Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica
3 maggio 2015
I trasportatori nelle membrane cellulari consentono la segregazione differenziale degli ioni attraverso le membrane cellulari o gli strati cellulari e svolgono un ruolo cruciale durante la fisiologia, la riparazione e la patologia dei tessuti. Descriviamo il microelettrodo autoreferenziale iono-selettivo che consente la misurazione di flussi ionici specifici in singole cellule e tessuti in vivo.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i flussi ionici extracellulari in vivo utilizzando la tecnica dell'elettrodo microscopico selettivo per ioni con riferimento automatico. Questo viene realizzato innanzitutto assemblando gli elettrodi microscopici selettivi per ioni e l'elettrodo di riferimento. Il secondo passaggio consiste nella calibrazione e nella validazione degli elettrodi microscopici selettivi per ioni con riferimento automatico.
Successivamente, le misurazioni del flusso ionico specifico vengono effettuate sul campione biologico sotto forma di registrazioni di tensione. Infine, la registrazione della tensione viene convertita in flusso ionico. In definitiva, questa tecnica consente una misurazione non invasiva e accurata dei flussi ionici extracellulari specifici in cellule o tessuti viventi.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in fisiologia e invecchiamento, nonché nella rigenerazione o nella patologia. Ad esempio, questo metodo consente l'identificazione di specifici flussi ionici, che controllano processi biologici come la morfogenesi, la crescita o la differenziazione dei tessuti. A dimostrare questa procedura sarà il dott. Gim Ardi, ricercatore postdottorato, e il laboratorio del dott. Benjas. Prima del montaggio per la calibrazione dell'elettrodo, posizionare un elettrodo selettivo per ioni pre-riempito in un supporto per microelettrodi dotato di un connettore maschio in oro da un millimetro e di un filo di argento rivestito di cloruro di argento.
Quindi collegare il porta-microelettrodo a un microposizionatore elettronico controllato da computer a tre assi. La elettrodo selettivo per ioni deve già contenere l'elettrolita e la soluzione del cocktail per ioni specifico per gli ioni di interesse. Una volta montato, l'elettrodo deve essere immerso in una soluzione contenente un millimolare di cloruro di potassio.
Inoltre, montare l'elettrodo di riferimento in un porta-elettrodo microscopico dritto contenente una soluzione salina tre molare in agar, una pastiglia di argento ricoperta di cloruro d'argento e un connettore maschio in oro da due millimetri per l'elettrodo di riferimento. La scelta della soluzione salina dipende dalle specie ioniche da misurare. Dopo aver preparato l'elettrodo di riferimento, fissare il porta-elettrodo a un microposizionatore manuale precedentemente montato su un supporto magnetico.
Dopo il montaggio, l'elettrodo deve essere immerso in una soluzione contenente cloruro di potassio uno millimolare. Prima di iniziare, configurare l'elettrodo selettivo per ioni preparando una serie di diluizioni di standard di calibrazione elettrolitici contenenti gli ioni di interesse. Ad esempio, se si desidera rilevare il catione potassio a una concentrazione fisiologica di circa uno millimolare, preparare una serie logaritmica di tre ordini di grandezza di soluzioni di cloruro di potassio a 10, 1 e 0,1 millimolare.
Questo massimizza il campo dinamico di rilevamento richiesto dal saggio. Per tarare l'elettrodo selettivo agli ioni, iniziare immergendo sia l'elettrodo selettivo che l'elettrodo di riferimento nella soluzione di taratura meno concentrata, in questo caso 0,1 millimolare. Dopo un breve periodo di stabilizzazione di uno-tre minuti a temperatura ambiente, misurare e registrare la tensione allo stato stazionario.
Ripetere le misurazioni di tensione per tutti gli altri standard di calibrazione, riportando le tensioni misurate in funzione del logaritmo delle concentrazioni molari degli ioni. Per ogni soluzione standard, applicare una regressione lineare per determinare il coefficiente angolare N, l'intercetta e il valore di R² della curva di calibrazione. Per calcolare il coefficiente angolare di Nernst, ricordare di dividere le tensioni misurate per il guadagno totale dell'amplificatore di tensione.
Per dimostrare il protocollo di misurazione, il flusso di ioni potassio da un oocita di rana perforato verrà caratterizzato utilizzando un microelettrodo sensibile al potassio. Prima di iniziare l'allestimento dell'elettrodo selettivo per ioni, ritagliare una porzione di un centimetro da una maglia di nylon da 800 micron e incollarla a una piastra di Petri in plastica. Inoltre, preparare in anticipo la soluzione di Ringer modificata di Mark con la seguente formulazione: 100 millimolari di cloruro di sodio, due molarità di cloruro di potassio, due millimolari di cloruro di calcio, un millimolare di cloruro di magnesio e cinque millimolari di HEPES. Regolare il pH del tampone a 7,5 con idrossido di sodio e aggiungere un'aliquote del tampone preparato nella piastra di Petri.
Posizionare con attenzione la cellula della rana, l'elettrodo selettivo per ioni e l'elettrodo di riferimento nella capsula di Petri. Successivamente perforare la cellula e azionare il microposizionatore, in modo che l'elettrodo selettivo per ioni si trovi a circa 10 micron dal campione. Per quanto riguarda la nomenclatura, la distanza attuale tra il campione e l'elettrodo verrà indicata come posizione ravvicinata.
Successivamente, azionare il microposizionatore in modo che l'elettrodo selettivo per ioni attraversi periodicamente la posizione ravvicinata di 10 micrometri fino a una posizione più distante di 100 micrometri, per poi tornare alla posizione ravvicinata con una frequenza di 0,3 hertz, ovvero tre percorsi completi ogni 10 secondi. Durante l'azionamento del microposizionatore, verificare che il movimento dell'elettrodo sia effettivamente perpendicolare alla superficie tangenziale lesa della cellula; attivare quindi il software di misurazione e registrazione della tensione. Il microposizionatore è programmato per fermarsi brevemente nelle posizioni ravvicinata e distante mentre vengono raccolti i dati di tensione.
I dati vengono registrati continuamente durante la riparazione della ferita nell'oocita, un processo che richiede circa 15 minuti; per esperimenti più lunghi, come l'osservazione di processi su più giorni durante le misurazioni della rigenerazione della coda del girino opus, i dati vengono registrati per due minuti in diversi punti temporali, ad esempio a 1, 3, 6, 12 e 24 ore. Al termine dell'esperimento, estrarre i dati di tensione come file di testo e copiare i valori in un foglio elettronico.
Utilizzare la curva di calibrazione determinata in precedenza per convertire i valori di tensione misurati nelle corrispondenti concentrazioni ioniche. Riportare in grafico le concentrazioni ioniche estrapolate in funzione della distanza dal campione biologico. Infine, calcolare il flusso ionico utilizzando la legge fissa della diffusione.
Dove C è la concentrazione degli ioni nella soluzione, MU è la mobilità degli ioni e DC DX è la differenza di concentrazione rispetto alla distanza dx. Prima di iniziare gli esperimenti biologici, il valore dell'intercetta della pendenza del NER e l'intera curva di calibrazione dell'elettrodo selettivo per ioni possono essere convalidati confrontandoli con un gradiente ionico artificiale generato da una sorgente ionica unimolare posta in una piastra di Petri. Quando le variazioni delle concentrazioni degli ioni potassio vengono riportate in grafico a distanza ravvicinata o lontana dal sito della ferita annu.
I dati indicano che si verifica un massiccio evento di flusso di potassio all'inizio del danno cellulare; man mano che la riparazione della ferita procede, il flusso di potassio diminuisce gradualmente fino a tornare ai livelli di quiescenza dopo 15 minuti, quando la ferita è completamente guarita. Inoltre, quando le concentrazioni misurate di ioni potassio vengono convertite in flusso ionico, l'aumento improvviso e la diminuzione graduale del flusso di potassio dopo il danno risultano essere un effetto statisticamente significativo rispetto a un oocita di controllo integro. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'etichettatura fluorescente della bioelettricità, al fine di rispondere ad ulteriori domande sulle caratteristiche dei flussi ionici intercellulari e subcellulari.
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Panoramica
Questo articolo descrive la tecnica del microelettrodo autoreferenziante selettivo per gli ioni, utilizzata per misurare i flussi ionici specifici nelle cellule e nei tessuti viventi. Questo metodo consente valutazioni accurate e non invasive della dinamica ionica extracellulare in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Elettrofisiologia
- Biologia cellulare
Sfondo
- I trasportatori nelle membrane cellulari sono essenziali per la separazione degli ioni.
- Svolgono ruoli fondamentali nella fisiologia e nella patologia dei tessuti.
- Comprendere i flussi ionici è fondamentale per lo studio dei processi cellulari.
- L'elettrodo microscopico autoriferito selettivo per ioni è uno strumento innovativo a tale scopo.
Scopo dello studio
- Misurare i flussi ionici extracellulari in vivo.
- Utilizzare la tecnica microelettrodica autoriferita selettiva per ioni.
- Fornire informazioni sulle dinamiche ioniche nei tessuti viventi.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio di microelettrodi selettivi per ioni e di microelettrodi di riferimento.
- Calibrazione e validazione dei microelettrodi.
- Registrazioni di tensione da campioni biologici.
- Conversione delle registrazioni di tensione in misurazioni del flusso ionico.
Risultati principali
- Misurazione riuscita dei flussi ionici specifici in cellule vive.
- Dimostrazione dell'accuratezza e della natura non invasiva della tecnica.
- Convalida del metodo attraverso processi di calibrazione.
- Potenziali applicazioni nello studio della fisiologia e della patologia dei tessuti.
Conclusioni
- L'elettrodo microscopico selettivo per ioni è efficace per misurazioni in vivo.
- Questa tecnica migliora la nostra comprensione della dinamica ionica.
- Apre nuove strade per la ricerca in fisiologia cellulare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione dei flussi ionici extracellulari fornisce informazioni fondamentali sui percorsi di segnalazione cellulare che regolano la morfogenesi, la crescita e la differenziazione dei tessuti, processi chiave nella validazione degli obiettivi e nello screening fenotipico. La tecnica microelettrodica autoriferita selettiva per ioni consente una valutazione quantitativa e non invasiva della dinamica ionica in sistemi viventi, supportando la riduzione del rischio meccanicistica collegando i cambiamenti nel flusso ionico agli esiti biologici. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, identificando meccanismi mediati da ioni che influenzano la progressione della malattia e la risposta terapeutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche identificando specifici flussi ionici che regolano processi biologici come la morfogenesi tissutale e la differenziazione.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale di bersagli mediante la misurazione diretta delle variazioni dei flussi ionici in risposta a stimoli cellulari o a perturbazioni genetiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo profili di base del flusso ionico in condizioni fisiologiche.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso misurazioni calibrate con microelettrodi che forniscono dati quantitativi sulla concentrazione ionica in funzione della distanza.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega i risultati della scoperta alla continuità preclinica dimostrando come la dinamica del flusso ionico si correli ai processi di guarigione delle ferite e di rigenerazione dei tessuti.
- Valore operativo: Consente decisioni di avanzamento corrette in base al rischio fornendo misurazioni statisticamente significative del flusso ionico che distinguono tra stati biologici di controllo e perturbati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi delle ipotesi all'identificazione dei composti attivi, fornendo dati quantitativi sul flusso ionico che contribuiscono a definire il livello di fiducia sul bersaglio e a chiarire le vie metaboliche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico misurando i flussi ionici che fungono da segnali nei processi cellulari.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso registrazioni di potenziale convertite in valori di flusso ionico mediante la legge di diffusione di Fick, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Analisi: Produce misurazioni quantitative (concentrazione ionica, flusso) e risultati statistici (ad esempio, variazioni significative dopo una lesione) che permettono il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica mostrando le variazioni del flusso ionico durante la riparazione dei tessuti, fornendo indicazioni per l'allineamento dei biomarcatori in contesti rigenerativi.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per misurazioni specifiche del flusso ionico in diversi tipi cellulari e modelli di tessuto, adattabile alla rilevazione di calcio, potassio o sodio mediante la scelta dell'ionoforo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante misurazioni dirette del flusso ionico.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso curve di calibrazione e verifica della pendenza di Nernst rispetto a gradienti ionici noti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione fornendo dati quantitativi e statisticamente significativi sul flusso ionico che riflettono le risposte biologiche a lesioni o trattamenti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio identificando firme di flusso ionico associate all'efficacia terapeutica o alla tossicità in sistemi rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in elettrofisiologia e nella manipolazione di microelettrodi per un corretto assemblaggio e posizionamento.
- È subordinato a strumentazione specifica, tra cui un microposizionatore computerizzato a tre assi e un amplificatore di tensione con calibrazione del guadagno.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di calibrazione, mediante serie di diluizioni specifiche per ioni, al fine di massimizzare la dinamica di risposta.
- Comporta considerazioni di adattamento quando la tecnica viene applicata a diversi sistemi modello (ad esempio, ovociti di rana, cellule vegetali, strati epiteliali).
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di un posizionamento stabile del microelettrodo perpendicolare alla superficie del tessuto e la suscettibilità alla deriva durante registrazioni a lungo termine.
