Una tecnica di arricchimento Ottimizzato per l'isolamento di Arthrobacter Batteriofago Specie campione di terreno Isolati

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le fasi dei batteri arthrobacter da campioni di terreno utilizzando un protocollo di arricchimento. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di terreno e isolando le particelle di fagi vitali dai microrganismi contaminanti del suolo. Il secondo passo consiste nell'infettare le cellule batteriche dell'arthrobacter ospite con le particelle di fago isolate.

Successivamente, le cellule batteriche infette vengono piastrate su piastre a coclea per identificare il fago, come evidenziato dalla formazione della placca. Il passaggio finale consiste nel purificare i fagi desiderati da placche chiaramente isolate utilizzando il metodo della piastra a strisce. In definitiva, questa tecnica di arricchimento è ottimizzata per l'isolamento relativamente facile dei fagi di arthrobacter dalle specie di arthrobacter KY 3 9 0 1.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di arricchimento esistenti è l'aggiunta di un campione di terreno finemente filtrato a una coltura pura di batteri ospiti per evitare la crescita di batteri concorrenti. Sebbene questo metodo si sia dimostrato efficace per l'isolamento dei fagi arthrobacter, dovrebbe essere applicabile per l'isolamento dei fagi da altri batteri ospiti. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo appreso che altri ricercatori avevano difficoltà a trovare i fagi dell'arthrobacter.

Con tecniche di arricchimento tradizionali. I miei studenti dimostreranno le tecniche utilizzate per isolare con successo i fagi arthrobacter. Le cellule di Arthrobacter vengono coltivate da colonie striate su una piastra a coclea LB, incubate a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.

Usa un anello sterile per raccogliere una colonia e aggiungilo a 50 millilitri di brodo. In una coltura sconcertata, incubare il pallone in un'incubatrice agitata a 225 giri/min a 30 gradi Celsius per circa 24 ore. Ottenere cellule esponenziali o in fase stazionaria precoce per esperimenti di infezione da fagi.

Monitorare attentamente lo stato di crescita batterica per evitare che le cellule entrino nella crescita stazionaria medio-tardiva. Stato. L'OD 600 ideale per l'isolamento dei fagi è compreso tra 0,5 e 0,7. Poiché i batteri del genere arthrobacter sono comuni batteri del suolo, loro e i fagi che li infettano possono essere trovati nella maggior parte dei tipi di terreno.

Raccogli da 200 a 400 grammi di terreno dalla posizione desiderata. Aggiungere almeno 400 millilitri di tampone fagico al terreno in becher abbastanza grandi in modo che almeno 200 millilitri di tampone fago siano nel surnatante e possano essere estratti mescolati mescolando delicatamente o agitando fino a quando il terreno non è sospeso e lasciare che il sedimento del suolo si depositi tipicamente per 30 minuti. Successivamente, rimuovere i detriti dei sedimenti del suolo facendo passare l'estratto di terreno attraverso una carta da filtro mediante filtrazione sottovuoto.

Aggiungere quattro grammi di polvere LB a 200 millilitri di estratto di terreno filtrato e mescolare per ottenere una soluzione al 2%. Passare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron mediante filtrazione sottovuoto per ottenere un filtrato sterile. Se possibile, continuare immediatamente con il passaggio successivo.

Tuttavia, se necessario, i campioni filtrati possono essere conservati a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana prima di procedere. Tuttavia, il numero di particelle di fagi vitali sarà ridotto utilizzando come tecniche settiche l'aliquotazione di porzioni multiple da 50 millilitri della miscela di estratto di terreno LB sterilizzato con filtro in singoli 250 millilitri. I palloni di coltura sterilizzati, agitati e deflettivi aggiungono una soluzione sterile di cloruro di calcio molare 2,0 alle concentrazioni finali desiderate.

Poiché diversi fagi di arthrobacter crescono in modo ottimale in diverse condizioni di cloruro di calcio, iniziare questa procedura aggiungendo da uno a 2,5 millilitri di coltura batterica esponenziale tardiva o in fase stazionaria precoce a ciascuna delle fiasche contenenti la miscela di estratto di terreno LB sterilizzato con filtro. Se il diametro esterno 600 della coltura è compreso tra 0,5 e 0,7, utilizzare un millilitro. Se l'OD 600 è superiore a 0,7, utilizzare 2,5 millilitri.

Agitare i palloni a 250 giri/min a 30 gradi Celsius per circa 24 ore in un'incubatrice agitante. Dopo il periodo di incubazione di 24 ore, rimuovere i palloni di arricchimento dall'incubatore di agitazione. Diluire i campioni di arricchimento dieci volte in tampone fagico.

Impostare le provette di coltura con 0,5 millilitri di esponenziale tardivo o stazionario precoce. Coltura batterica di fase. Aggiungere varie quantità, da cinque microlitri a 500 microlitri di coltura di arricchimento diluito, alle provette di coltura.

Aggiungere cloruro di calcio alle provette di coltura per ottenere una concentrazione finale in cinque millilitri pari alla concentrazione presente nel pallone di arricchimento originale. Utilizzare una gamma di diverse concentrazioni di cloruro di calcio per selezionare molti fagi con diverse dipendenze dal cloruro di calcio. Aggiungere 4,5 millilitri di coclea superiore LB a ciascuna provetta di coltura e versare il composto su una piastra della coclea LB.

Agitare delicatamente per distribuire uniformemente sulla piastra e lasciare solidificare la coclea superiore per circa 15 minuti. Capovolgere le piastre e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte fino a 48 ore. Variare i tempi di incubazione per ottimizzare i fagi presenti dopo un controllo di incubazione di 24 ore per la formazione di placca sulle piastre.

La maggior parte dei fagi isolati proviene da piastre incubate a 30 gradi Celsius con una concentrazione di cloruro di calcio da uno a 2,5 millimolari dopo un periodo di incubazione di 24 ore, purificando i fagi desiderati da placche chiaramente isolate utilizzando un bastoncino di legno come parte più impegnativa di questa procedura. È necessaria una competenza tecnica per stendere delicatamente le placche sulla piastra della coclea per produrre una piastra a striature uniforme. Sterilizzare un bastoncino di legno facendolo passare attraverso una fiamma e lasciandolo raffreddare.

Toccare brevemente una placca con il bastoncino di legno sterile e strofinare il bastoncino sulla piastra della coclea con un movimento delicato come mostrato. Ripeti l'operazione usando un bastoncino pulito per ogni passaggio. Una volta che la piastra della coclea LB è striata almeno tre volte, contrassegnare l'area con la concentrazione più bassa di particelle di fagi putativi.

Applicare delicatamente 0,5 millilitri di arthrobacter e 4,5 millilitri di coclea superiore LB fusa sull'area contrassegnata e lasciarla distribuire uniformemente sulla piastra. Lasciare solidificare la coclea superiore per almeno un'ora quando la piastra si è solidificata, capovolgerla e incubarla per una notte. Ripetere la tecnica della placca striata per almeno tre iterazioni per assicurarsi che venga isolata una specie di fago pura.

Le piastre possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana, se necessario, tra una serie e l'altra senza una significativa perdita di vitalità dei fagi. Una volta che le placche desiderate sono state coltivate e isolate sulla piastra di striatura finale, toccare una placca ben isolata con una punta di micropipetta e risospendere in 100 microlitri di tampone fagico in serie Diluire questa soluzione fino alla diluizione da 10 a meno ottava passando 20 microlitri del campione in 180 microlitri di tampone fagico fresco. Aggiungere 10 microlitri di ciascuna diluizione a 0,5 millilitri di arthrobacter coltivato in una provetta di coltura per cinque-10 minuti a temperatura ambiente.

Quindi impiattare mescolando i batteri infetti con 4,5 millilitri di coclea superiore LB fusa contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio utilizzata per isolare il fago dal campione di terreno originale. Incubare le piastre durante la notte. Conservare tutta la diluizione effettuata a quattro gradi Celsius fino al giorno successivo.

Determinare la diluizione dei cereali fagici necessaria per creare un modello a ragnatela utilizzando il tradizionale saggio del titolo della placca. Identificare una piastra con motivo a ragnatela come per lo più priva di batteri, ma contenente resti di batteri che non sono ancora stati allacciati dai fagi. Aggiungere cinque millilitri di coltura di arthrobacter esponenziale tardivo o stazionario precoce a un pallone di coltura sterile da 50 millilitri.

Aggiungere 100 microlitri della diluizione che ha dato un modello di ragnatela alla coltura di arthrobacter e lasciare che i fagi infettino le cellule batteriche per 5-10 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere al pallone una coclea superiore fusa per libbra contenente la stessa concentrazione di cloruro di calcio utilizzata inizialmente per identificare la piastra fagica. Cinque millilitri di questa miscela su ciascuno dei 10 piatti LB freschi.

Dopo aver lasciato che la coclea superiore solidificasse, capovolgesse e incubasse le piastre a 30 gradi Celsius durante la notte del giorno successivo, inondare le piastre del modello a nastro con cinque millilitri di tampone fagico per piastra e conservarle durante la notte a quattro gradi Celsius. Filtrare il lisato di fagi attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron. Conserva questa riserva di fagi finale a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Aggiungere una quantità uguale di lisato di fagi al glicerolo sterile in piccole fiale per l'archiviazione delle scorte a meno 80 gradi Celsius nella procedura di arricchimento dimostrata in questo video, il metodo della striscia di placca per isolare le popolazioni di fagi puri dopo l'arricchimento iniziale e la placcatura sulla coclea LB mostrati sono risultati rappresentativi dall'isolamento delle placche per la DI dei dei fagi a temperatura ambiente, 30 gradi Celsius e 37 gradi Celsius. I cerchi rossi su due delle lastre circondano placche chiaramente isolate. Il fago Dylan produce placche simili a tre diverse temperature.

In alternativa, è possibile utilizzare un tradizionale test standard del titolo di placca per isolare un isolato di fagi puro. Questo test è stato utilizzato qui per determinare empiricamente il numero di titoli fagici e il numero di unità di formazione della placca per formare un modello di fettuccia su una piastra. Viene mostrato un set di diluizione seriale per la banana fagica con un esempio di come dovrebbe apparire un buon modello di ragnatela.

Si tratta di immagini micrografiche elettroniche di 20 fagi di arthrobacter isolati con la tecnica dell'arricchimento. Dei 25 fagi attualmente isolati, 23 sono virus cifo con code piuttosto lunghe. Due dei fagi isolati sono myovirus contenenti diametri della testa di lunghezza simili a quelli delle loro code.

Una volta padroneggiata, la placcatura di arricchimento dovrebbe consentire l'isolamento di successo dei fagi di arthrobacter da una varietà di campioni di terreno. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare il fago viene utilizzato nel metodo di vernice a strisce da un campione di terreno ambientale.