Name: Cosa fare e cosa non fare nella preparazione di Muscle criosezioni per lanalisi istologica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Impara a preparare sezioni congelate di biopsie muscolari evitando artefatti da congelamento. Questo metodo rapido utilizza isopentano raffreddato con azoto liquido e inclusione in OCT per preservare l'integrità istologica del tessuto.

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Vorremmo ringraziare Alex Miller per le revisioni del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto con le borse di ricerca assegnate a M.G. da Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) e Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Raccolta e congelamento dei tessuti muscolari <ol><li> Euthanize il mouse con un sovradosaggio di isoflurano (2-cloro-2- (difluorometossi) -1,1,1-trifluoro-etano). Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante e utilizzare un metodo di contenimento secondario, come un essiccatore o una campana di vetro contenente un batuffolo di cotone imbevuto di isoflurano. </li><li> Confermare la morte con fermezza spremitura zampa. Utilizzare un metodo secondario dell&#39;eutanasia come dislocazione cervicale. </li><li> Bagnare il pelo con il 70% di alcool per ridurre l&#39;incollaggio di ciocche di capelli sciolti sui muscoli. Sbucciare la pelle di dosso l&#39;arto utilizzando una pinza sottile come 5 #. </li><li> Separare cautamente il muscolo di interesse (tibiale anteriore (TA) in questo caso) dalle ossa sotto, partendo dal tendine e rimuovere. </li><li> Accise il muscolo, coprire in OCT (Optimum Cutting composto Temperature), e adagiarlo orizzontalmente su uno stampo di congelamento e getta etichettati. Assicurarsi che il muscolo è al suo normale orientamento fisiologico (testa di tail) senza stiramento. In alternativa, congelare il muscolo su piccole piazze di polistirolo e il pin con perni di insetti al fine di garantire la corretta lunghezza dei muscoli. </li><li> Raffreddare 2-metilbutano (isopentano) in un becher di acciaio con azoto liquido. Questo richiede, in media, 3-5 min. Continuate a mescolare intermittenza fino precipitati bianchi cominciano a formarsi sul fondo e sulle pareti del bicchiere. NOTA: In questo caso, isopentano ha raggiunto la temperatura ottimale di congelamento (-150 ° C) </li><li> Immergere gli stampi contenenti muscoli del refrigerata 2-metilbutano. Congelare piccoli muscoli, come il lungo del diaframma e delle dita (EDL) per 6-12 secondi e muscoli più grandi, come il soleo gastrocnemio (GS) e tricipiti per 15 - 20 sec. Non congelare i muscoli troppo a lungo come questo può portare alla rottura. </li><li> Trasferire i tessuti congelati su ghiaccio secco e lasciare evaporare isopentano (notare che questo processo richiede, in media, circa 15 - 20 min). Avvolgere i tessuti in un foglio di alluminio e memorizzarli in ultra bassa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) fino sezionamento. </li></ol> 2. Incorporare i tessuti in ottobre preparare Tissue Block <ol><li> Tessuti di trasporto su ghiaccio secco per cyrostat per evitare lo scongelamento. Tessuto Trasferimento a criostato camera (impostato a -20 e -24 ° C per evitare la piena scongelamento dei tessuti) e lasciarli equilibrare per 30 min. </li><li> Girare la baia Peltier raffreddamento. Se il criostato non ha questo raffreddamento, utilizzare raffreddamento spray aerosol per congelare rapidamente la Ottobre Non lasciate che il disgelo muscolo in qualsiasi momento durante l&#39;incorporamento come questo può causare danni da congelamento. </li><li> Aggiungere uno strato sottile uniforme ottobre sul disco dei campioni e lasciate raffreddare. Quando la maggior parte della Ottobre è congelato sul fondo mentre ancora liquido sulla parte superiore, inserire il tessuto con l&#39;orientamento corretto (perpendicolare a ottobre per le sezioni trasversali e paralleli a ottobre per le sezioni longitudinali). Usare spruzzi di raffreddamento spray per congelare rapidamente ottobre Toccare la parte unembeded del tessuto con ext caloreRATTORE e attendere 45 secondi. </li><li> Aggiungere un altro strato sottile dell&#39;OCT intorno al muscolo, spruzzare con spray di raffreddamento aerosol ed estrarre il calore nel passaggio precedente. </li><li> Continuare ad aggiungere OCT in piccoli incrementi e rapidamente congelare la OCT utilizzando una combinazione di spray aerosol ed estrattore di calore di raffreddamento fino a quando l&#39;intero muscolo è coperto. </li><li> Mettere l&#39;estrattore di calore sulla parte superiore del blocco di tessuto e attendere per 5 min. </li></ol> 3. Preparazione Sezioni e identificare le sezioni da Mid-pancia Regione dei muscoli <ol><li> Montare il campione sulla testa dei campioni. Serrare la manopola per fissare il disco. Assicurarsi che il disco di preparato è in buon contatto con la testa del preparato. </li><li> Regolare la temperatura della camera tra il -21 e -24 ° C e attendere fino al raggiungimento della temperatura impostata. </li><li> Regolare le impostazioni di spessore (7 micron); tagliare il blocco avanzando o ritraendo il blocco utilizzando le impostazioni grossolane e fini. </li><li> Raccogliere sezioniil pre-riscaldato vetrini da microscopio carica positiva premendo la parte superiore della slitta sulle sezioni, utilizzando l&#39;attrazione tra cariche opposte per facilitare l&#39;adesione delle sezioni tagliate alla diapositiva. </li><li> Identificare sezioni metà pancia misurando sezione trasversale (CSA) delle sezioni. Fare questo software di imaging utilizzando il computer collegato al microscopio. NOTA: le immagini a contrasto di fase sono prese e la circonferenza di tutto il muscolo viene misurata tramite una funzione di traccia sul programma software. Questo produrrà sia CSA nonché diametro minimo ferret (misura della fibra dimensioni trasversali che si esprime come la distanza minima tra due tangenti paralleli sui lati opposti di una particella) misurazioni. Nota: Quando CSA e diametro minimo furetto misure cominciano a stabilizzarsi, a metà pancia è stato raggiunto. </li><li> Inventario e archiviare i vetrini a -80 ° C per il futuro colorazione. NOTA: ottobre non ha bisogno di essere rimosso prima di staininprocedure g. Una volta che le diapositive sono coprioggetto, sono pronti per essere colorati immediatamente. </li></ol> 4. Colorazione NOTA: Durante le procedure dettagliate passo-passo possono essere trovati sulla scheda tecnica del prodotto e devono essere seguite per le procedure di colorazione, ottimizzazione personale può essere richiesto per ottenere la colorazione ottimale. <ol><li> Poiché il montaggio di mezzi (vedi tabella) non è miscibile con acqua, disidratazione diapositive attraverso crescenti gradi di alcool (2 min ciascuno in 70%, 95% e 100% etanolo) e chiaro con xilene (100% per 5 min) per garantire diapositive non diventano opachi nel tempo. </li><li> Coverslip sezioni e lasciarli asciugare. Immagine con il microscopio dotato di software di imaging. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
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<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Istologia e immunoistochimica sono stati utilizzati come strumenti chiave per comprendere la manifestazione e la progressione della patologia in vari disturbi neuromuscolari. Classicamente, biopsie muscolari sono stati fissati prima di formaldeide e poi integrati con paraffina. Mentre fissazione formaldeide conserva l&#39;architettura dei tessuti e permette lo stoccaggio dei tessuti e il trasporto a temperatura ambiente, è inattiva anche enzimi e proteine ​​legami crociati che richiedono ulteriori misure per raggiungere...

L&#39;esame di istologia muscolare gioca un ruolo fondamentale nella comprensione dei diversi tipi di malattie neuromuscolari 1-4. Quando combinato con altre tecniche, permette ai ricercatori di avere una migliore idea della manifestazione e la progressione della patologia e possono anche essere essenziale per valutare l&#39;efficacia di un intervento terapeutico 5-10. Tuttavia, per essere precisi, i tessuti devono essere conservati in modo appropriato in modo da preservare lo stato fisiologico immediatamente prima escissione. Ciò richiede grande attenzione durante la rimozione, la conservazione, il sezionamento, e la colorazione. I tessuti possono essere preparati in due modi diversi per luce studio microscopico. Il primo metodo, fissati in formalina paraffina (FFPE) sezioni, richiede tessuti da fissare nel 10% naturale formaldeide tamponata prima di essere embedded con paraffina 11,12. La fase di fissazione aiuta a preservare la morfologia meglio, ma anche link incrociati pr endogenooteins e perciò necessitano di procedure di recupero antigene intricato per immunostaining ed eliminando la possibilità di colorazione enzimatica su tali sezioni 12. Sezioni congelate, d&#39;altra parte, non devono essere pre-fisso o trasformati; Pertanto, le proteine ​​sono in grado di trattenere conformazioni biologici nativi 13,14. Inoltre, sezioni congelate consentono anche il tempo di risposta rapido, che a volte è necessario, ad esempio nella diagnosi intraoperatoria di sarcomi e altri biopsie chirurgiche 15. Tuttavia, se non fatto correttamente, questo metodo è soggetto a danni dovuti al ghiaccio, che introduce modifiche all&#39;architettura muscolare rendendo sezioni inadatti per l&#39;esame istologico. Questo documento illustrerà il metodo più efficace per preparare biopsie muscolari per raggiungere colorazione ottimale per un esame adeguato.

<table><tbody><tr><td>Criostato</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., telefono dell'ufficio 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Telefono: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus</td></tr><tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Telefono: 1-631-547-8500 Alternative: Immagine J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OTTOBRE</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Fonte alternativa: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Stampo in tessuto monouso</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Alcol etilico</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin 6766007</td><td></td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

cosa fare e cosa non fare nella preparazione di muscle criosezioni per l&#39;analisi istologica

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Valutazione istologica delle biopsie muscolari ha servito come uno strumento indispensabile per la comprensione dello sviluppo e la progressione della patologia di malattie neuromuscolari. Tuttavia, al fine di fare ciò, cura adeguata deve essere presa quando asportare e conservare tessuti per ottenere la colorazione ottimale. Un metodo di conservazione del tessuto comporta fissa tessuti in formaldeide e poi incorporare con la cera di paraffina. Questo metodo mantiene la morfologia bene e consente la memorizzazione a lungo termine a temperatura ambiente, ma è pesante e richiede una gestione di sostanze chimiche tossiche. Inoltre, i risultati di fissazione formaldeide in antigene cross-linking, che richiede protocolli di recupero antigene per immunocolorazione efficace. Al contrario, sezionamento congelati non richiede fissazione e mantiene quindi biologica dell&#39;antigene conformazione. Questo metodo fornisce anche un netto vantaggio in breve tempo di girarsi, il che rende particolarmente utile in situazioni che necessitano di una rapida valutazione istologica come intraoperativa biopsie chirurgiche. Qui si descrive il metodo più efficace di preparazione biopsie muscolari per la visualizzazione con diverse macchie istologiche ed immunologiche.

Il set-up per la raccolta e il congelamento dei tessuti può essere visto in Figura 1. Tessuti asportati devono essere memorizzati su una garza imbevuta di PBS per evitare l&#39;essiccazione (Figura 1A). Quando vengono selezionati i tessuti da utilizzare per l&#39;analisi istologica devono essere immersi in OCT e disposti su stampo crio nell&#39;orientamento corretto e più vicino alla lunghezza fisiologica possibile per garantire morfologia accurata (Figura 1B). Slurry d...

Qui dimostriamo i metodi più efficaci per il congelamento, l'inclusione, la criosezione e la colorazione delle biopsie muscolari per evitare il congelamento degli artefatti.

Cosa fare e cosa non fare nella preparazione di Muscle criosezioni per l&#39;analisi istologica

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è evitare errori durante la preparazione di sezioni congelate da biopsie muscolari, come la formazione di artefatti da congelamento. Questo risultato si ottiene innanzitutto congelando rapidamente il muscolo in due butani metilici raffreddati con azoto liquido. Dopo che le biopsie muscolari hanno raggiunto l'equilibrio nel criostato, vengono incorporate in una matrice ottimale per il taglio a temperatura ambiente, in piccole quantità, con congelamento rapido mediante raffreddamento a spruzzo ed estrazione di calore.Vengono quindi tagliate sezioni di sette micron e trasferite su vetrini di vetro positivamente carichi e caldi. L'ultimo passaggio consiste nella colorazione delle sezioni di tessuto, secondo le necessità, per valutarne l'istologia. Alla fine, biopsie muscolari correttamente preparate consentono di ottenere un'istologia del tessuto ben preservata, senza artefatti da congelamento.Quindi, il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti, come la sezione di tessuti inclusi in paraffina, è che è molto rapida e non altera la struttura o la funzione degli antigeni endogeni. Questo metodo può contribuire a ris

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Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

Questo protocollo descrive una procedura di congelamento tessuti muscolari immergendo direttamente in azoto liquido. Questo protocollo evidenzia anche un nuovo esageratamente che può evitare l'effetto "coperta" di gas azoto quando i contatti di azoto liquido la superficie del tessuto di un campione.

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In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

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