Name: Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Impara il trapianto ortotopico dell'aorta addominale nel topo per studiare il rigetto vascolare e l'arteriosclerosi da trapianto. Questo modello murino permette di analizzare l'ispessimento intimale e il restringimento luminale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research e Heart and Stroke Foundation of BC &amp; Yukon (CCM).

Tutti i protocolli di questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico per la cura degli animali Simon Fraser University. Utilizzare Balb / CYJ (H2 d) topi donatori e topi C57BL / 6 (H2 b) destinatario per esaminare le reazioni allogeniche. I topi sono utilizzati per esperimenti di età compresa tra 8 a 12 settimane tra. Utilizzare i topi o sesso femminile o maschile. Controlli singenico costituiti da segmenti aortici da C57Bl / 6 donatori in C57BL / 6 destinatari. 1. donatore e del ricevente Preparazione Nota: Sia il donatore e il ricevente sono anestetizzati e preparati prima della chirurgia per ridurre al minimo l&#39;ischemia dell&#39;innesto. Anestetici iniettabili sono utilizzati nel protocollo per impedire l&#39;ostruzione dell&#39;animale da attrezzature necessarie per l&#39;erogazione di anestetici inalatori. Tuttavia, se desiderato, l&#39;anestetico inalato è un&#39;alternativa appropriata. Dalla iniezione iniziale degli anestetici, l&#39;intera procedura richiede circa 90 minuti per completare. Tempo ischemica dell&#39;innesto è meno than 30 min. <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg, 1 mg / ml). Il mouse sarà sedato entro 10 o 15 minuti. Valutare la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la parte grassa del pad piede animale. Somministrare 1/3 della dose originale del cocktail anestetico, come necessario, fino a quando l&#39;animale non presenta recesso reflex. Monitorare la frequenza respiratoria strettamente dopo ogni cocktail viene somministrato. Durante l&#39;intervento, valutare il livello di anestesia ogni 15 minuti pizzicando la parete addominale anteriore con un paio di pinze. I topi dovrebbe rimanere profondamente anestetizzati per 60 a 90 min. </li><li> Lubrificare gli occhi del topo con una pomata oftalmica per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Radere capelli come vicino alla pelle il più possibile sulla regione ventrale addominale dalla metà del torace al pube. Prestare particolare attenzione a non nick tutta la pelle. Non usare la crema depilatoria perché può essere assorbito into la pelle e potrebbe essere infiammatorio. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina su un asciugamano sopra il tavolo riscaldamento o pad. </li><li> Pulire il sito chirurgico con uno scrub preliminare con il 2% clorexidina. Preparare una grande area di lavoro per massimizzare il campo chirurgico. Avviare lavaggio al centro del sito chirurgico e spostare verso l&#39;esterno in modo lineare o circolare. Smaltire la garza. Ripetere questa procedura almeno 5 volte di più. Applicare un tampone di alcool preparazione alla stessa area. Una volta che l&#39;alcol è asciutto, preparare l&#39;area pulita con una soluzione di Betadine e drappeggio con garza sterile. </li></ol> Anastomosi procedura 2. end-to-end <ol><li> Donor Operazione <ol><li> Mantenere tecnica asettica durante tutta l&#39;operazione. Pulire tutte le superfici del controsoffitto e da tavolo chirurgico con 0,5% di soluzione di perossido di idrogeno accelerato prima dell&#39;uso. Avvolgere e autoclave tutti chirurgiche strumenti, garze, tende e abiti prima dell&#39;uso. Verificare la sterilità degli strumenti con un bagno turcostriscia indicatrice sterilizzatrice posto in ogni confezione. Guanti chirurgici sterili vengono usati e smaltiti tra interventi chirurgici. In caso di più interventi chirurgici, sterilizzare gli strumenti chirurgici tra impieghi con il caldo perle di vetro sterilizzatore. </li><li> Posizionare il mouse donatore in posizione supina su una superficie pulita, consiglio plexiglas sottile avvolto con telo sterile sotto il microscopio operatorio a 8-30X ingrandimento. </li><li> Dopo aver verificato l&#39;anestesia chirurgica adeguati come indicato nella sezione 1.1, procedere con un intervento chirurgico. </li><li> Utilizzando forbici sterili, fare un unico mediana inferiore incisione longitudinale addominale, dal pube al processo xifoideo. </li><li> Usando un piccolo divaricatore, aprire le pareti addominali per esporre la cavità. </li><li> Utilizzando cotone sterile con punta applicatori, ritrarre delicatamente l&#39;intestino superiormente all&#39;animale di sinistra e coprire con una garza inumidita con soluzione fisiologica. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente e individuare sottorenale e la vena cava inferiore (IVC). Moisdieci tessuti esposti periodicamente con soluzione salina. </li><li> Utilizzando i No. medico 5 pinze, separare l&#39;aorta dal IVC, dal livello dell&#39;arteria renale sinistra alla biforcazione. Utilizzare 10-0 monofilamento poliammide per legare i piccoli rami in prossimità dell&#39;aorta. </li><li> Una volta aorta del donatore è stato separato dal IVC, saturare il recipiente con soluzione salina, coprire la cavità esposta con garza inumidita e impostare il donatore parte su una zona sterile. Controllare lo stato del donatore (funzione respiratoria e cardiovascolare, e la profondità dell&#39;anestesia) ogni 15 min. Inizia operano sul destinatario, isolando l&#39;aorta come descritto di seguito (passaggi da 2.2.1 a 2.2.7). </li><li> Una volta che l&#39;aorta destinatario è stato separato dal IVC e mettere da parte, restituire il donatore sotto il microscopio. Morsetto a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) dell&#39;aorta donatore, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti 4 millimetri microvascolari. </li><li> Utilizzando le microscissors Vannas-Tübingen,transezione un piccolo segmento graft (3 a 4 mm di lunghezza) dell&#39;aorta addominale. </li><li> Utilizzando un ago 25 G 5/8 attaccato ad una siringa, svuotare l&#39;aorta escissa con eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina. Assicurare la punta dell&#39;ago non venire a contatto con il recipiente. </li><li> Luogo aorta in eparina (100 U / ml) di soluzione salina in ghiaccio e mettere da parte. Mentre era ancora sotto anestesia profonda, rilasciare i morsetti microvascolari. Euthanize il donatore per dissanguamento. </li><li> Impiantare la nave cedente entro 30 min di escissione. Anche se è possibile utilizzare una nave cedente per più destinatari escissione una lunghezza maggiore di aorta, mantenere il tempo ischemico per meno di 30 min. </li></ol></li><li> Operazione Destinatario <ol><li> Mantenere asettiche durante l&#39;operazione, come nel funzionamento donatore. </li><li> Posizionare il mouse destinatario in posizione supina su una tavola di plexiglas sottile avvolto con telo sterile sotto il microscopio operatorio a 8-30X ingrandimento. </li><li> After garantire un&#39;adeguata anestesia, procedere con la chirurgia quando l&#39;animale non presenta ritiro reflex. </li><li> Utilizzando forbici sterili, fare un unico mediana inferiore incisione longitudinale addominale, dal pube al processo xifoideo. </li><li> Usando un piccolo divaricatore, aprire le pareti addominali per esporre la cavità. </li><li> Utilizzando cotone sterile con punta applicatori, ritrarre delicatamente l&#39;intestino superiormente all&#39;animale di sinistra e coprire con una garza inumidita con soluzione fisiologica. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente e individuare sottorenale e IVC. Bagnare i tessuti esposti periodicamente con soluzione salina. </li><li> Separare l&#39;aorta dal IVC, dal livello dell&#39;arteria renale sinistra alla biforcazione. Se necessario, utilizzare 10-0 suture monofilamento poliammide per legare i piccoli rami vicino l&#39;aorta. </li><li> Morsetto a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) dell&#39;aorta, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti 4 millimetri microvascolari. </li><li> Utilizzando le microscissors Vannas-Tübingen, fare un unico aortotomy orizzontale e resecare un piccolo segmento (non più di 0.5 mm) dell&#39;aorta addominale per accogliere il donatore trapianto aortica. </li><li> Lavare l&#39;aorta escissa con eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina. Il trapianto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare le estremità aortica transected del destinatario. </li><li> Posizionare il donatore trapianto aortica in posizione ortotopica e anastomosi fine innesto del donatore alla fine del destinatario, che corrisponde con la graft orientamento anatomico con quello del destinatario. </li><li> Afferrare il externa tunica della nave e rovesciare leggermente con le pinze No.5 mediche. Utilizzando le pinze, guidare l&#39;ago per il gol del 10-0 poliammide monofilamento sutura attraverso l&#39;intero spessore della parete del vaso, al fine di garantire l&#39;innesto aortico donatore nave resezione del destinatario. Prestare attenzione al fine di garantire che l&#39;apertura nave non è chiusa a causa to cucitura involontaria della parete di fondo del recipiente. </li><li> Per punti continui, posizionare suture alle 9 entrambe le estremità superiore ed inferiore dell&#39;innesto. Partendo all&#39;estremità superiore dell&#39;innesto dalle 3, anastomosi le estremità resecate con 2 suture corsa e fissare la sutura al soggiorno suture. <ol><li> Capovolgere l&#39;innesto sopra e continuare la sutura corsa per dorsale parte della nave, incontrando il soggiorno provenienza di sutura. Fissare senza applicare molta pressione sulla nave. Ripetere la sutura per l&#39;anastomosi inferiore. Nota: i punti staccati iniziano allo stesso modo come la sutura continua con l&#39;eccezione che la nave è anastomizzato con tre punti separati fra le suture. Tempo anastomosi è di solito di 20 min. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;anastomosi è completa, rilasciare il morsetto microvascolare distale per permettere al sangue di fluire retrogrado e controllo delle perdite dei siti anastomizzato. Se vi è una perdita, immediately posizionare un punto di chiudere il sito difettoso. Se non c&#39;è sanguinamento nei siti, quindi rilasciare il morsetto prossimale. </li><li> Esaminate il trapianto e verificare che non vi siano ostacoli sangue nel trapianto, e prossimale e distale del vaso del destinatario. Vigoroso modello impulso nel recipiente sia il destinatario del donatore e di una indicazione primaria che il sangue scorre liberamente. Utilizzando la coppia di pinze, afferrare delicatamente un&#39;estremità delle suture e rovesciare leggermente il vaso di ispezionare la parete di fondo del recipiente. Nota: Non ci dovrebbero essere increspature della parete del vaso ad entrambe le estremità dei siti anastomizzato. Scadente flusso sanguigno dopo la rimozione dei morsetti è un segno di trombosi. </li><li> Utilizzando cotone punta applicatori, restituire l&#39;intestino nella cavità addominale. </li><li> Con il porta-aghi Castroviejo e pinze Graefe, chiudere la parete addominale con 5-0 punti di sutura in polipropilene con cucitura continua. Chiudere lo strato di pelle con la stessasuture con chiusura sottocuticolare. </li><li> Somministrare immediatamente Torbugesic (1 mg / kg) im al termine del trapianto. </li><li> Dare immediatamente, nell&#39;ordine, Atipamezolo (1 mg / kg), ketoprofene (5 mg / kg) e riscaldato soluzione sottocutanea Ringer lattato. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;intervento chirurgico, collocare topi in una gabbia riscaldato sotto una coperta acqua per una notte (12 ore). Durante il periodo di anestetico recupero, posizionare gli animali da solo in un ambiente pulito zona libera asciutta,. Linea gabbia (autoclave) con carta assorbente pulita e regolare la temperatura della coperta di acqua a circa 20 a 22 ° C. Fornire crocchette secche e umide ad libitum sul pavimento della gabbia. Nota: Una componente importante di cura post-chirurgica è l&#39;osservazione dell&#39;intervento animali e opportuno, come richiesto, durante il recupero da anestesia e chirurgia. L&#39;intensità necessaria di monitoraggio varia con l&#39;animale e potrebbe essere maggiore durante il periodo di recupero anestetico immediato come compared a tardi nel recupero post-operatorio. </li><li> Continuamente controllare gli animali che hanno subito l&#39;anestesia monitorati fino a che non guariscono completamente. L&#39;animale deve essere in grado di mantenere senza aiuto decubito sternale e deve apparire calmo e priva di dolore prima di poter essere lasciato incustodito. </li><li> Dare buprenorfina (0,1 mg / kg BID) e ketoprofene (5 mg / kg SID) per un periodo di tre giorni, sia per via sottocutanea. </li><li> Monitorare cardiovascolare e la funzione respiratoria, la temperatura corporea, e il dolore post-operatorio o disagio durante il recupero dall&#39;anestesia per un minimo di tre giorni. Cura supplementare può essere richiesto, come ad esempio la somministrazione di analgesici e altri farmaci, e liquidi per via parenterale per ridurre al minimo la disidratazione e la perdita di elettroliti. </li><li> Valutare il successo della chirurgia dei trapianti osservando la funzione motoria degli arti posteriori. Completa il successo del trapianto comporta ostruita flusso di sangue al dell&#39;arto posteriore e la coda, che dovrebbe essere immediata recupero del Animal, e il recupero completo senza paralisi degli arti posteriori il secondo giorno </li></ol></li></ol> 3. Tissue Collection Nota: punti finali predeterminata gamma 3-60 giorni a seconda del tipo di analisi desiderata e la natura del disallineamento antigene. In generale, ispessimento intimale è robusto a 30 giorni dopo il trapianto attraverso complete MHC ceppi di topi non corrispondenti. <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg, 1 mg / ml). Valutare la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la parte grassa del pad piede animale. Procedere con la chirurgia quando l&#39;animale non presenta ritiro reflex. </li><li> Pulire il sito chirurgico con acqua e termina con il 70% di alcol. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina su un vassoio rivestito con tampone assorbente. </li><li> Aprire la cavità addominale con una incisione longitudinale grande linea mediana. Posizionare un divaricatore di auto-mantenimento per esporre la cavità, l&#39;una IVCd l&#39;aorta addominale. </li><li> Separare delicatamente il segmento aortico donatore trapiantato dalla vicina IVC con un paio di n medico 5 pinze. Prestare particolare attenzione a non mettere a nudo l&#39;avventizia della nave trapiantato. </li><li> Esporre la cavità toracica tagliando attraverso le nervature lungo entrambi i lati della colonna vertebrale toracica fino toracico. Riflettere parete toracica anteriore superiormente per esporre il pericardio e fissare la gabbia toracica con un paio di emostatico. </li><li> Una volta che il cuore è esposto, inserire un ago 25 G 5/8 (attaccato ad una siringa) nel ventricolo sinistro ea filo con 0,1 ml di soluzione salina eparinizzata (100 U / ml). </li><li> Utilizzando un paio di forbici, rimuovere l&#39;atrio destro per permettere al sangue, soluzione salina eparinizzata e fissativo per lasciare il corpo durante la perfusione. Profumato l&#39;animale con 5 ml di paraformaldeide al 4% o fino a quando viene eseguito il liquido chiaro. Rimuovere il cuore al fine di garantire l&#39;eutanasia. </li><li> Excise trapiantato segmento nave e immergere nel 4% paraformaldeide per non più di un&#39;ora. Impostare la nave trapiantato in OCT (temperatura ottimale di taglio) matrice e flash freeze. Sezione della nave in un criostato fissato a 8 spessori um. Sezioni Macchia con Ematossilina e eosina e / o Verhoeff-van Gieson (van Gieson) macchia elastico. </li></ol> 4. Analisi morfologica di innesti Nota: TA è caratterizzata da ispessimento intimale 13. In questo modello, ispessimento intimale e una conseguente riduzione delle dimensioni del lume sono riflettenti della gravità delle lesioni vascolari immuno-mediata. Controlli Syngraft vengono utilizzati per determinare le caratteristiche di base delle navi, in assenza di risposte immunitarie allogenici. Questi controlli permettono anche la valutazione del danno arterioso che si verifica come risultato della procedura chirurgica. Non ci dovrebbero essere ispessimento intimale in syngrafts. <ol><li> Per esaminare ispessimento intimale e luminale occlusione, misurare l&#39;area all&#39;interno della cellula endotelialestrato, lamina interna elastica (IEL) e lamina elastica esterna (EEL) su elastici van Gieson segmenti delle arterie macchiato con un software di analisi delle immagini. I parametri di seguito possono essere utilizzati per determinare i cambiamenti arteriosi riflettenti di TA. <ol><li> Misurare l&#39;area intimale assoluto: area all&#39;interno della lamina elastica interna - l&#39;area all&#39;interno dello strato di cellule endoteliali. Ciò fornisce una misura assoluta di espansione intimale, che è il segno distintivo di TA. </li><li> Misurare l&#39;area mediale assoluto: area all&#39;interno della lamina elastica esterna - area all&#39;interno della lamina elastica interna. Questo fornisce una misura assoluta di degradazione mediale o di crescita, che occasionalmente può verificarsi a seguito di variazioni immunomediate a questa regione della parete del vaso. </li><li> Misurare l&#39;area totale del vaso come l&#39;area all&#39;interno della lamina elastica esterna. Questo fornisce una misura del rimodellamento nave che coinvolge espansione o costrizione di un&#39;arteria a causa di danno immunologico. </li><li> Misural&#39;intima / Media: (area all&#39;interno della lamina elastica interna - area all&#39;interno dello strato di cellule endoteliali) / (area all&#39;interno della lamina elastica esterna - area all&#39;interno della lamina elastica interna). Ciò fornisce una misura relativa di espansione intimale e normalizza le differenze di dimensioni delle navi. </li><li> Misurare la Restringimento% Luminal: [(area all&#39;interno della lamina elastica interna - area all&#39;interno dello strato di cellule endoteliali) / area con la lamina elastica interna)] * 100. Questo fornisce una misura del grado di occlusione del lume, che deriva da una combinazione di espansione intimale e rimodellamento (verso l&#39;interno o verso l&#39;esterno) della parete del vaso. </li></ol></li></ol>

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<li>Soulez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perlecan+fragment+LG3+is+a+novel+regulator+of+obliterative+remodeling+associated+with+allograft+vascular+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection.</a> Circ Res. 110, 94-104 (2012).</li>
<li>Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+mediates+endothelial+cell+death+and+resultant+transplant+vascular+disease+in+cardiac+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts.</a> Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).</li>
<li>Choy, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+induces+endothelial+cell+apoptosis+and+contributes+to+the+development+of+transplant+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease.</a> Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).</li>
<li>Reis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+vascular+surgery%22%5BJournal%5D)">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li>
<li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-%2F-+mice+during+disease+regression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li>
</ol>

Abbiamo descritto un protocollo per interposizione aortica innesti in topi che è utile per studiare il rigetto vascolare immunomediata e TA. Questo modello può essere utilizzato per analizzare le cause dei TA nonché lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. E &#39;stato usato in passato per stabilire un ruolo essenziale di immunità adattativa, citotossici risposte delle cellule T, le risposte effettrici CD4 T cellule citochine-mediata, e danni trapianto mediata da anticorpi in TA 14,17-21. Trapianto Artery...

Nel corso degli ultimi 30 anni, i progressi in materia di farmaci immunosoppressori sono diminuiti rigetto del trapianto a causa di rigetto acuto, ma il rigetto cronico rimane una sfida. La manifestazione principale del rigetto del trapianto cardiaco cronico è arteriosclerosi trapianto (TA) 1,2. Questa condizione è caratterizzata da iperplasia intimale e vasomotoria disfunzione delle arterie allogenico e si sviluppa come risultato di immunologica Il targeting delle cellule muscolari lisce endoteliali e dal sistema immunitario ricevente. La gestione mirata del sistema vascolare del trapianto a causa di riconoscimento del complesso di istocompatibilità straniera peptide-major (MHC) è evidenziata dallo sviluppo di TA esclusivamente nelle arterie innesto risparmiando vasi ospitanti 3. In linea con questo è l&#39;osservazione che TA non si verifica sperimentalmente quando il destinatario è geneticamente identico al donatore o quando il destinatario manca cellule T e B 4. Danno vascolare immuno-mediata e dysfunction provoca lo sviluppo di ispessimento intimale e fibrosi, così come l&#39;accumulo anormale di lipidi e proteine ​​ECM, in TA 5. Ispessimento intimale tende ad essere concentrici in tutto l&#39;albero arterioso 4-6. Perdita del trapianto e la morte di solito si verificano a seguito di ischemia progressiva derivante dalla occlusione del lume delle arterie allotrapianto 4. Nel 1991, Mennander et al. 7 ha favorito un modello di interposizione aortica nei ratti per modellare TA. Diversi gruppi hanno successivamente adattato questo procedimento per l&#39;utilizzo nei topi. In questo modello, i segmenti aortici trapianto allogenico di sviluppare lesioni che hanno caratteristiche analoghe a TA osservate nei trapianti clinici. Questo include ispessimento intimale caratterizzata da accumulo di cellule come-muscolari lisce e leucociti destinatari 7. Nel corso degli ultimi 2 decenni questo modello è stato utilizzato per generare importanti informazioni sui meccanismi di danno vascolare, il rifiuto e TA. Può essere noied esaminare le questioni relative alla risposta immunitaria e vascolari durante la patologia arteriosa. La scelta degli impatti antigene disadattamento la capacità di affrontare in modo appropriato a queste domande. Trapianto attraverso le barriere complete MHC permette una valutazione completa delle risposte immunitarie che sono noti per essere coinvolti nel rigetto dei trapianti d&#39;organo. Questo include il riconoscimento delle cellule CD4 e CD8 T diretta e la destinazione di stranieri peptide-MHC presentato da cellule innesto di derivazione, CD4 indiretta (e possibilmente CD8) il riconoscimento delle cellule T e la destinazione dei alloantigeni innesto di derivazione presentati da antigene destinatario presentano cellule, e anticorpi riconoscimento mediata di alloantigeni sulla superficie delle cellule vascolari 8. Tuttavia, la risposta vascolare al danno in completi esperimenti MHC-non corrispondenti possono variare rispetto a quello osservato clinicamente. Johnson et al. 9 hanno mostrato che, negli innesti interposizione aortici trapiantati attraverso una barriera completa MHC disallineamento, la maggior parte dile cellule neointimal sono di origine destinatario e non di provenienza dei donatori. Questo è diverso da quello osservato nei trapianti umani, dove la maggior parte delle cellule muscolari lisce intimale di origine donatore 9,10. Per tenere conto di questa limitazione, modelli sperimentali alternativi che coinvolgono innesto attraverso piccoli disallineamenti antigene di istocompatibilità sono stati sviluppati che innescano le risposte vascolari che si avvicinano maggiormente a quelli osservati nel trapianto clinica 11. Anche se questi modelli alternativi permettono di conclusioni importanti da effettuare per quanto riguarda le risposte vascolari che guidano lo sviluppo della TA, i processi immunologici che causano il rigetto vascolare in antigene di istocompatibilità minore innesti corrispondenti non completamente ri-capitolare quelle che si verificano in ambito clinico. Ad esempio, antigeni di istocompatibilità minori sono riconosciuti male da innesto anticorpi reattivi 12. Alla luce delle considerazioni che precedono, è importante considerare il QUESTI patologicosu essere esaminato quando si sceglie il tipo di antigene disadattamento utilizzato un modello interposizione aortica. Qui si descrive un protocollo dettagliato per murino aortica interposizione innesto. Descriviamo interposizione innesto tra completi topi MHC-non corrispondenti, ma lo stesso protocollo viene utilizzato per l&#39;innesto su altri ceppi di antigene non corrispondenti mouse.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/cBYJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 001026</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato Iniezione USP 100 mg/ml</td><td>Ketalean</td><td>DIN 00612316</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina Iniezione 20 mg/ml</td><td>Rompum</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofene Iniezione 100 mg/ml</td><td>Anafen</td><td>DIN 01938126</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol Tartrato&nbsp; iniezione 10 mg/ml</td><td>Torbugesic</td><td>DIN 008450000</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina Iniezione 0,3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>B.N. 5241</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole cloridrato soluzione iniettabile sterile</td><td>Antisedan</td><td>DIN 02237744</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Iniezione di sodio, USP, 1.000 unità/ml</td><td>McKesson Distribuzione</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>Lacrime unguento oftalmico naturale</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>0,9% cloruro di sodio, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ringer lattato s soluzione, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio 0,9% per iniezione, sterile, 10 ml</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol</td><td>Loris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodio</td><td>Betadina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloroesidina Gluconato 4% w/v</td><td>Germi-Stat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofilamento di poliammide nero</td><td>AROSurgical Strumenti</td><td>T4A10Q07</td><td></td></tr><tr><td>Sutura, sutura 10-0, 70 micron</td><td>Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura monofilamento blu 5-0, ago P3</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD</td><td>REF 309659</td> Siringa da 10 ml 309604 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Siringa</td></tr><tr><td>da 1 cc TB per insulina con 28 G 1/2</td><td>BD</td><td>REF 309309</td><td></td></tr><tr><td>25 G 7/8, ago ipodermico</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1/2, ago ipodermico</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatore Colibrì - 1,5 cm di diffusione 4 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>S& T CAF-4 Pinze per l'applicazione di clip, senza blocco</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Supergrip, S& T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Medical No.5 pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro Adson forcipe seghettato</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen microforbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro morsetti, b-1; 3,5 mm x 1 mm; 7 mm di lunghezza</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Graefe-pinze, 10 cm 1x2 denti</td><td>Fine Science Tools</td><td>11054-10</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo con blocco e ganasce in tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a caldo per perle di vetro</td><td>Inotech 250</td><td>IS-250 - Steri-250</td><td></td></tr><tr><td>Garze in tessuto non tessuto</td><td>Progene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicatori</td><td>Puritan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beard Trimmer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modello murino della alloimmune indotta rifiuto vascolare e trapianto arteriosclerosi

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Il rigetto vascolare che porta all'arteriosclerosi da trapianto (TA) è la principale rappresentazione del fallimento cronico del trapianto di cuore. Nella TA, il sistema immunitario del ricevente provoca danni alla parete arteriosa e disfunzione delle cellule endoteliali e delle cellule muscolari lisce. Ciò innesca una risposta di riparazione patologica caratterizzata da ispessimento intimale e occlusione luminale. La comprensione dei meccanismi con cui il sistema immunitario causa il rigetto vascolare e l'AT può informare lo sviluppo di nuovi modi per gestire il fallimento del trapianto. Qui, descriviamo un modello murino di interposizione aortica che può essere utilizzato per studiare i meccanismi patogenetici del rigetto vascolare e della TA. Il modello prevede l'innesto di un segmento aortico da un animale donatore in un ricevente allogenico. Il rigetto del segmento arterioso comporta reazioni alloimmuni e provoca alterazioni arteriose che assomigliano al rigetto vascolare. L'approccio tecnico di base che descriviamo può essere utilizzato con diversi ceppi di topo e interventi mirati per rispondere a domande specifiche relative al rigetto vascolare e all'AT.

In questo modello, l&#39;aorta addominale da un topo Balb / CYJ è interposto in aorta sottorenale di un / 6 ricevente C57Bl. Questo permette una valutazione completa di alloimmuni risposte che colpiscono le arterie trapianto allogenico. Danno vascolare Immune-mediata in questo modello inizia risposte riparative vascolari che culminano in ispessimento dell&#39;intima, restringimento del lume e il reclutamento di cellule immunitarie (figure 1 e 2). Questi criteri agiscono come uno-out let...

Descriviamo un protocollo per l'innesto di interposizione aortica nei topi. L'obiettivo del protocollo è quello di fornire un modello con cui studiare i processi patologici e le strategie terapeutiche rilevanti per le reazioni alloimmuni nelle arterie e le conseguenti modificazioni arteriose che contribuiscono al fallimento del trapianto d'organo.

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un innesto aortico di interposizione da estremità a estremità nei topi per studiare il rigetto vascolare e l'arteriosclerosi da trapianto. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando un segmento dell'aorta addominale dal topo donatore. Il segmento viene quindi trapiantato ortotopicamente nell'aorta intrarenale di un ricevente allogenico geneticamente diverso dal donatore.Nell'ultimo passaggio, il segmento vascolare trapiantato viene escisso e analizzato per valutare lo sviluppo dell'arteriosclerosi del trapianto. In definitiva, il grado di arteriosclerosi del trapianto e il rigetto vascolare mediato dal sistema immunitario possono essere valutati misurando l'ispessimento intimo e il restringimento luminale, nonché mediante analisi immunohistochimica del tessuto per rilevare l'accumulo di cellule immunitarie.Generalmente, le persone alle prime armi con questa procedura necessitano di tempo per prendere confidenza con la tecnica microchirurgica, poiché richiede un elevato livello di abilità manuale e molta pratica per padroneggiarla. Tuttavia, con impegno e pratica costante, la maggior parte dei ricercatori dovrebbe essere in grado di acquisire questa metodica. Per illustrare la procedura, collaborano la dottoressa Winnie, una neurochirurga esperta, e Adam Roso, un brillante studente di dottorato del mio laboratorio. Iniziare posizionando il topo donatore in posizione supina su una lastra sottile di plexiglass pulita, ricoperta con un telo sterile, sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento di 30x.Dopo aver confermato un'adeguata anestesia chirurgica mediante la pinzatura delle dita dei piedi, utilizzare forbici sterili per praticare un'incisione mediana singola dal pube al processo ZipID. Successivamente, utilizzare un piccolo retrattore per aprire le pareti addominali ed esporre la cavità addominale. Quindi, utilizzare applicatori sterili con estremità di cotone per ritrarre delicatamente gli intestini in senso superiore rispetto al lato sinistro dell'animale.Coprire il tessuto con una garza inumidita con soluzione fisiologica e spostare gli organi riproduttivi in posizione inferiore per individuare l'aorta sovra-renale e la vena cava inferiore o VCI. Utilizzare ora pinze chirurgiche numero 5 per separare l'aorta dalla VCI all'altezza dell'arteria renale sinistra, vicino alla biforcazione. Quindi usare suture monofilamento di poliammide 10 zero per legare i piccoli rami vicini all'aorta.Dopo aver separato l'aorta del donatore e la VCI, saturare il vaso con soluzione salina, coprire la cavità esposta con garza inumidita e mettere da parte il donatore in un'area sterile. A questo punto, posizionare il topo ricevente sotto il microscopio e separare l'aorta del ricevente dalla VCI come appena dimostrato. Quindi posizionare due clip microvascolari di quattro millimetri, prossimale e distale al segmento di interesse, a circa cinque millimetri di distanza l'una dall'altra.Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche per aorta di vario tipo, eseguire un'otomia aortica orizzontale singola ed escindere non più di 0,5 millimetri dell'aorta addominale per alloggiare il graft aortico del donatore. Riportare il donatore al microscopio ed eseguire il taglio di un segmento di graft lungo tre-quattro millimetri come appena dimostrato. Quindi utilizzare un ago da 25 gauge lungo cinque ottavi per lavare l'aorta escissa con soluzione salina eparinizzata.Avendo cura che la punta dell'ago non entri in contatto con il vaso, posizionare il vaso in un contenitore di soluzione salina eparinizzata ghiacciata su ghiaccio. Entro 30 minuti dall'escissione, posizionare l'innesto aortico del donatore in sede ortotopica nel ricevente, allineando l'orientamento anatomico del graft con quello del ricevente. Successivamente, afferrare delicatamente la tunica esterna del vaso e utilizzare la pinza numero cinque per deviarla leggermente.Ora utilizzare la pinzetta per inserire un ago collegato a un filo di sutura monofilamento in poliammide di calibro 10-0 attraverso tutta la spessore della parete vascolare, al fine di fissare l'innesto aortico del donatore al vaso del ricevente per la posizione di punti continui. Posizionare i punti di ritenzione alle nove in entrambe le estremità superiore e inferiore dell'innesto. Successivamente, a partire dall'estremità superiore dell'innesto, eseguire l'anastomosi alle tre.Chiudere i lembi resecati con due punti continui e fissare il filo al punto di ancoraggio. Quindi capovolgere l'innesto e proseguire il punto continuo fino alla parte dorsale del vaso, raggiungendo l'origine.Punto di sutura di sostegno. Fissare la sutura senza applicare troppa pressione sul vaso e ripetere la sutura per l'anastomosi inferiore. Una volta completata l'anastomosi.Rilasciare la pinza microvascolare distale per consentire il flusso sanguigno retrogrado attraverso il vaso. Se non si osserva sanguinamento, rilasciare la pinza prossimale. Se non si osservano ostruzioni ematiche, utilizzare un paio di pinzette per afferrare delicatamente un'estremità dei punti di ritenzione e deviare leggermente il vaso per ispezionare la parete posteriore del vaso.Non dovrebbe essere osservato alcun raggrinzimento se un pattern pulsatile vigoroso è visibile sia nel vaso donatore che in quello ricevente; utilizzare applicatori di cotone per riposizionare l'intestino all'interno della cavità addominale. Infine, utilizzare un portaaighi e pinze grof per chiudere la parete addominale con suture continue in polipropilene di calibro cinque zero. Chiudere lo strato cutaneo con le stesse suture mediante sutura sottocuticolare.La funzione motoria degli arti posteriori può essere osservata per valutare il successo dell'intervento chirurgico. Viene esaminata l'entità del danno vascolare dell'alloinnesto mediato dal sistema immunitario, quantificando l'ispessimento intimo e il restringimento luminale nei segmenti aortici innestati al giorno 30 post-trapianto.Come osservato, i segmenti di arteria alloinnestata sviluppano un notevole ispessimento intimo e un'occlusione luminale, mentre nei segmenti di arteria di controllo con innesto ISO non si osservano cambiamenti. Inoltre, il reclutamento di leucociti nell'arteria alloinnestata può essere valutato esaminando l'accumulo di cellule T positive per CD quattro e CD otto e di macrofagi mediante immunohistochimica. Come previsto, tutti e tre i tipi di cellule immunitarie sono stati rilevati all'interno dell'intima dei tessuti arteriosi del donatore dopo lo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del trasporto per esplorare la riduzione vascolare mediata da alloimmunità e la sclerosi arteriosa del trapianto.

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Questo video dimostra il modello di trapianto ortotopico aortica come un semplice modello per studiare lo sviluppo di vasculopatia trapianto (TVP) nei ratti.

Trapianto ortotopico aortica: un modello di ratto per studiare lo sviluppo di vasculopatia cronica

Descriviamo una tecnica in cui viene trapiantato una sezione dell'aorta addominale di un topo ortotopicamente a appena sotto le arterie renali di un destinatario allogenici o singenici. Questa tecnica può essere utile in studi in cui si considera il trapianto di grandi arterie di dimensioni uniformi vantaggiosa.

Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Questo video mostra un metodo per generare un modello di interposizione aortica su un topo per studiare il rigetto vascolare indotto da alloimmuni. Dopo aver posizionato un topo donatore anestetizzato in posizione supina, l'aorta addominale infrarenale (IAA) viene accuratamente isolata dalle strutture circostanti. I vasi ramificati sono legati ed entrambe le estremità dell'IAA sono bloccate per impedire il flusso sanguigno prima della resezione. Successivamente, l'IAA del donatore viene...

Un modello murino di interposizione aortica per studiare il rigetto vascolare indotto da alloimmunitarie

Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.

Modelli murini per l&#39;arteriosclerosi Graft

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'immunologia del rigetto. Il modello chirurgico presentato riporta un breve tempo operatorio e una tecnica concisa. A seconda della combinazione di ceppo donatore-ricevente, il rene trapiantato può sviluppare rigetto cellulare acuto o danno cronico da allotrapianto, definito da fibrosi interstiziale e atrofia tubulare.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Per studiare l'allotrapianto combinato di organi solidi e composito vascolarizzato, descriviamo un nuovo modello eterotopico di trapianto di parete toracica, timo e cuore nei topi utilizzando una tecnica di cuffia cervicale senza sutura.

A Novel microchirurgica modello per eterotopica, in blocco parete toracica, Timo, e trapianto cardiaco nei topi

Questo nuovo modello per il trapianto degli arti posteriori ortotopico nel topo, applicando una tecnica bracciale non sutura per anastomosi super-microvascolare, fornisce un potente strumento per la ricerca in vivo meccanicistica immunologica relative al allotrapianto composito vascolarizzato (VCA).

Ortotopico degli arti posteriori del trapianto di mouse

Qui, presentiamo un protocollo di trapianto aortico eterotopico nei topi utilizzando la tecnica del bracciale non-suture in un modello di murino cervicale. Questo modello può essere utilizzato per studiare la patologia sottostante della vasculopatia allotrapianto cronica (CAV) e può aiutare a valutare nuovi agenti terapeutici al fine di prevenirne la formazione.

Modello di trapianto aortico cervicale murine utilizzando una tecnica di manette non sutura modificata

Questo studio stabilisce due modelli standardizzati di xenotrapianto murino per replicare specificamente il rigetto cellulare acuto e il rigetto acuto mediato da anticorpi. Questi modelli rappresentano una piattaforma affidabile per indagare i meccanismi del rigetto immunitario degli xenotrapianti, valutare strategie immunosoppressive e far progredire la ricerca preclinica sugli xenotrapianti.

Un modello murino standardizzato con un flusso di lavoro a tre persone per studiare il rifiuto acuto cellulare e mediato dagli anticorpi nella xenotrapiantialità

L'intero modello murino stasi di trombosi della vena cava inferiore rendimenti quantificabile quantità di tessuto della parete venosa e trombosi. Si è dimostrato utile per valutare le interazioni tra la parete venosa e il trombo occlusivo e nel valutare la progressione da acuta a cronica.

Modello del mouse completa stasi della vena cava inferiore Trombosi

Impara il trapianto ortotopico dell'aorta addominale nel topo per studiare il rigetto vascolare e l'arteriosclerosi da trapianto. Questo modello murino permette di analizzare l'ispessimento intimale e il restringimento luminale.

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

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