Name: Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging In Vivo: Un modello di singolo vaso Stroke (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Impara a indurre trombosi fotodinamica con Rosa Bengale nella corteccia somatosensoriale del topo usando microscopia confocale in vivo. Questo metodo permette di osservare immediatamente le risposte cellulari post-ictus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da: AG007218 e NIH F32 AG031606.
Le immagini sono state generate nel Core Optical Imaging Facility, che è supportato da UTHSCSA, NIH-NCI P30 CA54174 (CTRC presso UTHSCSA) e NIH-NIA P01AG19316.

Nota: Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale della University of Texas Health Science Center di San Antonio e sono stati coerenti con le linee guida arrivano. 1. anestetizzante per corticale Preparazione <ol><li> Posizionare il mouse in una camera di induzione con 2-3% isofluorano mescolato con l&#39;ossigeno per indurre anestesia. Osservare il calo tasso di respirazione come il mouse è indotta. Stringere la zampa del mouse per determinare se il mouse è pronto per passare al cono. Nota: il livello di anestesia è un passo fondamentale in qualsiasi preparazione in vivo e si deve prestare attenzione a non indurre un livello tale da provocare ischemia globale. </li><li> Una volta che il mouse sia sufficientemente anestetizzato, trasferire l&#39;animale alla chirurgia piattaforma / imaging e mettere il naso del mouse nella cono e applicare 1-1,2% isofluorane a mantenere uno stato anestetizzato. Assicurarsi che il mouse è sdraiata su una temperatura di coriscaldamento pad ntrolled per mantenere la temperatura corporea (37 ° C +/- 0.5 ° C) durante le procedure rimanenti. Posizionare veterinario pomata sopra gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Monitorare la fisiologia del mouse utilizzando un sistema pulsossimetria utilizzando la clip coda o piede fornito con il sistema. Controllare che la frequenza respiratoria è mantenuta tra 50-65 atti / min. Verificare che la frequenza cardiaca rimane tra 300 e 450 bpm e la saturazione di ossigeno viene mantenuta tra 97-98% per garantire la sopravvivenza a lungo termine dell&#39;animale. </li><li> Quando il mouse è adeguatamente anestetizzato, radersi i capelli sul cranio con cesoie elettriche, rimuovere i capelli residui e pulita con betadine, seguito da un tampone di etanolo. Ripetere questa procedura fino a tre volte per garantire un ambiente sterile chirurgico. </li></ol> 2. Procedura chirurgica <ol><li> Con il cuoio capelluto completamente pulito e rasato, fare una incisione di 5 mm del cuoio capelluto del mouse per rivelare il fissu cranicores e per individuare bregma. </li><li> Usare un applicatore di cotone sterile per rimuovere eventuali residui fascia sovrastante il cranio. </li><li> Colla un anello misura in acciaio inox (Figura 1) con tessuto adesivo all&#39;osso sovrastante corteccia parietale utilizzando le coordinate stereotassica di Bregma: -1 a -3 mm e laterale: 2-4 mm. Nota: La colla definisce tipicamente entro 2 minuti dopo il posizionamento dell&#39;anello sull&#39;osso. </li><li> Fissare l&#39;anello al titolare stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e per evitare movimenti durante l&#39;imaging. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione chirurgica grado, lentamente praticare un tratto di 1-2 mm nel cranio con un Dremel simile velocità controllata (Meisinger 3,9 millimetri punta) facendo attenzione a mantenere il livello di zona, è forato. Raggiungere questo obiettivo con un percorso a zig-zag. Per evitare l&#39;accumulo di calore, impostare la velocità di punta al minimo e fate pause frequenti. </li><li> Quando il teschio cranica diventa shinny in apparenza, continua il diradamentodel cranio con una lama di bisturi utilizzando lo stesso andamento a zig-zag per mantenere il livello della superficie assottigliata per facilitare la rimozione regolare di strati sottili del cranio cranica. Utilizzando la punta della lama di bisturi fare piccoli tratti lineari con una leggera pressione per rimuovere gli strati sottili di osso per volta. Continuare questo fino a quando il sistema vascolare è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione. </li><li> Se lo sperimentatore perfora attraverso o rompere il cranio durante il processo di assottigliamento, l&#39;eutanasia degli animali a causa di probabili danni alla corteccia sottostante. Nota: Il cranio mouse è di circa 300 micron di spessore ed è composto da due strati sottili di osso compatto (uno esterno e uno strato interno) e uno strato di osso spugnoso a sandwich tra i due strati di osso compatto. Lo strato esterno dell&#39;osso compatto e più dell&#39;osso spugnoso vengono rimossi nella zona di foratura 5 millimetri conseguente approssimativa strato 50 micron dell&#39;osso compatto rimanente (vedere la Figura 2B). Visualizzione del sistema vascolare farà in modo che la finale intatto cranio diluito è di circa 50 micron di spessore. Il cranio è quindi ancora presente quando assottigliato a questo spessore. </li></ol> 3. Microscopio Set-up <ol><li> Utilizzare un sistema di microscopio invertito (convenzionale, confocale o sistemi a due fotoni) che ha un inverter obiettivo. Nota: È anche possibile utilizzare un microscopio verticale standard. Il fattore limitante sarà lo spazio tra la fase e gli obiettivi. Le modifiche al palco può essere necessario per realizzare questa configurazione. </li><li> Fissare la piattaforma chirurgica / imaging per una fase su misura che si trova oltre la base del microscopio. Nota: La piattaforma è realizzata con un martinetto di laboratorio per consentire il movimento verticale della piattaforma chirurgica / immagini oggetto dell&#39;obiettivo. La presa di laboratorio è montato su una targhetta fissata a quattro pali cilindrici. (Vedi figura 2). </li><li> Posizionare l&#39;inverter obiettivo contenente un 20Xobiettivo nel finestra del cranio. Utilizzare una fonte di luce esterna per trovare la finestra del cranio, cercando attraverso gli oculari del microscopio e posizionare l&#39;obiettivo nell&#39;area imaging. Nota: L&#39;area di esposizione verrà indicata dalla presenza del sistema vascolare. </li><li> Per obiettivi a base d&#39;acqua, usare fluido cerebrale spinale artificiale (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl, 12 mM KH 2 PO 4; 200 mM NaHCO 3; HEPES 30 mM e 100 mM di glucosio) come mezzo a causa della potenziale perdite nella cavità cranica durante l&#39;imaging (Figura 3). </li></ol> 4. Rosa Bengala Dye Preparazione, gestione e induzione di corsa <ol><li> Preparare una soluzione / ml fresco 20 mg di Rosa Bengala in artificiale cerebrali liquido spinale (aCSF); filtrare e sterilizzare prima della somministrazione. Non riutilizzare o conservare la Rose del Bengala, una volta che è stato mescolato. Fare una soluzione fresca per ogni esperimento. </li><li> Dare un iniezione vena 0,1 ml coda della Rosa Bengala mentre sinscatolare finestra cranica con un laser 561 nm a garantire un&#39;adeguata iniezione della soluzione. Nota: Rosa Bengala verrà visualizzato entro 5 secondi dopo l&#39;iniezione nella vascolatura del cervello. L&#39;intero vaso deve essere riempito con Rosa Bengala. </li><li> Dopo l&#39;iniezione adeguato di Rosa Bengala colorante scegliere una nave appositamente per la trombosi base di diametro del vaso (40-80 micron) per garantire la riproducibilità di un determinato volume della lesione. Distinguere tra arterie e vene guardando la direzione del flusso sanguigno: arterie si muoveranno da diametro maggiore di vasi di diametro minore, vene spostano da piccolo a vasi di diametro maggiore. Questo è facilmente realizzabile da visualizzazione una volta Rosa Bengala viene iniettato. </li><li> Modificare l&#39;impostazione del microscopio come segue: <ol><li> Aumentare il tempo di sosta. Nota: Questo può variare a seconda del sistema di microscopio essendo utilizzato. </li><li> Aumentare la potenza del laser al 100%. </li><li> Raccogliere le immagini di sequenza temporale a 1 frame / sec con ilvelocità di scansione massima. </li></ol></li><li> Acquisire il mouse fino un coagulo stabile si forma all&#39;interno del vaso. Nota: Questo si ottiene in genere entro 5 minuti di scansione continua (vedi figura 4). </li><li> Dopo l&#39;induzione di formazione di coaguli con Rose del Bengala, togliere il mouse dalla area di esposizione di nuovo al microscopio da dissezione. Rimuovere con attenzione l&#39;anello in acciaio inox dal cranio cranico. Esaminare la finestra del cranio per qualsiasi sanguinamento. In caso di emorragia, interrompere l&#39;esperimento. </li><li> Utilizzare 6.0 monofilamento di sutura per chiudere l&#39;incisione sul cranio. Inserire pomata antibiotica lungo la linea di sutura per prevenire l&#39;infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore. </li><li> Ritorna il mouse in una camera di recupero dopo la rimozione dal anestetico fino completamente sveglio e liberamente in movimento. </li><li> Ritorna il mouse in una gabbia pulita per ulteriori indagini in un secondo momento. </li></ol> 5. Imaging longitudinale nei giorni successivi <ol><li> Impiegare i seguenti metodi per eseguire l&#39;imaging longitudinale nei giorni successivi dopo photothrombosis. <ol><li> Anestetizzare il mouse come descritto al punto 1 dei metodi. </li><li> Dopo un&#39;adeguata anestesia riaprire il cuoio capelluto, eliminando eventuali suture residui di riaprire la pelle sovrastante il campo dell&#39;imaging precedentemente realizzato. </li><li> Usare un applicatore di cotone sterile per rimuovere eventuali residui fascia sovrastante il cranio. </li><li> Colla un anello misura in acciaio inox (Figura 1) con tessuto adesivo all&#39;osso sovrastante campo dell&#39;imaging precedente. </li><li> Fissare l&#39;anello al titolare stereotassico (Figura 2) per stabilizzare il mouse e per evitare movimenti durante l&#39;imaging. </li><li> Individuare il sistema vascolare alla base del cranio, in precedenza assottigliata. Utilizzare iniezione vena caudale di FITC-destrano per verificare la presenza del coagulo precedentemente determinati. </li><li> Utilizzare 6.0 monofilamento di sutura per chiudere la acisione sul cranio. Inserire pomata antibiotica lungo la linea di sutura per prevenire l&#39;infezione. Iniettare Buprenex (0,05 mg / kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per tre giorni per la gestione del dolore. </li><li> Ritorna il mouse in una camera di recupero dopo la rimozione dal anestetico fino completamente sveglio e liberamente in movimento. </li></ol></li></ol> 6. Verifica della fase di aspirazione (post-mortem) <ol><li> A conclusione di uno studio, verificare stroke volume usando 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione come mostrato in Figura 5. Il metodo completo può essere trovato in 12. </li></ol>

<ol><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17, 497-504 (1985).</li>
<li>Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+in+the+cerebral+microcirculation%3A+effect+of+aspirin+and+other+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents.</a> Circulation Research. 40, 320-328 (1977).</li>
<li>Owens, A. P. 3rd, Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+tissue+factor+that+contribute+to+thrombosis+after+rupture+of+an+atherosclerotic+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+Research%22%5BJournal%5D)">Sources of tissue factor that contribute to thrombosis after rupture of an atherosclerotic plaque.</a> Thrombosis Research. 129, Suppl 2. S30-S33 (2012).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2, 396-409 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Manual+of+stroke+models+in+rats%22">Manual of stroke models in rats</a>. , 332 CRC Press. (2009).</li>
<li>Herz, R. C., Kasbergen, C. M., Hillen, B., Versteeg, D. H., de Wildt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+middle+cerebral+artery+occlusion+by+an+intraluminal+thread+compromises+collateral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Rat middle cerebral artery occlusion by an intraluminal thread compromises collateral blood flow.</a> Brain Research. 791, 223-228 (1998).</li>
<li>Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+brain+ischemia+in+the+rat%3A+methods+for+reproducible+neocortical+infarction+using+tandem+occlusion+of+the+distal+middle+cerebral+and+ipsilateral+common+carotid+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism+%3A+Official+Journal+of+the+International+Society+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism : Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 8, 474-485 (1988).</li>
<li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+stimulation+reduces+cytotoxic+edema+and+brain+infarcts+in+mouse+induced+by+photothrombosis+by+energizing+glial+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor stimulation reduces cytotoxic edema and brain infarcts in mouse induced by photothrombosis by energizing glial mitochondria.</a> PloS One. 5, e14401(2010).</li>
<li>Zheng, D. M., Wewer, J., Lechleiter, J. P. 2Y. 1R. -initiated <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP3R-dependent+stimulation+of+astrocyte+mitochondrial+metabolism+reduces+and+partially+reverses+ischemic+neuronal+damage+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">IP3R-dependent stimulation of astrocyte mitochondrial metabolism reduces and partially reverses ischemic neuronal damage in mouse.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, 600-611 (2013).</li>
<li>Witte, O. W., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+and+remote+effects+of+focal+cortical+infarctions%3A+secondary+damage+and+reactive+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Delayed and remote effects of focal cortical infarctions: secondary damage and reactive plasticity.</a> Advances in Neurology. 73, 207-227 (1997).</li>
<li>Hagemann, G., Redecker, C., Neumann-Haefelin, T., Freund, H. J., Witte, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+long-term+potentiation+in+the+surround+of+experimentally+induced+focal+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Increased long-term potentiation in the surround of experimentally induced focal cortical infarction.</a> Annals of Neurology. 44, 255-258 (1998).</li>
<li>Kramer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTC+staining+of+damaged+brain+areas+after+MCA+occlusion+in+the+rat+does+not+constrict+quantitative+gene+and+protein+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">TTC staining of damaged brain areas after MCA occlusion in the rat does not constrict quantitative gene and protein analyses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187, 84-89 (2010).</li>
<li>Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+basis+for+the+robust+distribution+of+blood+to+rodent+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 12670-12675 (2010).</li>
<li>Nishimura, N., Rosidi, N. L., Iadecola, C., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+collateral+flow+after+occlusion+of+a+single+cortical+penetrating+arteriole%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Limitations of collateral flow after occlusion of a single cortical penetrating arteriole.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30, 1914-1927 (2010).</li>
<li>Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetrating+arterioles+are+a+bottleneck+in+the+perfusion+of+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 365(2007).</li>
<li>Blum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+after+silent+stroke%3A+Hippocampus+and+infarcts+both+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Memory after silent stroke: Hippocampus and infarcts both matter.</a> Neurology. 78, 38-46 (2012).</li>
<li>Heinsius, T., Bogousslavsky, J., Van Melle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+infarcts+in+the+middle+cerebral+artery+territory+Etiology+and+outcome+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Large infarcts in the middle cerebral artery territory Etiology and outcome patterns.</a> Neurology. 50, 341-350 (1998).</li>
<li>Wardlaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+causes+lacunar+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery+%26+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">What causes lacunar stroke.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 76, 617-619 (2005).</li>
<li>Inoue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+under+anticoagulant+therapy%5D.+Rinsho+shinkeigaku%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke under anticoagulant therapy]. Rinsho shinkeigaku.</a> Clinical Neurology. 50, 455-460 (2010).</li>
<li>Tiannan Wang, W. C., Xie, Y., Zhang, W., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Volume+of+the+Focal+Cerebral+Ischemic+Lesion+through+Photothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Controlling the Volume of the Focal Cerebral Ischemic Lesion through Photothrombosis.</a> American Journal of Biomedical Sciences. 2, 33-42 (2009).</li>
<li>Head, B. P., Patel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+brain+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and brain protection.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 20, 395-399 (2007).</li>
<li>Kirsch, J. R., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+and+cerebroprotection%3A+experimental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22International+Anesthesiology+Clinics%22%5BJournal%5D)">Anesthetics and cerebroprotection: experimental aspects.</a> International Anesthesiology Clinics. 34, 73-93 (1996).</li>
<li>Koerner, I. P., Brambrink, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+protection+by+anesthetic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Anaesthesiology%22%5BJournal%5D)">Brain protection by anesthetic agents.</a> Current Opinion in Anaesthesiology. 19, 481-486 (2006).</li>
<li>Gelb, A. W., Bayona, N. A., Wilson, J. X., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propofol+anesthesia+compared+to+awake+reduces+infarct+size+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Propofol anesthesia compared to awake reduces infarct size in rats.</a> Anesthesiology. 96, 1183-1190 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, A., Castro, I. A., Alkayed, N. J., Hurn, P. D., Kirsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic+choice+of+halothane+versus+propofol%3A+impact+on+experimental+perioperative+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+A+Journal+Of+Cerebral+Circulation%22%5BJournal%5D)">Anesthetic choice of halothane versus propofol: impact on experimental perioperative stroke.</a> Stroke; A Journal Of Cerebral Circulation. 32, 1920-1925 (2001).</li>
<li>Barretto, R. P., Messerschmidt, B., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+imaging+with+high-resolution+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence imaging with high-resolution microlenses.</a> Nature Methods. 6, 511-512 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La capacità di tradurre sperimentale corsa fisiopatologia da animale ad applicazione umana è stata colpita con il fallimento. Tuttavia, l&#39;utilizzo di modelli animali, come il modello photothrombosis, permette una migliore comprensione di ictus fisiopatologia e l&#39;esplorazione di nuovi approcci terapeutici per fornire neuroprotezione a seguito di un ictus. Piccoli colpi corticali e microinfarctions prodotte dal modello photothrombotic sono clinicamente rilevanti per subcliniche o &quot;silenzioso&quot; colpo ...

La tecnica descritta consente la visualizzazione delle risposte cellulari in vivo subito dopo l&#39;induzione di Rosa Bengala photothrombosis in un mouse intatto. Rosa Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2 &#39;, 4&#39;, 5 &#39;, 7&#39;-tetraiodofluorescein) è un colorante fotosensibile usato per indurre ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto). A seguito di una iniezione in bolo di RB attraverso la vena della coda e la successiva illuminazione attraverso un cranio diluito con una luce laser 564 nm, un trombo è indotta causando un ictus fisiologica 1. Il metodo è stato originariamente descritto da Rosenblum e El-Sabban nel 1977, ed è stato successivamente adattato da Watson a metà 1980 1,2. In breve, Rosa Bengala viene irradiata con luce verde di eccitazione (laser 561 nm nel nostro caso), che genera la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno, che attiva successivamente fattore tissutale, un iniziatore della cascata coagulativa. L&#39;induzione della cascata coagulativa produce un ischemico lesione che è patologicamente rilevanti per ictus clinica 3. Corsa ha una fisiopatologia complessa a causa della interazione di molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni, glia, endotelio e il sistema immunitario. Scegliere la tecnica migliore per studiare un particolare processo cellulare richiede più considerazioni. Tecniche sperimentali rientrano ampiamente in una delle tre categorie: in vitro, in vivo e in silico con ciascuno che ha vantaggi e svantaggi Gli studi in vitro hanno lo svantaggio principale di rimuovere le cellule dal loro ambiente naturale e quindi non possono riprodurre effetti osservati in un intatto,. animale vivente. Nelle tecniche vivo fornire per la replica sperimentale maggiore di patologie con maggiore rilevanza traslazionale. In silico si riferisce generalmente alla modellazione al computer di una malattia o di processo cellulare, e mentre sempre più utilizzato per studiare potenziali interazioni farmacologiche per esamepio, tutte le informazioni raccolte devono ancora essere testato in cellule o tessuti viventi. Il modello ideale di ictus in ambiente di laboratorio deve dimostrare le caratteristiche patologiche simili a quelli osservati nella popolazione umana. Mentre ci sono caratteristiche fisiologiche comuni di ictus nella popolazione umana, ci sono anche molte differenze a seconda del tipo di lesione sperimentato. Corsa nella popolazione umana si verifica come piccoli o grandi occlusioni dei vasi, lesioni emorragiche, e l&#39;arteria a un&#39;arteria o cardio-embolie che si traducono in vari volumi infarto così come le differenze nei meccanismi relativi a ciascuna patologia. Il vantaggio di utilizzare modelli animali di ictus è la generazione di infarti riproducibili che imitano le caratteristiche di ictus umana. I modelli corsa più comuni animali includono occlusione utilizzando: mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale (metodi incandescenza embolici o endovascolare), che i modelli distale MCAO e il modello photothrombosis. I vantaggi di und svantaggi di ciascun modello sono stati riesaminati altrove (vedi 4 e 5). Modelli globali ischemici (MCAO), mentre relativamente facile da eseguire sono meno rilevanti per ictus umano che sono modelli ictus focali. Inoltre, questi metodi sono molto variabili nell&#39;indurre riproducibili lesioni infarto cerebrale. Il modello photothrombosis è altamente riproducibile finché sperimentatore controlla loro esperimenti bene, fornendo un chiaro vantaggio rispetto ai modelli MCAO. Tuttavia, a causa microcircolo insultare il modello è stato descritto per visualizzare una penombra ischemica minima, l&#39;area in cui le cellule si pensa siano recuperabili 6,7. Inoltre, vasogenico e formazione edema citotossico possono essere indotte dopo irradiazione dell&#39;area imaging. Nonostante queste limitazioni la tecnica ha fornito una nuova visione molti processi fisiologici seguenti ictus 8, 9, 10, 11.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenti</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano Anestetico</td><td>MWI Fornitura Veterinaria</td><td>088-076</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>aCSF&nbsp;</td><td>126 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di NaH2PO4, 2 mM di MgCl2, 2 mM di CaCl2, 10 mM di glucosio e 26 mM di NaHCO3 (pH 7,4).</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Forbici</td></tr><tr><td>da dissezione</td> per attrezzature Prodotti <td>bioindustriali</td><td>500-410</td><td></td></tr><tr><td>Forbici operative 14 cm</td><td>Prodotti bioindustriali</td><td>12-055</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont High Tech #5 style, prodotti</td><td>bioindustriali</td> dritti <td>TWZ-301.22</td><td></td></tr><tr><td>LabJack 132X80</td><td>Optosigma Co</td><td>123-6670</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma per Labjack 8X 8</td><td>Optosigma Co</td><td>145-1110</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per barra auricolare da configurazione stereotassica</td><td>Stoelting/Cyborg</td><td>51654</td><td></td></tr><tr><td>Dispomed Labvent Macchina per anestesia per roditori</td><td>DRE, Inc.</td><td>15001</td><td></td></tr><tr><td>Tech IV Vaporizzatore di isoflurano</td><td>DRE, Inc.</td><td>34001</td><td></td></tr><tr><td>F Bomboletta d'aria</td><td>DRE, Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di respirazione del circuito del bain</td><td>DRE, Inc</td><td>86111B</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per roditori per tubo del bain</td><td>DRE, Inc</td><td>891000</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore O2 per serbatoi di ossigeno</td><td>DRE, Inc</td><td>CE001E</td><td></td></tr><tr><td>Camera di induzione per roditori</td><td>DRE, Inc</td><td>15004C</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Silk 6-0; 18 pollici con ago P-3</td><td>Suture Express</td><td>1639G</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo inverter Adattatore ottico Tecnologie</td><td>LSM Trapano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a doppio voltaggio 110/120</td><td>Foro</td><td>134,53</td><td></td></tr><tr><td>Meisinger Punta da trapano da 3,9 mm</td><td>Meisinger</td><td></td> <td>(Ref#310 104 001 001 009)</td></tr></tbody></table>

rosa bengala photothrombosis da confocale optical imaging<em&gt; in vivo</em&gt;: un modello di singolo vaso stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Le tecniche di imaging in vivo sono aumentate nell'utilizzo a causa dei recenti progressi nei coloranti di imaging e nelle tecnologie ottiche, consentendo la capacità di visualizzare eventi cellulari in un animale intatto. Inoltre, la capacità di indurre stati patologici fisiologici come l'ictus in vivo ne aumenta l'utilità. La tecnica qui descritta consente la valutazione fisiologica delle risposte cellulari all'interno del SNC a seguito di un ictus e può essere adattata ad altre condizioni patologiche in fase di studio. La tecnica presentata utilizza l'eccitazione laser del colorante fotosensibile Rose Bengal in vivo per indurre un evento ischemico focale in un singolo vaso sanguigno. 
Il protocollo video dimostra la preparazione di una finestra cranica sottile sopra la corteccia somatosensoriale in un topo per l'induzione di un evento fototrombotico di Rose Bengal, mantenendo al minimo il danno alla dura materia sottostante e al cervello. La preparazione chirurgica viene inizialmente eseguita sotto un microscopio da dissezione con una piattaforma chirurgica/di imaging su misura, che viene poi trasferita a un microscopio confocale dotato di un adattatore per obiettivo invertito. Vengono presentate immagini rappresentative acquisite utilizzando questo protocollo e sequenze time-lapse dell'induzione dell'ictus. Questa tecnica è potente in quanto la stessa area può essere visualizzata ripetutamente nei giorni successivi, facilitando gli studi longitudinali in vivo dei processi patologici successivi all'ictus.

Lo scopo di questo metodo è di indurre un ictus ischemico in modelli animali (topo e ratto) a seguito di un bolo di RB attraverso la vena della coda e successiva illuminazione di un cranio diluito con una luce laser 561 nm. Le immagini in Figura 4 mostrano la progressione della formazione del coagulo in un unico recipiente dopo irradiazione dell&#39;area a 0, 1, 1,5 e 2 min. Prima di formazione di coaguli l&#39;intero vaso è bianco a causa di flusso libero Rosa Bengala. Dopo l&#39;induzione di irradiazi...

Qui, descriviamo un approccio di microscopia ottica semi-invasiva per l'induzione di un coagulo fototrombotico di Rose Bengal nella corteccia somatosensoriale di un topo in vivo. Vengono descritti gli aspetti tecnici della procedura di imaging, dall'induzione di un evento fototrombotico all'applicazione e alla raccolta dei dati.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare un approccio di microscopia ottica semi-invasivo per indurre un coagulo foto-trombotico con rose bengala nella corteccia somatosensoriale di un topo. Questo viene ottenuto anestetizzando il topo e preparando una finestra cranica a cranio sottile per l'immagine. Successivamente, viene iniettato il rose bengala e un laser viene utilizzato per indurre la foto-trombosi.In definitiva, gli effetti del coagulo prodotto dalla foto-trombosi con rose bengala possono essere analizzati immediatamente dopo il risveglio dall'anestesia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di osservare in vivo le risposte cellulari immediatamente dopo l'induzione della foto-trombosi con rose bengala. Gli individui alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà nella creazione della finestra cranica a cranio sottile, poiché si tratta di una procedura complessa e dispendiosa in termini di tempo.Per iniziare, anestetizzare il topo con il 2-3% di isoflurano mescolato con ossigeno. Osservare una diminuzione della frequenza respiratoria durante l'induzione dell'anestesia. Successivamente, pizzicare la zampa del topo.Per confermare lo stato anestetico, utilizzare un tappetino riscaldante e una sonda di temperatura per mantenere la temperatura corporea entro mezzo grado rispetto a 37 °C per tutta la durata della procedura. Applicare quindi un unguento oftalmico per monitorare i parametri vitali dell'animale. Applicare un sistema di ossimetria alla coda o al piede.Regolare l'anestetico per mantenere da 50 a 65 respiri al minuto e una frequenza cardiaca compresa tra 300 e 450 battiti al minuto. La saturazione di ossigeno deve essere mantenuta idealmente tra il 97 e il 98%. Se tutti questi parametri vengono mantenuti, è possibile una sopravvivenza a lungo termine. Infine, preparare la cute all'intervento chirurgico.Rasare i capelli dal cranio e pulire la pelle con ripetuti passaggi di Betadine, seguiti da etanolo. Iniziare l'intervento chirurgico con un'incisione di cinque millimetri nel cuoio capelluto per esporre la sutura cranica. Rimuovere la fascia sovrastante con un bastoncino di cotone e localizzare il bgma.Successivamente incollare. Un anello in acciaio inox su misura sull'osso sovrastante la corteccia parietale. Mappare questa posizione dalla bma spostandosi da meno uno a tre millimetri in senso orizzontale e da più due a quattro millimetri in senso laterale.Dopo due minuti, la colla si sarà indurita. A questo punto, fissare l'anello a un supporto stereotassico per stabilizzare l'animale. Ora, sotto un microscopio chirurgico da dissezione, praticare lentamente un'apertura di uno-due millimetri nel cranio sopra la corteccia somatosensoriale. Utilizzando un modello di foratura a zigzag, assicurarsi di mantenere il cranio in piano durante la foratura per evitare l'accumulo di calore.Utilizzare il trapano a bassa velocità e fare pause frequenti quando l'osso inizia a brillare. Continuare a trapanare seguendo un modello a zigzag per assottigliare il cranio. Una finestra cranica sottile è fondamentale affinché il laser raggiunga il vaso riempito con rose bengala e induca la formazione del coagulo.Quando la finestra è sufficientemente sottile, utilizzare un bisturi per eseguire piccoli tagli lineari con pressione leggera, rimuovendo strati sottili di osso fino a quando la vascolarizzazione non risulti chiaramente visibile attraverso l'oculare. Per acquisire immagini del cervello, utilizzare un microscopio che abbia spazio sufficiente tra l'obiettivo e il piano per ospitare l'animale sulla sua piattaforma. Uno stereomicroscopio invertito rappresenta una buona scelta.La piattaforma è progettata per adattarsi a una struttura personalizzata composta da un sollevatore montato su una piastra con quattro aste. Dopo aver posizionato il topo sulla struttura, posizionare l'invertitore dell'obiettivo sopra la finestra cranica, quindi illuminare il cranio con una sorgente luminosa esterna. Se si utilizza un obiettivo ad immersione in acqua, il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) deve essere applicato nella cavità della finestra cranica, all'interno della quale può essere abbassato l'obiettivo.Ora concentrarsi sull'area di imaging con vascolarizzazione visibile. Dopo aver posizionato il mouse al microscopio, preparare il rose bengal fresco in liquido cefalorachidiano artificiale a 20 milligrammi per millilitro, filtrare, sterilizzare la miscela e smaltirla al termine dell'esperimento. Deve essere sempre utilizzato fresco.Ora, mentre si esegue la scansione della finestra cranica con un laser a 561 nanometri, iniettare 0,1 millilitri della miscela attraverso la vena della coda. Entro cinque secondi, il colorante dovrebbe essere facilmente visibile nella vascolarizzazione cranica. Dopo aver iniettato una quantità sufficiente di colorante, selezionare un vaso di 40-80 micron per indurre trombosi.Le arterie possono essere differenziate dalle vene in base al flusso da vasi più grandi a vasi più piccoli e viceversa. Prepararsi ora a irradiare con il laser il vaso selezionato. Aumentare il tempo di permanenza al valore appropriato per il sistema in uso.Aumentare la potenza del laser al 100% e impostare l'acquisizione delle immagini su un fotogramma al secondo. Con la velocità di scansione massima, scansionare il topo fino alla formazione di un coagulo stabile. Di solito ciò richiede circa cinque minuti.In linea ideale, dovrebbe essere scansionato un solo campo visivo per creare il coagulo; scegliere quindi l'obiettivo in modo appropriato. Se non si forma alcun coagulo, provare ad aggiungere ulteriore colorante una volta che il coagulo si è formato. Rimuovere il topo dall'area di acquisizione immagini e prepararsi a completare l'intervento chirurgico sotto il microscopio stereoscopico.Prima di tutto, rimuovere con attenzione l'anello verificando la presenza di sanguinamento. Se si verifica qualsiasi sanguinamento, l'esperimento deve essere interrotto. Successivamente, utilizzando un punto di sutura in 6-0, chiudere l'incisione, quindi applicare un antibiotico sulla linea dell'incisione per alleviare il dolore.Somministrare iniezioni sottocutanee di bup printex per tre giorni dopo aver effettuato la prima iniezione di bnx. Posizionare il topo in una camera di recupero e monitorarlo fino a quando non sarà in grado di deambulare. Successivamente, riposizionarlo nella sua gabbia d'origine, che deve essere pulita.L'imaging longitudinale è descritto dettagliatamente nel protocollo testuale. Utilizzando questo protocollo, gli ictus sono stati indotti formando coaguli nei vasi cranici. La formazione dei coaguli si è sviluppata nell'arco di diversi minuti.Inizialmente, il vaso era completamente bianco; con l'irradiazione graduale della rosa di bengala, il colorante ha prodotto specie reattive dell'ossigeno, attivando così una risposta immunitaria che ha indotto la formazione di un coagulo. L'occlusione completa del vaso è stata osservata in seguito all'accumulo della rosa di bengala nel tratto vascolare a monte del coagulo. Per confermare che fosse stato indotto un ictus ischemico a causa del coagulo sanguigno.La colorazione con TTC è stata utilizzata per rilevare l'infarto cerebrale. I tessuti sani formano prodotti di colore rosso. Le aree infartuate, invece, non reagiscono e rimangono bianche; l'evidenza di un ictus era chiaramente visibile già a cinque giorni dopo l'intervento.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un topo e indurre una foto-trombosi con rose bengala in un topo integro seguendo questa procedura. Altri metodi, come il caricamento del cervello con altri coloranti per imaging come flow four, potrebbero aiutare a rispondere a ulteriori domande, ad esempio: come risponde il calcio a un evento ischemico?

rose-bengal-photothrombosis-confocal-optical-imaging-vivo-model

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Talley Watts, L., et al. Fototrombosi del Rose Bengal mediante imaging ottico confocale in vivo: un modello di ictus a vaso singolo. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra una tecnica per indurre la formazione di coaguli di sangue nel cervello di un topo. Un topo anestetizzato con una finestra cranica e un cranio assottigliato va incontro a fototrombosi attraverso l'attivazione di un colorante fotosensibile utilizzando luce ad alta intensità. Questo processo genera specie reattive...

 Induzione della formazione di coaguli di sangue nel cervello del topo utilizzando un colorante fotosensibile

Photothrombosis è una tecnica rapida, mini-invasiva per indurre le piccole e ben delimitate del miocardio in aree di interesse in modo altamente riproducibile. È particolarmente adatto per studiare risposte cellulari e molecolari alla base della plasticità cerebrale in topi transgenici.

Ischemia Photothrombotic: un modello fotochimico lesione corticale minimamente invasiva e riproducibile per mouse Studi Stroke

Questo protocollo descrive l'applicazione della tomografia combinata a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) imaging e micro-computerizzata (microCT) per la visualizzazione tromboembolie cerebrale. Questa tecnica consente la quantificazione del carico trombotico ed evoluzione. La tecnica di imaging NIRF visualizza fluorescente trombo nel cervello asportato, mentre la tecnica microCT visualizza trombo all'interno gli animali viventi utilizzando oro-nanoparticelle.

Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie

I modelli tradizionali di ictus fototrombotico (PTS) inducono principalmente aggregati piastrinici densi con un'elevata resistenza al trattamento litico con attivatore tissutale del plasminogeno (tPA). Qui viene introdotto un modello PTS murino modificato co-iniettando trombina e colorante fotosensibile per la fotoattivazione. Il modello PTS potenziato con trombina produce coaguli misti piastrina:fibrina ed è altamente sensibile alla trombolisi tPA.

Un modello di ictus fototrombotico arricchito di fibrina e sensibile al tPA

Qui è descritto il modello di ictus fototrombotico, in cui un ictus viene prodotto attraverso il cranio intatto inducendo l'occlusione microvascolare permanente utilizzando l'illuminazione laser dopo la somministrazione di un colorante fotosensibile.

Modellazione dell'ictus nei topi: lesioni corticali focali da fototrombosi

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Questo lavoro dimostra l'uso di una piattaforma di imaging multimodale basata su ultrasuoni per l'imaging non invasivo dell'ictus ischemico. Questo sistema consente la quantificazione dell'ossigenazione del sangue attraverso l'imaging fotoacustico e la perfusione alterata nel cervello attraverso l'angiografia acustica.

Tomografia fotoacustica, ecografica e angiografica integrata (PAUSAT) per l'imaging non invasivo dell'intero cervello dell'ictus ischemico

Questo protocollo contiene una descrizione dettagliata di un approccio passo dopo passo per un modello murino a finestra cranica cronica e embolia microvascolare, ottimizzato per la microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti al polistirene.

Modello murino per embolia microvascolare per microscopia a due fotoni in vivo utilizzando microsfere fluorescenti di polistirene

Utilizzando un approccio completamente ottico, l'ictus ischemico viene indotto registrando contemporaneamente l'attività neuronale del Ca2+ utilizzando un biosensore fluorescente nel nucleo emergente dell'ictus di un topo sveglio e in comportamento.

Fototrombosi simultanea e fotometria delle fibre per indurre e monitorare l'ictus ischemico nei topi comportanti

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

Impara a indurre trombosi fotodinamica con Rosa Bengale nella corteccia somatosensoriale del topo usando microscopia confocale in vivo. Questo metodo permette di osservare immediatamente le risposte cellulari post-ictus.

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging

Esplora altri video