Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

C'è una generale mancanza di conoscenza su come funzionano i vaccini. Qui proponiamo l'uso combinato della genetica inversa e dei topi chimerici del midollo osseo per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie precoci dell'ospite ai vaccini, con particolare attenzione alle cellule dendritiche e all'immunità delle cellule T.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere un sistema per valutare l'inizio fisiologico dell'immunità adattativa specifica per il vaccino. Questo si ottiene in primo luogo, utilizzando la genetica inversa per generare vaccini antinfluenzali vivi attenuati contenenti uno specifico peptide immunogenico, e poi utilizzando un embrione di pollo per moltiplicare il virus. Successivamente, le cellule vengono raccolte dai linfonodi dei topi vaccinati e l'analisi fax viene utilizzata per tracciare la migrazione delle cellule dendritiche.

Nel test successivo, otto cellule T positive CD reattive al peptide immunogenico vengono marcate e iniettate in topi vaccinati, seguite da un'analisi via fax per misurare la proliferazione di tali cellule per analizzare la risposta immunitaria in modo più dettagliato. Uno specchio a campanello competitivo per il midollo osseo viene realizzato infondendo cellule del midollo osseo che esprimono il recettore della tossina della difterite in topi congenici irradiati, che vengono quindi esposti alla tossina della difterite. Dopo una deplezione riuscita, il topo viene vaccinato e marcati con anticorpi e tetrameri vengono utilizzati per identificare le otto cellule T positive CD.

Riconoscere il peptide specifico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della vaccinologia, come ad esempio come funziona un vaccino a livello neurologico, quali sono i principali bersagli cellulari e molecolari del vaccino e, soprattutto, come possiamo migliorare le attuali strategie profilattiche. A dimostrare la procedura sarà Sanmen Medina.

Io e il nostro responsabile di laboratorio Per questo protocollo generiamo un vaccino antinfluenzale riassortito adattato al freddo utilizzando il ceppo adattato al freddo. A Ann Arbor sei 60. Come sfondo accoppiato con emoagglutinina e una neuraminidasi modificata del ceppo A PR 8 34.

Una porzione della sequenza del gambo proteico del gene della neuraminidasi viene sostituita con una breve sequenza di CDNA che codifica per il peptide di pollo sinfecale. Questo peptide è altamente immunodominante nella classe H 2 BMHC. Una risposta limitata di C 57 nero sei topi e funziona come un elemento tracciabile.

Per iniziare la piastra 1.000, 002 93 cellule T in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti con DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di streptococco. Quindi, preparare una miscela di trasfezione plasmidica sufficiente per 100 microlitri per pozzetto. Combinare un microgrammo di ciascun plasmide e riempire la provetta con il terreno di preriscaldamento delle cellule OPTI MEM fino a 50 microlitri in un'altra provetta.

Aggiungere il doppio del volume di lipectomia 2000 corrispondente alla quantità totale di plasmide da trasfettare e rabboccare la provetta a 50 microlitri con opti MEM prima di aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule. Lasciate riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 100 microlitri della miscela di trasfezione a ciascun pozzetto e spostare la piastra in un incubatore per 16 ore.

Il giorno successivo, cambia il terreno in DMEM con 0,3% BSA e 1% di streptococco in penna. Quindi spostare le celle a 33 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per cinque ore. Dopo cinque ore.

Aggiungere una sovrapposizione di un milione di cellule MDCK permissive per l'influenza nel DMEM integrato con Tripsin. Mantenere le colture di co per due o tre giorni sotto il regime di incubazione a 33 gradi Celsius per generare e amplificare il virus Successivamente, rimuovere i detriti utilizzando una centrifuga di cinque minuti a 260 G. Quindi raccogliere i surnatanti e inoculare uova di embrioni di gallina di 9-10 giorni in condizioni sterili.

Per fare ciò, fai un buco sulla parte superiore del guscio dell'uovo e aggiungi il virus a una diluizione di 100 x 10 x o una x . Coprite il guscio d'uovo con cera fusa usando un batuffolo di cotone e incubate le uova di gallina inoculate per tre giorni a 33 gradi Celsius. Successivamente, raccogli il fluido Alan Toic dalle uova infette.

Lavate i gusci d'uovo con etanolo al 70%. Aprire l'uovo con una fessura molto delicata nella parte superiore e rimuovere la membrana Alan Toic utilizzando una pinza sterile. Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per raccogliere quanto più liquido possibile.

In genere da sei a 10 millilitri. Centrifugare il fluido a 260 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il fluido Alan Toic chiarificato in nuove provette. Dopo aver anestetizzato un topo donatore e aver avuto accesso chirurgico al mediastino, prelevare i linfonodi utilizzando una pinza curva.

Trasferire i linfonodi in una piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di DMEM. Dopo aver rimosso il tessuto connettivo o adiposo che circonda il linfonodo, fissare il linfonodo con un ago e aprirlo con l'altro ago. Ciò dovrebbe comportare l'esplosione di cellule dal linfonodo nel mezzo per raccogliere le cellule.

In primo luogo, passare tutto il materiale tissutale attraverso un filtro di nylon da 70 micron per ottenere una sospensione di cellule pronte per la centrifugazione. Risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone di lisi RBC. Lasciare che la reazione di lisi vada avanti per tre minuti a temperatura ambiente e terminarla con un'aggiunta di due millilitri di PBS ghiacciato e procedere con la colorazione delle cellule secondo il protocollo di testo.

Assicurarsi di utilizzare lo sfarfallio della piastra per rimuovere e scartare il super nominato prima dell'incubazione dell'anticorpo. Le cellule T del donatore marcate da topi transgenici TCR disponibili in commercio incubano 5 milioni di cellule in un millilitro di PBS con cinque micromolari di CFSE. Lasciare che l'incubazione prosegua per 20 minuti a 37 gradi Celsius al buio.

Quindi raccogliere le cellule a 2 milioni per 100 microlitri di PBS e infondere nei topi congenici riceventi un bolo da 100 microlitri tramite iniezione di seno retroorbitale. Dopo tre-cinque giorni, sopprimere i topi, raccogliere i linfonodi mediastinici e preparare una sospensione a singola cellula per la citometria a flusso. Come prima.

Quindi identificare le cellule del donatore colorando le sospensioni di singole cellule in un cocktail di anticorpi. Per l'analisi. Lasciare aperto il canale FL one del citometro a flusso per determinare il profilo di diluizione del CFSE.

Dopo aver rimosso e disinfettato le tibie e il femore di un topo soppresso, raccoglieteli in una ciotola di DMEM. Taglia le estremità delle ossa usando forbici affilate e sciacqua il midollo osseo nel DMEM. Ora, utilizzando metodi standard, irradiare topi femmine di sei-otto settimane utilizzando un irradiatore di sorgente di cesio 1 37 da due a quattro ore dopo l'irradiazione dei topi, anestetizzare i topi e trapiantarli con cellule del midollo osseo del donatore tramite un'iniezione di seno retroorbitale di 2 milioni di cellule in 100 microlitri di PBS Per le prossime due settimane, fornire ai topi da 2,5 a 5 milligrammi di Baal per chilogrammo nella loro acqua potabile.

A partire da due giorni prima della vaccinazione, somministrare 50 nanogrammi di DT diluiti in 50 microlitri di PBS goccia a goccia direttamente nelle narici di topi anestetizzati. Continuare questo trattamento per tre giorni dopo la vaccinazione. Vedere il protocollo di testo per i dettagli su come generare il modello di topo finale.

Vaccinare i topi con l'influenza viva attenuata ricombinante utilizzando un'iniezione intranasale in anestesia. Erogare 1000 PFU di vaccino da una pipetta da 200 microlitri in 50 microlitri di PBS La generazione di vaccini influenzali vivi attenuati ricombinanti può essere ottenuta mediante trasfezione di plasmidi che codificano gli otto segmenti del virus influenzale sotto il controllo di promotori bidirezionali. Un vaccino antinfluenzale adattato al raffreddore di solito contiene sei segmenti di un ceppo adattato al raffreddore, così come l'HA e il NA del ceppo influenzale di scelta, come H uno N uno.

L'adattamento al freddo consente una replicazione limitata del virus a 33 gradi Celsius, la temperatura del tratto respiratorio superiore nei topi e nell'uomo, ma non consente la replicazione nel tratto respiratorio inferiore, quindi non può provocare la fusione della polmonite. La PCR è stata utilizzata per sostituire una regione conservata nello stelo della neuraminidasi virale con un peptide derivato da OVA tracciabile. Il modello peptidico tracciabile è stato inoculato nei topi tra tre e sei giorni dopo la vaccinazione.

La proteina tracciabile syn fecal è stata rilevata nei linfonodi drenanti polmonari. La citometria a flusso multiparametrica è stata utilizzata per quantificare la presentazione dell'antigene derivato dal vaccino in tempo reale. Allo stesso modo, l'infusione di cellule T specifiche per le sinfeci ha permesso di quantificare le risposte delle otto cellule T CD specifiche per il vaccino per valutare le funzioni specifiche del gene durante la vaccinazione.

È stato utilizzato un modello murino che combina la tecnologia DTR e la kyira competitiva del midollo osseo. Pertanto, la perdita della funzione genica è stata mirata a specifici compartimenti cellulari nel corso delle risposte immunitarie alla vaccinazione. Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come analizzare i percorsi molecolari e fisiologici coinvolti nella modulazione dell'immunità indotta dal vaccino nell'ospite.

Inoltre, questa tecnica fornirà nuove informazioni nella determinazione dei bersagli cellulari del vaccino, favorendo così la valutazione di nuove piattaforme vaccinali.