Name: Invasione Chick Cuore Saggio per il test linvasività delle cellule tumorali e lattività di composti potenzialmente anti-invasive (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara a studiare l'invasione tumorale in tre dimensioni utilizzando frammenti di cuore di pollo embrionale. Questo metodo di coltura organotipica permette di testare farmaci anti-invasivi e analizzare l'interazione tra cellule tumorali e tessuto normale.

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Ringraziamo Marleen De Meulemeester per aver dimostrato la tecnica di analisi nel video film. B.I.R. è un ricercatore post-dottorato della Fondazione di Ricerca – Fiandre (FWO – Vlaanderen). L.M.M. ha ricevuto una borsa di studio Emmanuel van der Schueren dalla Lega Fiamminga contro il Cancro (Vlaamse Liga tegen Kanker).

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Durante la preparazione di PHFS, i frammenti potrebbero non rimanere in sospensione, ma aderire alla parete del vaso; questo può essere superato aumentando il volume del mezzo di coltura. Se il numero di PHFS è troppo bassa e la loro dimensione è troppo grande, diminuire il volume del terreno di coltura. Fallimento delle celle di prova per aggregare può essere dovuto a fluttuazioni nella temperatura e conseguente infezione microbica. In alternativa, l&#39;incapacità di aggregare può essere una caratteristica intrinseca ...

Invasion è il segno distintivo di tumori maligni. Questa attività porta non solo alla distruzione dei tessuti circostanti, ma è anche implicato nella formazione di metastasi. Dal momento che i malati di cancro muoiono per invasione e metastasi, e trattamenti anti-invasivi efficienti sono ancora scarse, analisi di laboratorio che simulano l&#39;invasione delle cellule tumorali sono stati sviluppati. L&#39;obiettivo del saggio cuore pulcino è quello di offrire un metodo di coltura degli organi competenti di studiare invasione tumorale in tre dimensioni. Il dosaggio può distinguere tra cellule invasive e non invasive, e permette di studiare gli effetti dei composti di prova su invasione tumorale. La logica dietro l&#39;uso del test è il concetto stesso che i tumori sono ecosistemi in cui le cellule neoplastiche interagiscono continuamente con il loro stroma (cellule dell&#39;ospite e matrice extracellulare), e che attraverso queste interazioni molecolari invasione è messo a punto 1. Così, nel dosaggio cellule tumorali si confrontano con living frammenti cardiaci pulcino embrionali 2, che servono non solo come substrati per l&#39;invasione da parte delle cellule tumorali, ma anche come fonte di diversi tipi di cellule stromali e elementi di matrice. Il cuore pulcino contiene miociti, fibroblasti e cellule endoteliali, e la matrice extracellulare è composto di laminina, fibronectina e diversi tipi di collagene. In questo modo, il tridimensionale tecnica di coltura organo copre molte interazioni cellulari e molecolari implicati nell&#39;invasione di tumori paziente. Il vantaggio principale del saggio cuore pulcino è l&#39;implementazione di effetti stromali. Questo aspetto è più completa rispetto ad altri test di invasione in vitro che si basano su l&#39;invasione delle cellule tumorali in gel non viventi composte da membrana basale 3 o matrice interstiziale 4 molecole. Il concetto di confronto tra le cellule tumorali e normali tessuti ostia vivente come si trova nella cultura organo sperimentazione è stata introdotta da variautori tra Wolff e Schneider in Francia 5, Easty e Easty nel Regno Unito 6, e Schleich in Germania 7. Due vantaggi tecnici del cuore pulcino invasione dosaggio rispetto ai metodi citati è che il volume dei frammenti può facilmente essere standardizzate, e che rimangano contrattile, che consente il monitoraggio integrità funzionale durante la coltura d&#39;organo. Inoltre, gli embrioni aviaria sono preferiti, perché possono facilmente essere sezionati dal contenuto sterile dell&#39;uovo. Il test ha somiglianza concettuale al pulcino chorioallantois membrane assay 8 offrendo un stromale complesso circostante per le cellule tumorali. Il dosaggio è stato applicato con successo per distinguere tra le varianti cellule invasive e non invasive dagli stessi tumori umani come nel MCF-7 (mammaria) 9 e HCT-8 (colon) 10 famiglie di linee cellulari. La tecnica è utile per testare composti potenzialmente anti-invasive e <sup&gt; 11,12. Come ulteriormente illustrato, può essere usato per la creazione di relazioni struttura-attività di piccole molecole organiche. Il saggio, tuttavia, non tiene conto del contributo delle cellule immunologiche all&#39;invasione cancro. Va sottolineato che la tecnica non può essere considerato come un sistema di analisi ad alta produttività, a causa del numero elevato di manipolazioni, del numero limitato di piste del saggio (massimo 30 culture) e il lungo tempo di ritorno (circa 1 mese).

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina di Ringer</td><td>Braun</td><td>CEO123</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(idrossimetil)-aminomethaan Analar</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>BSA : albumina da siero bovino, cohn V fract.</td><td>Sigma</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Rega 3</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>19993013</tr><tr><td>Agitatori giroscopici</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10 e G33</td><td></td></tr><tr><td>Palloni di Erlenmeyer 50 ml</td><td>Novolab</td><td>92717</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro</td><td>Novolab</td><td>68516</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per iridectomia</td><td>Rumex</td><td>11-0625</td><td></td></tr><tr><td>Macroscopio con griglia oculare calibrata</td><td>Wild</td><td>157702</td><td></td></tr><tr><td>Cera di paraffina</td><td>International Medical products</td><td>8599956</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>230251-25g</td><td></td></tr><tr><td>Ematossilina di Harris</td><td>Sigma</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Resina per vetrini coprioggetti (Tissue-Tek)</td><td>Sakura</td><td>4494</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per la fusione della paraffina</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo per sezionamento della paraffina</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stppers per palloni Erlemeyer con ingressi e uscite di gas</td><td>Novolab</td><td>2602421 e 260243</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>REAX tavolo a dondolo</td><td>Heidolph</td><td>54131</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per tessuti a 24 pozzetti</td><td>VWR</td><td>NUNC142475</td><td></td></tr><tr><td>Cucchiaio per enucleazione oftalmologica</td><td>Rumex</td><td>16-060</td><td></td></tr><tr><td>Pinze affilate</td><td>Rumex</td><td>4-111T</td><td></td></tr><tr><td>Pinze smussate</td><td>Nickel-Electro LTD</td><td>7112</td><td></td></tr><tr><td>Palloni di Erlenmeyer 5 ml</td><td>Novolab</td><td>211901</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio lavati e sgrassati</td> Prodotti <td>medici internazionali</td><td>8613908</td><td></td></tr></tbody></table>

invasione chick cuore saggio per il test l&#39;invasività delle cellule tumorali e l&#39;attività di composti potenzialmente anti-invasive

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

L&#39;obiettivo del saggio cuore pulcino è quello di offrire un metodo di coltura degli organi competenti di studiare invasione tumorale in tre dimensioni. Il dosaggio può distinguere tra cellule invasive e non invasive, e consente lo studio degli effetti dei composti di prova su invasione tumorale. Le cellule tumorali - sia come aggregati o singole cellule - si confrontano con frammenti di cuore pulcino embrionale. Dopo cultura organistica in sospensione per un paio di giorni o settimane le culture confrontano sono fissi e inclusi in paraffina per l&#39;analisi istologica. L&#39;interazione tridimensionale tra le cellule tumorali e il tessuto normale viene poi ricostruita da sezioni seriali colorate con ematossilina-eosina o dopo colorazione immunoistochimica per epitopi nel tessuto del cuore o le cellule tumorali confrontano. Il saggio è coerente con il concetto recente che l&#39;invasione cancro è il risultato di interazioni molecolari tra le cellule tumorali e le loro elementi host vicina stromali (miofibroblasti, endothcellule Elial, componenti della matrice extracellulare, etc.). Qui, questo ambiente stromale è offerto alle cellule tumorali, come un frammento di tessuto vivente. Aspetti di supporto per la rilevanza del saggio sono molteplici. Invasione nel saggio è in conformità con i criteri di invasione cancro: occupazione progressiva e sostituzione nel tempo e nello spazio del tessuto ospite, e l&#39;invasività e la non-invasività in vivo delle cellule confrontano generalmente correla con l&#39;esito del test. Inoltre, il modello di invasione delle cellule in vivo, come definito da patologi, si riflette nelle immagini istologiche nel test. Quantitative relazione struttura-attività (QSAR) analisi dei risultati ottenuti con numerosi composti organici congeneri potenzialmente anti-invasivi consentito lo studio delle relazioni struttura-attività di flavonoidi e calconi e noti farmaci antimetastatici utilizzati in clinica (ad esempio, inibitori microtubuli ) inibiscono l&#39;invasione nel test pure. However, il test non tiene conto dei contributi immunologici per l&#39;invasione del cancro.

Le sezioni istologiche come illustrato nella figura 5 mostra il risultato finale di una serie di saggi di successo. L&#39;istologia suono delle culture indica cellule vitali e permette di interpretare l&#39;interazione tra cellule tumorali e tessuto normale. Inoltre, nessuna reazione immune dal tessuto normale può osservare, che conferma la corretta età degli embrioni di pollo utilizzati ad esempio, prima che il sistema immunitario di rigetto è sviluppato. Non ci sono batteri visibili, il che indica l&#39;assen...

Qui, vi presentiamo un protocollo per studiare l&#39;invasione delle cellule tumorali in viventi frammenti di tessuto normale in tre dimensioni. Questa tecnica cultura organo è applicata principalmente per testare farmaci potenzialmente anti-invasive in vitro.

Invasione Chick Cuore Saggio per il test l&#39;invasività delle cellule tumorali e l&#39;attività di composti potenzialmente anti-invasive

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

L'obiettivo generale di questa procedura è offrire un metodo di coltura organica rilevante per lo studio dell'invasione tumorale in tre dimensioni. Questo viene realizzato innanzitutto preparando frammenti di tessuto normale ottenuti da cuori di pollo embrionale. Nel secondo passaggio, vengono preparati aggregati di cellule tumorali in sospensione.Gli aggregati di cellule tumorali vengono quindi confrontati singolarmente con frammenti di tessuto normale su un letto di agar semisolido per l'incubazione in coltura di sospensione. Nell'ultima fase, le colture confrontate vengono fissate per l'inclusione in paraffina e la sezione istologica. Infine, l'invasione delle cellule tumorali nei frammenti di tessuto può essere visualizzata mediante analisi microscopica in serie delle sezioni tessutali.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi di invasione con gel, è che con questa tecnica le cellule tumorali vengono poste a confronto con frammenti di tessuto vivente tridimensionale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del cancro, poiché esiste un fabbisogno insoddisfatto di farmaci anti-invasivi. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà, e la ragione è che trascurano l'importanza dell'uso di dimensioni specifiche del frammento di tessuto e degli aggregati di cellule tumorali.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'invasione tumorale, può essere applicato anche ad altri sistemi. Ad esempio, allo studio dell'invasione dei tessuti periferici da parte di cellule infiammatorie o all'integrazione di cellule staminali nel tessuto cardiaco. Nella coltura Supreme, i frammenti di cuore di pollo iniziano con l'incubazione di un uovo fecondato a 37 gradi Celsius per nove giorni.Al nono giorno, disinfettare il guscio con etanolo al 70%. Quindi, in una cappa a flusso laminare, utilizzare pinze smussate per aprire il guscio. Successivamente, posizionare un cucchiaio per enucleazione attorno al collo dell'embrione ed estrarre l'embrione dal guscio.Posizionare l'embrione in una capsula di Petri di vetro da cinque centimetri contenente cinque millilitri di soluzione salina di Ringer. Quindi, tenendo una pinzetta affilata in ciascuna mano, aprire strappando la cute toracica ventrale, rimuovere lo sterno e utilizzare forbici da iridectomia per dissezionare il cuore e staccare i suoi vasi sanguigni principali.Trasferire il cuore in una nuova piastra di Petri di vetro da cinque centimetri contenente cinque millilitri di mezzo di coltura, integrato con il 5% di siero fetale bovino, sotto un microscopio dotato di griglia oculare calibrata. Utilizzando forbici da microdissezione, resecare il terzo cranico superiore del cuore per rimuovere le atria e i vasi associati.Quindi utilizzare pinzette affilate per dissezionare il pericardio dai ventricoli. Successivamente, eseguire una emisezione sagittale nei ventricoli ed eliminare il sangue. Trasferire poi i ventricoli in un altro piatto di Petri da cinque centimetri contenente cinque millilitri di mezzo di coltura fresco e siero fetale bovino, e tagliare il tessuto in pezzi di diametro pari a 0,4 millimetri.Una volta tagliati tutti i ventricoli, ruotare delicatamente la piastra per far convergere tutti i frammenti verso il centro. Quindi utilizzare un ago in acciaio inossidabile per spostare tutte le Cora Eliana verso la periferia della piastra di Petri. A questo punto, utilizzare una pipetta di Pasteur in vetro per trasferire i frammenti cardiaci in un matraccio Erlenmeyer da 50 millilitri ricoperto con un sottile strato di cultura.Gasare il matraccio con il 5% di anidride carbonica e incubare i frammenti su un agitatore rotatorio a 37 gradi Celsius con 70 giri al minuto per 24 ore. Il giorno successivo, trasferire i frammenti in una piastra di Petri e utilizzare un ago per scartare l'eliana corposa, i frammenti necrotici scuri e qualsiasi conglomerato tissutale. Incubare i frammenti in un matraccio Erlenmeyer da 50 millilitri contenente sei millilitri di mezzo di coltura sull'agitatore rotatorio per ulteriori 60 ore; due giorni e mezzo dopo, utilizzare il microscopio e gli aghi per selezionare i frammenti steroidei che presentano uno strato sottile ed omogeneo di cellule fibroblastiche e un diametro di 0,4 millimetri.Quindi trasferire i frammenti cardiaci precoltivati in un'altra capsula di Petri contenente mezzo di coltura fresco. Tre giorni prima dell'inizio della coltura confrontante, sospendere 100.000 cellule test per millilitro in sei millilitri di mezzo di coltura appropriato in un matraccio Erlenmeyer da 50 millilitri. Successivamente, incubare il matraccio su un agitatore rotatorio a 37 gradi Celsius e 70 giri al minuto con la percentuale appropriata di anidride carbonica.Dopo 72 ore, osservare gli aggregati al microscopio e selezionare gli aggregati cellulari steroidalici con un diametro di 0,2 millimetri. Successivamente, trasferire otto frammenti cardiaci preculturati di 0,4 millimetri, sospesi in una minima quantità di mezzo di coltura, in una capsula di vetrino embriologica contenente mezzo di agar semisolido.Spostare i frammenti in cerchio e utilizzare un piccolo pezzo di carta da filtro per aspirare il mezzo in eccesso. Posizionare 10 degli aggregati cellulari steroidalici di 0,2 millimetri all'interno del cerchio. Dopo aver rimosso il mezzo in eccesso, spostare un aggregato verso ciascuno dei frammenti cardiaci precoltivati fino a quando non entrano in contatto tra loro.Ora, sigillare il coperchio della capsula di Petri con paraffina e incubare la coltura co-colturale a 37 gradi Celsius per quattro-24 ore, a seconda delle proprietà adesive delle cellule testate ai frammenti cardiaci precolturati. Al termine dell'incubazione, immergere una coppia di confronto in mezzo di coltura preriscaldato a 37 gradi Celsius e utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire ogni coppia in singoli flaconi di Erlenmeyer da cinque millilitri contenenti ciascuno 1,5 millilitri di mezzo di coltura. Successivamente, incubare i flaconi su un agitatore rotatorio a 37 gradi Celsius e 120 giri al minuto, facendo passare la percentuale appropriata di anidride carbonica. Due flaconi Erlenmeyer supplementari da cinque millilitri riempiti con due millilitri di soluzione salina di Ringer per l'analisi istologica dei confronti.Al termine del periodo di incubazione, trasferire le colture in soluzione salina di Ringer per alcuni secondi per rimuovere le proteine sieriche. Successivamente, trasferire le pere in singole piastre di Petri da tre centimetri contenenti tre millilitri di soluzione di Bowen Holland. Dopo due ore, risciacquare le colture tre volte con tre millilitri di acqua demineralizzata prima di incubarle in acqua di rubinetto per due ore, in modo da rimuovere la maggior quantità possibile di soluzione fissativa.Infine, trasferire le coppie in tre millilitri di etanolo al 70% ciascuna per un periodo fino a diversi giorni. In queste immagini di colture riuscite, non è osservabile alcuna reazione immunitaria da parte del tessuto normale né nel tessuto tumorale né in quello cardiaco, confermando che gli embrioni di pollo sono stati utilizzati prima dello sviluppo del sistema di rigetto immunitario. Inoltre, non sono visibili batteri, indicando l'assenza di contaminazioni evidenti durante il periodo di coltura.Inoltre, il bordo arrotondato delle sezioni conferma che le colture esistevano in sospensione senza segni di adesione temporanea alla parete della fiala erla mire. Molti composti sono stati testati con questo saggio di invasione del cuore di pollo. Per quelli strutturalmente correlati, è stata stabilita una relazione quantitativa tra struttura e attività basata sui risultati del saggio, con dati che dimostrano una chiara correlazione tra le attività anti-invasive previste e sperimentali.Effettivamente, questa matrice di confusione può essere utilizzata per riassumere i punti deboli e i punti di forza del saggio, fornendo un'indicazione approssimativa dell'accuratezza e della riproducibilità dell'esperimento. Nel tentativo di eseguire questa nuova procedura, è estremamente importante attenersi rigorosamente alle dimensioni prescritte dei frammenti di tessuto seguendo questo protocollo. Altri metodi, come il confronto con cellule non tumorali, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: Le cellule infiammatorie invadono il tessuto?Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come discriminare tra cellule tumorali invasive e non invasive. Non dimenticare che lavorare con fissativi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni, come l'aerazione dell'aria, devono essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video dimostra come misurare l'invasione delle cellule attraverso inserti in coltura cellulare utilizzando una metodologia basata fluorescenza.

Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion

Un tempo reale impedenza elettrica tecnica basata su Misura Invasione di cellule endoteliali monostrato dalle cellule tumorali

Flusso di fluido interstiziale è elevata in tumori solidi e in grado di modulare l'invasione delle cellule tumorali. Qui si descrive una tecnica per applicare il flusso di fluido interstiziale alle cellule incorporati in una matrice e quindi misurare i suoi effetti sulla invasione cellulare. Questa tecnica può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi.

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Questo video descrive un test di invasione utilizzando un array a tre camere basato sull'impedenza elettrica. Questa tecnica misura il potenziale invasivo delle cellule tumorali sotto l'influenza di fattori solubili secreti dalle cellule stromali residenti nei microambienti tumorali.

Saggio di impedenza basato su array a tre camere: una tecnica di analisi in tempo reale per valutare il potenziale invasivo delle cellule tumorali misurando l'impedenza elettrica

Comunemente utilizzati, sono descritti metodi altamente accessibili per l'esame migrazione cellulare e l'invasione in vitro. Il primo metodo è il saggio chiusura della ferita cella che misura la motilità cellulare. Il secondo metodo è il transwell migrazione e invasione test che valuta la chemiotassi e la capacità invasiva delle cellule.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Questo articolo video descrive un metodo in vitro modificato per esaminare il ruolo di ormoni, citochine e/o fattori di crescita nel guidare l'invasione delle cellule tumorali.

A Modified<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion test per determinare il ruolo potenziale di ormoni, citochine e / o fattori di crescita nella mediazione Cancer Invasion cellulare

Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante.  Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I.  L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.

Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.

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Il saggio di invasione delle cellule in vitro viene utilizzato per misurare il potenziale della metastasi del cancro quantificando il potenziale cellulare per l'invasione e la migrazione utilizzando inserti di coltura cellulare contenenti matrice proteica. Si sfida nommossa alle cellule di migrare attraverso la matrice proteica e una membrana porosa, verso un chemioattraente, e poi quantificate mediante microscopia leggera.

L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

Descriviamo un approccio per rilevare e catturare sottopopolazioni cellulari invasive in tempo reale. Il progetto sperimentale utilizza l'analisi cellulare in tempo reale monitorando i cambiamenti nell'impedenza elettrica delle cellule. Il cancro invasivo, le cellule immunitarie, endoteliali o stromali nei tessuti complessi possono essere catturati e l'impatto delle co-colture può essere valutato.

Rilevamento e acquisizione in tempo reale di sottopopolazioni cellulari invasive da co-colture

Impara a studiare l'invasione tumorale in tre dimensioni utilizzando frammenti di cuore di pollo embrionale. Questo metodo di coltura organotipica permette di testare farmaci anti-invasivi e analizzare l'interazione tra cellule tumorali e tessuto normale.

Invasione Chick Cuore Saggio per il test linvasività delle cellule tumorali e lattività di composti potenzialmente anti-invasive (Video) | JoVE Journal

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