Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un innesto aortico di interposizione da estremità a estremità nei topi per studiare il rigetto vascolare e l'arteriosclerosi da trapianto. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando un segmento dell'aorta addominale dal topo donatore. Il segmento viene quindi trapiantato ortotopicamente nell'aorta intrarenale di un ricevente allogenico geneticamente diverso dal donatore.

Nell'ultimo passaggio, il segmento vascolare trapiantato viene escisso e analizzato per valutare lo sviluppo dell'arteriosclerosi del trapianto. In definitiva, il grado di arteriosclerosi del trapianto e il rigetto vascolare mediato dal sistema immunitario possono essere valutati misurando l'ispessimento intimo e il restringimento luminale, nonché mediante analisi immunohistochimica del tessuto per rilevare l'accumulo di cellule immunitarie.

Generalmente, le persone alle prime armi con questa procedura necessitano di tempo per prendere confidenza con la tecnica microchirurgica, poiché richiede un elevato livello di abilità manuale e molta pratica per padroneggiarla. Tuttavia, con impegno e pratica costante, la maggior parte dei ricercatori dovrebbe essere in grado di acquisire questa metodica. Per illustrare la procedura, collaborano la dottoressa Winnie, una neurochirurga esperta, e Adam Roso, un brillante studente di dottorato del mio laboratorio. Iniziare posizionando il topo donatore in posizione supina su una lastra sottile di plexiglass pulita, ricoperta con un telo sterile, sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento di 30x.

Dopo aver confermato un'adeguata anestesia chirurgica mediante la pinzatura delle dita dei piedi, utilizzare forbici sterili per praticare un'incisione mediana singola dal pube al processo ZipID. Successivamente, utilizzare un piccolo retrattore per aprire le pareti addominali ed esporre la cavità addominale. Quindi, utilizzare applicatori sterili con estremità di cotone per ritrarre delicatamente gli intestini in senso superiore rispetto al lato sinistro dell'animale.

Coprire il tessuto con una garza inumidita con soluzione fisiologica e spostare gli organi riproduttivi in posizione inferiore per individuare l'aorta sovra-renale e la vena cava inferiore o VCI. Utilizzare ora pinze chirurgiche numero 5 per separare l'aorta dalla VCI all'altezza dell'arteria renale sinistra, vicino alla biforcazione. Quindi usare suture monofilamento di poliammide 10 zero per legare i piccoli rami vicini all'aorta.

Dopo aver separato l'aorta del donatore e la VCI, saturare il vaso con soluzione salina, coprire la cavità esposta con garza inumidita e mettere da parte il donatore in un'area sterile. A questo punto, posizionare il topo ricevente sotto il microscopio e separare l'aorta del ricevente dalla VCI come appena dimostrato. Quindi posizionare due clip microvascolari di quattro millimetri, prossimale e distale al segmento di interesse, a circa cinque millimetri di distanza l'una dall'altra.

Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche per aorta di vario tipo, eseguire un'otomia aortica orizzontale singola ed escindere non più di 0,5 millimetri dell'aorta addominale per alloggiare il graft aortico del donatore. Riportare il donatore al microscopio ed eseguire il taglio di un segmento di graft lungo tre-quattro millimetri come appena dimostrato. Quindi utilizzare un ago da 25 gauge lungo cinque ottavi per lavare l'aorta escissa con soluzione salina eparinizzata.

Avendo cura che la punta dell'ago non entri in contatto con il vaso, posizionare il vaso in un contenitore di soluzione salina eparinizzata ghiacciata su ghiaccio. Entro 30 minuti dall'escissione, posizionare l'innesto aortico del donatore in sede ortotopica nel ricevente, allineando l'orientamento anatomico del graft con quello del ricevente. Successivamente, afferrare delicatamente la tunica esterna del vaso e utilizzare la pinza numero cinque per deviarla leggermente.

Ora utilizzare la pinzetta per inserire un ago collegato a un filo di sutura monofilamento in poliammide di calibro 10-0 attraverso tutta la spessore della parete vascolare, al fine di fissare l'innesto aortico del donatore al vaso del ricevente per la posizione di punti continui. Posizionare i punti di ritenzione alle nove in entrambe le estremità superiore e inferiore dell'innesto. Successivamente, a partire dall'estremità superiore dell'innesto, eseguire l'anastomosi alle tre.

Chiudere i lembi resecati con due punti continui e fissare il filo al punto di ancoraggio. Quindi capovolgere l'innesto e proseguire il punto continuo fino alla parte dorsale del vaso, raggiungendo l'origine.

Punto di sutura di sostegno. Fissare la sutura senza applicare troppa pressione sul vaso e ripetere la sutura per l'anastomosi inferiore. Una volta completata l'anastomosi.

Rilasciare la pinza microvascolare distale per consentire il flusso sanguigno retrogrado attraverso il vaso. Se non si osserva sanguinamento, rilasciare la pinza prossimale. Se non si osservano ostruzioni ematiche, utilizzare un paio di pinzette per afferrare delicatamente un'estremità dei punti di ritenzione e deviare leggermente il vaso per ispezionare la parete posteriore del vaso.

Non dovrebbe essere osservato alcun raggrinzimento se un pattern pulsatile vigoroso è visibile sia nel vaso donatore che in quello ricevente; utilizzare applicatori di cotone per riposizionare l'intestino all'interno della cavità addominale. Infine, utilizzare un portaaighi e pinze grof per chiudere la parete addominale con suture continue in polipropilene di calibro cinque zero. Chiudere lo strato cutaneo con le stesse suture mediante sutura sottocuticolare.

La funzione motoria degli arti posteriori può essere osservata per valutare il successo dell'intervento chirurgico. Viene esaminata l'entità del danno vascolare dell'alloinnesto mediato dal sistema immunitario, quantificando l'ispessimento intimo e il restringimento luminale nei segmenti aortici innestati al giorno 30 post-trapianto.

Come osservato, i segmenti di arteria alloinnestata sviluppano un notevole ispessimento intimo e un'occlusione luminale, mentre nei segmenti di arteria di controllo con innesto ISO non si osservano cambiamenti. Inoltre, il reclutamento di leucociti nell'arteria alloinnestata può essere valutato esaminando l'accumulo di cellule T positive per CD quattro e CD otto e di macrofagi mediante immunohistochimica. Come previsto, tutti e tre i tipi di cellule immunitarie sono stati rilevati all'interno dell'intima dei tessuti arteriosi del donatore dopo lo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del trasporto per esplorare la riduzione vascolare mediata da alloimmunità e la sclerosi arteriosa del trapianto.