Cosa fare e cosa non fare nella preparazione di Muscle criosezioni per l'analisi istologica

L'obiettivo generale di questa procedura è evitare errori durante la preparazione di sezioni congelate da biopsie muscolari, come la formazione di artefatti da congelamento. Questo risultato si ottiene innanzitutto congelando rapidamente il muscolo in due butani metilici raffreddati con azoto liquido. Dopo che le biopsie muscolari hanno raggiunto l'equilibrio nel criostato, vengono incorporate in una matrice ottimale per il taglio a temperatura ambiente, in piccole quantità, con congelamento rapido mediante raffreddamento a spruzzo ed estrazione di calore.

Vengono quindi tagliate sezioni di sette micron e trasferite su vetrini di vetro positivamente carichi e caldi. L'ultimo passaggio consiste nella colorazione delle sezioni di tessuto, secondo le necessità, per valutarne l'istologia. Alla fine, biopsie muscolari correttamente preparate consentono di ottenere un'istologia del tessuto ben preservata, senza artefatti da congelamento.

Quindi, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la sezione di tessuti inclusi in paraffina, è che è molto rapida e non altera la struttura o la funzione degli antigeni endogeni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella biologia muscolare in condizioni di salute e di malattia, come la crescita, la rigenerazione, l'infiammazione, la fibrosi e la necrosi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia o alla diagnosi dei disturbi muscolari, poiché consente di determinare lo stato del muscolo sano e malato.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su diverse forme di distrofia muscolare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la cachessia associata alle fasi terminali del cancro e dell'AIDS e alla perdita di massa muscolare nelle popolazioni anziane. Iniziare praticando l'eutanasia a un topo mediante un'eccessiva dose di isoflurano sotto una cappa aspirante e in un contenimento di livello secondario, come un barattolo di vetro. Confermare la morte dell'animale premendo con forza sulla pianta del piede.

Ora, inumidire il pelo con alcol al 70%. Questo impedisce che i peli sciolti aderiscano ai muscoli. Procedere quindi staccando la pelle dall'arto utilizzando una pinzetta fine numero cinque.

Separare con attenzione il muscolo di interesse dall'osso a partire dal tendine. In questo caso, viene isolato il tibiale anteriore. Dopo aver escisso il muscolo, ricoprirlo con OCT e appoggiarlo piatto su uno stampo monouso per congelamento etichettato.

Altre OCT verranno aggiunte successivamente prima del taglio. Assicurarsi che il muscolo sia orientato secondo la sua normale posizione fisiologica lungo l'asse dalla testa alla coda e che il muscolo non sia stirato. Ora raffreddare.

Alcuni isopentano in un becher di acciaio utilizzando azoto liquido. Mescolare in modo intermittente per tre-cinque minuti con una spatola di plastica. Quando si forma un precipitato bianco, l'isopentano ha raggiunto la temperatura ottimale; a questo punto, immergere gli stampi caricati nella soluzione.

I muscoli piccoli come il diaframma e l'estensore lungo delle dita richiedono da sei a dodici secondi. I muscoli più grandi richiedono da 15 a 20 secondi, poiché il congelamento eccessivo può provocare crepe. Il passaggio successivo consiste nel posizionare i tessuti congelati su ghiaccio secco per far evaporare l'isopentano residuo, operazione che richiede circa da 15 a 20 minuti.

Una volta che il tessuto è asciutto, avvolgerlo rapidamente nella stagnola e conservarlo in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino al momento del sezionamento. Prima del sezionamento, trasportare i tessuti congelati su ghiaccio secco fino al criostato.

Trasferire il tessuto in una camera del criostato impostata tra meno 24 e meno 20 gradi Celsius e lasciarlo equilibrare per 30 minuti. I tessuti non si scongeleranno completamente a questa temperatura. Successivamente, incorporare prima il tessuto.

Se disponibile, attivare il raffreddamento della Peltier Bay. In secondo luogo, applicare uno strato sottile e uniforme di OCT sul disco del campione e lasciarlo raffreddare. In terzo luogo, una volta che l'OCT si è congelato nella parte inferiore ma è ancora liquido nella parte superiore, inserire il tessuto, orientando il tessuto perpendicolarmente all'OCT per sezioni trasversali e parallelamente all'OCT per sezioni longitudinali.

Ora utilizzare uno spray refrigerante ad aerosol per congelare rapidamente l'OCT. Successivamente, toccare la parte non inclusa del tessuto con un estrattore di calore e mantenerlo a contatto con il tessuto per 45 secondi. Non permettere mai al muscolo di scongelarsi durante questo processo.

Se il criostato non dispone di raffreddamento della vaschetta a effetto Peltier, utilizzare un raffreddamento a spruzzo per congelare rapidamente l'OCT intorno al tessuto. Aggiungere ora un altro strato sottile di OCT intorno al muscolo utilizzando lo spray di raffreddamento a spruzzo ed estrarre il calore come nel passaggio precedente. Continuare ad aggiungere OCT a piccole incrementi e congelare rapidamente l'OCT utilizzando una combinazione di spray di raffreddamento a spruzzo ed estrattore di calore fino a quando l'intero muscolo non sarà ricoperto.

Quindi posizionare l'estrattore di calore sulla parte superiore del blocco di tessuto e attendere cinque minuti prima di procedere con il taglio. Il campione è ora pronto per essere montato sulla testa del campione. Per prima cosa, serrare la manopola per fissare il disco.

Assicurarsi che il disco del campione sia a buon contatto con la testa del campione mentre la camera raggiunge una temperatura compresa tra meno 24 e meno 20 gradi Celsius. Impostare lo spessore della sezione a sette micron quando la camera ha raggiunto la temperatura, quindi iniziare a rifinire il blocco. Utilizzare le regolazioni grossolana e fine per spostare il blocco.

Quando le sezioni sono pronte per essere raccolte, premere i loro lati superiori su vetrini positivamente carichi riscaldati con una lampada. Se congelate correttamente, le sezioni di tessuto dovrebbero apparire bianco gessoso. Tuttavia, un tessuto congelato in modo improprio o scongelato durante il processo di montaggio apparirà di colore rosso fino a rosa.

I vetrini possono essere conservati nel congelatore ultra-basso per analisi future. La sezione centrale del ventre del tessuto può essere identificata misurando l'area della sezione trasversale a partire da immagini in contrasto di fase, utilizzando la funzione di tracciamento di un software per l'analisi delle immagini. Questa analisi fornisce sia la misura dell'area sia quella del diametro minimo di Feret.

Quando queste misurazioni iniziano a stabilizzarsi, si è raggiunta la porzione mediana del ventre. Sebbene i produttori forniscano istruzioni dettagliate per la maggior parte dei protocolli di colorazione, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione personale per ottenere intensità di colorazione ottimali. L'OCT non deve essere rimosso.

Per la colorazione, al fine di ottenere una colorazione immuno ottimale, assicurarsi di utilizzare una camera umidificata. Questa deve essere coperta con perfil posizionato su un tovagliolo di carta bagnato e sigillata in una scatola piccola per evitare l'essiccamento delle sezioni. Durante il processo di colorazione per vetrini permanenti non immuno-colorati, seguendo il protocollo di colorazione, disidratare i vetrini mediante gradazioni crescenti di alcol.

Poiché il mezzo di montaggio non è compatibile con l'acqua, quindi depurare i vetrini con un bagno di cinque minuti in xilolo al 100%. Ciò garantisce che i vetrini non diventino opachi nel tempo. Procedere quindi con il montaggio e l'acquisizione delle immagini delle sezioni della regione mediale del ventre del tibiale anteriore che sono state colorate.

Utilizzando ematina ed eosina. Le sezioni correttamente processate presenteranno una morfologia uniforme e una colorazione omogenea in tutto il campione; al contrario, i muscoli processati in modo inadeguato, danneggiati dal congelamento o scongelati prematuramente, mostrano molteplici interruzioni della morfologia e appaiono simili a fiocchi di grano sminuzzati.

È stata inoltre eseguita l'immunohistochimica su questi campioni. Le colorazioni sono risultate soddisfacenti. La fibronectina è colorata in verde e la dappy appare in blu.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una comprensione approfondita di come preparare un buon taglio congelato da biopsie muscolari per la valutazione dell'architettura muscolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro o cinque ore, se tutti questi passaggi vengono effettuati correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di prevenire lo scongelamento dei muscoli dopo aver completato questa procedura.

Altri metodi, come la colorazione immunoistochimica e l'ibridazione in situ, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardo la crescita e la rigenerazione.