per prelevare una colonia e aggiungerla a 50 millilitri di brodo LB. In un flacone di coltura con diaframma, incubare il flacone in un incubatore agitato a 225 giri al minuto a 30 gradi Celsius per circa 24 ore. Per ottenere cellule in fase esponenziale o in fase stazionaria iniziale da utilizzare in esperimenti di infezione con fagi.Monitorare attentamente lo stato della crescita batterica per evitare che le cellule entrino nella fase stazionaria intermedia o avanzata. L'OD 600 ideale per l'isolamento dei fagi è compreso tra 0,5 e 0,7. Poiché i batteri del genere Arthrobacter sono batteri del suolo comuni, essi e i fagi che li infettano possono essere trovati nella maggior parte dei tipi di suolo.Raccogliere da 200 a 400 grammi di terreno dalla località desiderata. Aggiungere almeno 400 millilitri di tampone per fagi al terreno in un becher sufficientemente grande in modo che almeno 200 millilitri di tampone per fagi siano nel soprannatante e possano essere estratti, mescolando delicatamente con movimenti rotatori fino a sospensione completa del terreno, quindi lasciare decantare il sedimento per circa 30 minuti. Successivamente, rimuovere i detriti del sedimento passando l'estratto di terreno attraverso una carta filtrante mediante filtrazione a vuoto.Aggiungere quattro grammi di polvere LB a 200 millilitri dell'estratto di suolo filtrato e mescolare per ottenere una soluzione al 2%. Far passare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron mediante filtrazione a vuoto per ottenere un filtrato sterile. Se possibile, procedere immediatamente al passaggio successivo.Tuttavia, se necessario, i campioni filtrati possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un periodo massimo di una settimana prima di proseguire. Tuttavia, il numero di particelle di fago vitali sarà ridotto utilizzando tecniche asettiche, suddividendo in aliquote multiple da 50 millilitri la miscela di estratto di suolo LB filtrato e sterilizzato in singole fiale da 250 millilitri. Aggiungere alle fiale da coltura sterilizzate, agitate e con baffle, soluzione sterile di cloruro di calcio 2,0 M alle concentrazioni finali desiderate.Poiché diversi fagi di Arthrobacter crescono in modo ottimale in condizioni diverse di cloruro di calcio, iniziare questa procedura aggiungendo da uno a 2,5 millilitri di coltura batterica in fase esponenziale tardiva o stazionaria precoce a ciascun flacone contenente il miscuglio di estratto di terreno LB filtrato e sterilizzato. Se l'OD 600 della coltura è compreso tra 0,5 e 0,7, utilizzare un millilitro. Se l'OD 600 è superiore a 0,7, utilizzare 2,5 millilitri.Agitare i flaconi a 250 giri/min a 30 gradi Celsius per circa 24 ore in un incubatore agitato. Al termine del periodo di incubazione di 24 ore, rimuovere i flaconi di arricchimento dall'incubatore agitato. Diluire i campioni di arricchimento di dieci volte nel buffer per fagi.Preparare provette di coltura con 0,5 millilitri di coltura batterica in fase esponenziale tardiva o stazionaria iniziale. Aggiungere alle provette quantità variabili, da cinque microlitri a 500 microlitri, di coltura di arricchimento diluita.Aggiungere cloruro di calcio nei tubi di coltura in modo da ottenere una concentrazione finale in cinque millilitri pari alla concentrazione presente nel flacone originale di arricchimento. Utilizzare una serie di diverse concentrazioni di cloruro di calcio per selezionare numerosi fagi con differenti dipendenze dal cloruro di calcio. Aggiungere 4,5 millilitri di agar LB superiore in ciascun tubo di coltura e versare la miscela su una piastra con agar LB.Mescolare delicatamente per distribuire in modo uniforme sulla piastra e lasciare solidificare l'agarosio superiore per circa 15 minuti. Capovolgere le piastre e incubare a 30 gradi Celsius da tutta la notte fino a 48 ore. Variare i tempi di incubazione per ottimizzare in base ai fagi presenti; dopo un'incubazione di 24 ore, verificare la formazione di placche sulle piastre.La maggior parte dei fagi isolati proviene da piastre incubate a 30 gradi Celsius con una concentrazione di cloruro di calcio compresa tra 1 e 2,5 millimolare, dopo un periodo di incubazione di 24 ore. La purificazione dei fagi desiderati da placche chiaramente isolate utilizzando un bastoncino di legno rappresenta la parte più complessa di questa procedura. È richiesta una competenza tecnica per stendere delicatamente le placche sulla piastra dell'agar in modo da ottenere una piastra con strisce uniformi. Sterilizzare un bastoncino di legno passandolo attraverso una fiamma e lasciandolo raffreddare.Toccare brevemente una placca con il bastoncino sterile di legno e strofinare il bastoncino sulla piastra di agar in un movimento delicato come mostrato. Ripetere questa operazione utilizzando un bastoncino pulito per ogni passaggio. Una volta che la piastra di agar LB è stata striata almeno tre volte, segnare l'area con la concentrazione più bassa di particelle fagiche putative.Applicare delicatamente 0,5 millilitri di arthrobacter e 4,5 millilitri di agar LB liquido nell'area marcata, lasciando diffondere uniformemente sul piatto. Lasciare solidificare l'agar superiore per almeno un'ora; una volta solidificato il piatto, capovolgerlo e incubarlo tutta la notte. Ripetere la tecnica di striatura per placche per almeno tre iterazioni per assicurare l'isolamento di una specie pura di fago.Le piastre possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana, se necessario tra un passaggio e l'altro, senza una significativa perdita di vitalità dei fagi. Una volta sviluppati e isolati i chiarimenti desiderati sull'ultima piastra di semina, toccare un singolo chiarimento ben isolato con la punta di una pipetta microlitrica e risospendere in 100 microlitri di tampone per fagi. Diluire in modo seriale questa soluzione fino alla diluizione 10 alla meno otto trasferendo 20 microlitri del campione in 180 microlitri di tampone per fagi fresco. Aggiungere 10 microlitri di ogni diluizione a 0,5 millilitri di arthrobacter in coltura in un tubo da coltura per cinque-dieci minuti a temperatura ambiente.Quindi piastrare mescolando i batteri infettati con 4,5 millilitri di agar LB liquido contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio utilizzata per isolare il fago dal campione originale di suolo. Incubare le piastre durante la notte. Conservare tutte le diluizioni effettuate a quattro gradi Celsius fino al giorno successivo.Determinare la diluizione del ceppo fagico necessaria per ottenere un modello a rete utilizzando il saggio tradizionale di titolazione delle placche. Identificare una piastra con modello a rete come quella prevalentemente priva di batteri ma contenente residui di batteri che non sono ancora stati lacerati dai fagi. Aggiungere cinque millilitri di coltura di Arthrobacter in fase esponenziale tardiva o stazionaria precoce in un flacone sterile da 50 millilitri.Aggiungere 100 microlitri della diluizione che ha prodotto un modello a rete alla coltura di arthrobacter e lasciare che i fagi infettino le cellule batteriche per cinque-dieci minuti. A temperatura ambiente, aggiungere al flacone l'agar LB liquido contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio utilizzata inizialmente per identificare la piastra dei fagi. Distribuire 5 millilitri di questa miscela su ciascuna delle 10 piastre fresche di LB.Dopo aver lasciato solidificare l'agar sopra, capovolgere e incubare le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte; il giorno seguente, allagare le piastre con il modello a rete con cinque millilitri di tampone fagico per piastra e conservare durante la notte a quattro gradi Celsius. Filtrare il lisato fagico attraverso un filtro per siringa da 0,22 micron. Conservare questa scorta finale di fagi a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Aggiungere una quantità equivalente del lisato fagico a glicerolo sterile in provette piccole per l'archiviazione di scorte a meno 80 gradi Celsius. Nella procedura di arricchimento dimostrata in questo video, il metodo di striatura su piastra per isolare popolazioni pure di fagi dopo l'arricchimento iniziale e la semina su agar LB mostra risultati rappresentativi dell'isolamento di placche per il fago DI a temperatura ambiente, 30 gradi Celsius e 37 gradi Celsius. I cerchi rossi su due delle piastre delimitano chiaramente placche isolate. Il fago Dylan produce placche simili a tre temperature diverse.In alternativa, è possibile utilizzare un saggio tradizionale di titolazione su piastra per isolare un isolato batteriofagico puro. Questo saggio è stato impiegato qui per determinare empiricamente i valori di titolo del fago e il numero di unità formanti placche necessarie per formare un modello a ragnatela su una piastra. È mostrata una serie di diluizioni seriali per il fago banana, insieme a un esempio di come dovrebbe apparire un buon modello a ragnatela.Queste sono immagini micrografiche elettroniche di 20 fagi di Arthrobacter isolati mediante la tecnica di arricchimento. Dei 25 fagi attualmente isolati, 23 sono virus del tipo cifo con code piuttosto lunghe. Due dei fagi isolati sono virus del tipo mio, contenenti diametri della testa simili in lunghezza a quelli delle loro code.Dopo aver acquisito padronanza, la piastra di arricchimento dovrebbe consentire l'isolamento con successo di fagi di Arthrobacter da una varietà di campioni di suolo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come purificare un fago utilizzando il metodo della striatura su piastra a partire da un campione ambientale di suolo.

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Ambiente

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Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

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