Name: Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri come valutare l'immunità adattiva indotta da vaccini influenzali ricombinanti nei topi chimerici. Questo metodo combina genetica inversa e analisi delle cellule dendritiche per studiare le risposte immunitarie.

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Ringraziamo Sergio Gómez-Medina per l'eccellente supporto tecnico con gli esperimenti sui topi. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi dell'Associazione Leibniz e del Centro Leibniz per le Infezioni. A.L. ha ricevuto una borsa di studio pre-dottorato dalla Leibniz Graduate School.

Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo protocolli approvati e seguendo le linee guida della legge sulla protezione degli animali tedesca. Tutto il personale che effettuano esperimenti sugli animali passati programmi di formazione a seconda della categoria B o C della Federazione delle Associazioni scientifiche europee animali da laboratorio. 1. Generazione di ricombinante vivo attenuato Influenza vaccini da Reverse Genetics NOTA: Il protocollo dettagliato per la generazione di virus influenzali ricombinanti dalla genetica inversa è stata descritta da studi precedenti 5 ed è fuori dal campo di applicazione della presente relazione. In breve, il salvataggio di vaccini antinfluenzali adattate a freddo (CAV) è fatto in un armadio biosicurezza di classe II sotto il livello di biosicurezza 2 (BSL2) contenimento, e prevede passaggi descritti di seguito. Il protocollo di trasfezione e infezioni segue quella Martinez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Generare un influenzale adattato freddo riassortantivaccino utilizzando come sfondo della adattato fredda ceppo A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), così come l&#39;emoagglutinina (HA) e neuraminidasi modificato (NA) del / PR / 8/34 (H1N1) A ( Figura 1A). La modifica nel gene NA è costituito da un sostituto basato su PCR di una sequenza conservata nel gambo della proteina (residui da 65 a 72) da una breve sequenza di cDNA codificante l&#39;ovalbumina di pollo (OVA) peptide -derived SIINFEKL (Figura 1B). Il peptide SIINFEKL è un peptide altamente immunodominante nel contesto della classe MHC H-2b risposta di topi C57BL / 6 12 I-ristretta. </li><li> Piatto 10 6 293T cellule per pozzetto in 6 pozzetti con DMEM al 10% di siero fetale bovino (FBS) supplementato con 1% di penicillina / streptomicina (P / E). </li><li> Preparare miscela di trasfezione plasmide: Aggiungere 1 ug di ciascuno dei plasmidi codificanti cDNA per PB2, PB1, PA, NP, M, NS dalla influenza A / Ann Arbor / 6/60 ceppo e 1 mg di plasmidi codificanti per la NA -SIINFEKL eHA da influenza A / PR / 8/34. Aggiungere pre-riscaldato OptiMEM (15 microlitri per un volume finale di 100 ul / pozzetto). </li><li> Incubare mix trasfezione per 30 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 100 pl di miscela di trasfezione / pozzetto ed incubare per 16 ore a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Cambiare supporti cella DMEM 0,3% BSA 1% P / E a 33 ° C e 5% CO 2 per 5 ore. </li><li> Aggiungere cellule MDCK permissive 10 6 influenzali in DMSO contenente 1 mg / ml di tripsina da pancreas bovino trattato con L-1-Tosylamide-2-feniletile clorometil chetone (TPCK-tripsina). Mantenere i 293T-MDCK co-culture per 2-3 giorni a 33 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Raccogliere surnatanti di cellule co-culture MDCK-293T e chiaro per centrifugazione a 260 g per 5 min. </li><li> Inoculare 9-10 giorni di età uova embrionate di pollo in condizioni sterili. Per fare questo, fare un foro sulla parte superiore del guscio d&#39;uovo, come indicato da Martinez-Sobrido et al. 5. </li><li> Coprire il wit guscio d&#39;uovoh fuso cera con un batuffolo di cotone e incubare le uova di gallina inoculate per 3 giorni a 33 ° C. </li><li> Raccogliere il liquido allantoico dalle uova embrionate infette: Lavare i gusci d&#39;uovo con il 70% di etanolo. Aprire l&#39;uovo con una crepa molto delicatamente nella parte superiore e rimuovere la membrana allantoide con pinza sterile. Utilizzare una pipetta 10 ml di raccogliere quanto più fluido possibile (in genere 6 - 10 ml). Centrifugare a 260 xg per 10 min a 4 ° C e trasferire il fluido eliminato allantoico di nuovi tubi. </li></ol> Immunità 2. Monitoraggio vaccino specifico <ol><li> Tracciare delle cellule dendritiche peptide-cuscinetto (DC) <ol><li> Per la vaccinazione del mouse, anestetizzare i topi con il 5% isoflurano in ossigeno utilizzando un vaporizzatore di precisione. Utilizzare una pipetta 200 microlitri di somministrare 50 ml di PBS contenente 10 3 formanti placca unità (PFU) del vaccino esprimere il peptide SIINFEKL attraverso le goccioline direttamente alle narici del mouse. </li><li> Tre giorni dopo la vaccinazione, euthanize topi tramite anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Sollevare la pelle del mouse sulla linea mediana appena sotto la gabbia toracica con una pinza e tagliare una piccola incisione attraverso la pelle con le forbici. Dal punto di incisione, rendono un 3 - 5 cm di lunghezza tagliare attraverso la pelle verso la testa e la coda, poi due incisioni 2 cm dalla linea mediana lateralmente da ciascuna estremità. Staccare la pelle a rivelare la cavità peritoneale e toracica. Tagliare con cautela attraverso le membrane che circondano il peritoneo per esporre il torace. </li><li> Per accedere al mediastino tagliare il diaframma e la parte inferiore della gabbia toracica. Individuare e rimuovere 2 linfonodi mediastinici (mln), un po &#39;dorsale e laterale adiacente al timo, medialmente adiacente alla arteria anonima, nei pressi del lato ventrale della trachea. </li><li> Per raccogliere le mln utilizzano pinze curve. Posizionare pinze sotto i linfonodi e tirare delicatamente. Mettere i linfonodi in un 6-pozzetti contenente 1 ml di DMEM e rimuovere eventuali connective o tessuto adiposo che circonda il nodo. <ol><li> Tease bene ogni campione con due aghi 26 G collegati ad 1 ml siringhe. Per stuzzicare il linfonodo, tenere premuto con un ago mentre la rottura del linfonodo con l&#39;altro ago. Quando questo viene fatto correttamente, le cellule concentrate scoppiano dal linfonodo sono facilmente osservati nei media. Passare tutto il materiale tessuto attraverso un filtro di nylon 70 micron per ottenere sospensioni di cellule singole. </li></ol></li><li> Centrifugare sospensioni di cellule singole per 10 min a 260 xg in una centrifuga refrigerata. Risospendere il pellet di cellule in 2 ml di globuli rossi di lisi (rbcL) Buffer per lisare i globuli rossi. Lasciare lisi di procedere per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Neutralizzare tampone rbcL via centrifugazione e risospensione delle cellule in 2 ml di PBS ghiacciato. </li><li> Cellule piastra a forma di U piastre da 96 pozzetti ad una concentrazione di 10 7 cellule / ml in un volume finale di 100 ul. </li><li> Per la citometria a flusso di analisi, Cell Block Fc-recettori con1 mg di anticorpi CD16 / CD32-topo anti per 10 6 cellule per 15 min in ghiaccio. </li><li> Piatti centrifuga e scartano sovranatanti di piatto rapido passaggio. Incubare i pozzetti individuali con la combinazione di anticorpi superficie scelta. Tipicamente per la rilevazione di cellule dendritiche in linfonodi, il cocktail di anticorpi dovrebbe includere: 0,25 pg di anti-CD11c, 0,25 mg di CD11b, 0,5 mg di MHC di classe II, 0,25 mg di CD103 e 0,15 mg di CD8α in un volume finale di 100 ul. </li><li> Per gating negativo, aggiungere 0,25 mg di anti-CD3, CD19, NK1.1 o un lignaggio cocktail (Figura 2A). Strategie di gating alternativi e protocolli per una corretta compensazione di più coloranti fluorescenti sono disponibili sul sito web del Progetto Genoma immunologica. Oltre ai marcatori di superficie di scelta, aggiungere 1 mg di un anticorpo contro H-2K b legato alla SIINFEKL al cocktail. Questo anticorpo disponibile in commercio consente la visualizzazione delle DC in che il peptide SIINFEKL è legato alla superficie MHC di classe I. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi di superficie per 30 min in ghiaccio. Proteggere piastra dalla luce. Piastre centrifugare a 260 xg per 5 minuti e lavare con 2 ml di PBS due volte. Trasferire le cellule di citometria a flusso tubi per l&#39;analisi. </li></ol></li><li> Valutazione del vaccino specifico la proliferazione delle cellule T <ol><li> Ottenere cellule T del donatore da disponibile commercialmente topi TCR-transgenici (topi OT-I) (C57BL / 6-Tg (Tcr aTcrb) 1100Mjb / J) in cui tutte le cellule T CD8 generate sono specifiche per il peptide SIINFEKL. Euthanize topi anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Harvest milza effettuando un&#39;incisione nella cavità addominale. Posizionare milza / s in 2 ml di DMEM / milza e rimuovere il tessuto connettivo e grasso. </li><li> Generare sospensioni singola cella di milza seguendo la procedura descritta in 2.1.2 e 2.1.3. </li><li> Per arricchire ulteriormente la sospensione singola cella sulle cellule T, si applicano i protocolli di separazione tallone magneticoutilizzando sia le procedure di selezione positivi o negativi 12. Per differenziare donatore cellule riceventi, utilizzare i topi congenici modo che per esempio topi riceventi esprimono il CD45.1 marcatore leucociti mentre le cellule T del donatore esprimono CD45.2 12. </li><li> Per marcare le cellule T, incubare in 1 ml di PBS contenente 5 mM di carboxyfluorescein ester succinimidil (CFSE) in una densità cellulare ottimale di 5 x 10 6 cellule / ml. Incubare le cellule per 20 min a 37 ° C al riparo dalla esposizione alla luce. Dopo l&#39;incubazione, le cellule centrifugare a 260 xg per 5 minuti, il surnatante scarto, e risospendere le cellule in 3 ml di siero fetale bovino (FBS) per neutralizzare CFSE. </li><li> Cellule centrifugare a 260 xg durante 10 minuti e risospendere nel volume adeguato di PBS in modo che 100 ml di soluzione contiene 2 x 10 6 cellule. Infondere destinatario topi congenici con 2 x 10 6 cellule / topo via retro-orbitale sinusale iniezione 13. </li><li> Euthanize topi riceventi a giorni 3, 4 e 5 postvaccinazione in anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Raccolto linfonodi mediastinici e preparare sospensioni singola cella per citometria a flusso, come indicato in 2.1.2-2.1.5. </li><li> Identificare le cellule del donatore dalla colorazione delle sospensioni di cellule singole a 100 l di un cocktail di anticorpi che contiene: 0,25 mg di anticorpi anti-topo CD3 CD4 e CD8; 0,5 mg di anti-topo CD45.1 o anticorpi CD45.2 (a seconda del fenotipo delle cellule del donatore). Lasciare la FL-1 canale del citometro a flusso aperto (FITC) per determinare il profilo di diluizione di CFSE 12 (Figura 2B). </li></ol></li></ol> 3. I topi chimerici per sezionare gene-specifica del vaccino Risposte NOTA: La generazione di concorrenza chimere di midollo osseo utilizzando modelli murini basati DTR permette la discriminazione di funzioni specifiche delle cellule durante la risposta immunitaria ai vaccini. Qui vi mostriamo una strategia aggiuntiva con la quale combinazione di DTR-esprimono donatore cells con celle di permessi topi knockout per studiare specifiche funzioni geniche durante l&#39;immunità in compartimenti cellulari specifici. Nell&#39;esempio generiamo topi con specifico delezione dei recettori toll-like 3 (TLR3) in Langerin + CD103 + DC. <ol><li> Preparazione delle cellule del donatore di midollo osseo <ol><li> Lavorare sotto un armadietto livello di biosicurezza II. Evitare la contaminazione utilizzando strumenti in autoclave esclusivamente. </li><li> Per generare midollo osseo topi chimerici, utilizzare CD45.1 congenic + C57BL / 6 topi femmina come destinatari, e utilizzare TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, o topi WT esprimono CD45.2 + come donatori. Utilizzando topi donatori e riceventi congenici permette la differenziazione delle cellule del donatore e del ricevente via citometria a flusso e questo permette attecchimento da valutare. </li><li> Per ottenere cellule del midollo osseo del donatore, eutanasia topi donatori con anestesia isoflurano seguita da dislocazione cervicale. Con forbici affilate eseguono incisioni intorno alle caviglie in modo che il mmuscolatura ouse è esposto. </li><li> Uso pinze smussato tirare la pelle del mouse e pelliccia delicatamente dalla caviglia verso i fianchi in modo che i muscoli delle gambe sono visibili. </li><li> Con le forbici affilate tagliare le gambe del mouse all&#39;altezza delle anche e sopra la testa del femore. </li><li> Posizionare gambe su una capsula di Petri e su ghiaccio. Lavorare velocemente e rimuovere tutti i muscoli per esporre le ossa. </li><li> Femori e tibie separati. Inserire ossa in una soluzione di etanolo al 70% per 5 minuti per rimuovere eventuali batteri e posto immediatamente su un&#39;altra capsula petri contenente 5 ml di DMEM privo di siero. Tagliare osso finisce con forbici affilate e lavare il midollo osseo nel DMEM. Per fare ciò, filo 1 ml di DMEM nell&#39;osso inserendo un ago 26 G attaccato ad una siringa da 5 ml. Assicurarsi che le ossa sembrano bianco (vuoto) dopo lavaggio. </li><li> Raccogliere tutte le cellule del midollo osseo di topi donatori in 10 ml di DMEM. Generare sospensioni singola cella di cellule del midollo osseo passando il raccolto attraverso un colino cella 70 micron. </li><li> Clorecchio sospensioni di cellule singole di cellule del midollo osseo per centrifugazione a 260 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga refrigerata. Risospendere pellet cellulare in 10 ml di PBS. Deplezione delle cellule rosse del sangue utilizzando soluzione rbcL come descritto in 2.1.3 e 2.1.4. </li><li> Contare cellule del midollo osseo utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. Valutare la vitalità cellulare del determinazione delle cellule morte con trypan colorazione blu 13. In modo ottimale, un animale produce singolo di circa 3 x 10 7 globuli bianchi / mouse con una redditività pari ad almeno l&#39;80%. </li><li> In caso di totale chimere del midollo osseo, preparare TLR-3 - cellule o peso del donatore - /. La concentrazione cellulare ottimale è di 2 x 10 7 cellule / ml da 2 x 10 6 cellule in 100 microlitri di PBS saranno utilizzati per il trapianto. Se non utilizzato immediatamente, conservare le cellule del donatore a -80 ° C utilizzando tecniche di congelamento lento e FBS con il 10% DMSO. Per il modello chimerico misto, mescolare le cellule Langerin-DTR-donatori e TLR3 - / - </sup&gt; Le cellule del donatore in un rapporto di 75:25. Preparare una miscela di 75: 25 Langerin-DTR: WT cellule del midollo osseo per generare topi di controllo. </li></ol></li><li> Irradiazione del mouse e trapianto <ol><li> Irradiare topi femmina tra 6-8 settimane di età in una fonte irradiatore cesio-137. Dare topi due dosi di 550 rad 4 ore di distanza. Split irradiazione minimizza la tossicità epatica acuta e quindi riduce il mouse letalità dovuta al protocollo irradiazione. </li><li> Dopo l&#39;irraggiamento, tenere i topi in trattamento con antibiotici per due settimane. Dare antibiotici con l&#39;acqua potabile a 2,5-5 mg di Baytril / kg. </li><li> Di 2 - 4 ore dopo la seconda irradiazione, topi trapiantati con cellule del midollo osseo del donatore per via endovenosa. Effettuare l&#39;iniezione di cellule del donatore via retro-orbitale sinusale iniezione 13 e sotto anestesia isoflurano utilizzando volume massimo di 100 ml di PBS contenente 2 x 10 6 cellule. </li><li> Quattro settimane dopo il trapianto, valutare attecchimento in un campione di 100ml di sangue periferico tramite citometria a flusso utilizzando una macchina in grado di leggere almeno due colori. Per distinguere tra donatore e cellule riceventi radio resistenti, utilizzare commercialmente disponibile CD45.1 fluorescente e anticorpi anti-topo CD45.2 utilizzando diluizioni tra 1/100 e 1/200. Attecchimento ottimale delle cellule del donatore deve essere almeno l&#39;80% del totale delle cellule ematopoietiche nel sangue periferico. </li></ol></li><li> La vaccinazione e mirata esaurimento <ol><li> Vaccinare i topi con il vaccino antinfluenzale vivo attenuato ricombinante via intranasale. Per la vaccinazione del mouse, anestetizzare i topi con il 5% isoflurano in ossigeno utilizzando un vaporizzatore di precisione. Utilizzare una pipetta 200 microlitri di somministrare 50 ml di PBS contenente 10 3 formanti placca unità (PFU) del vaccino. </li><li> Per generare il modello finale del mouse, trattare i topi con 50 ng di DT diluito in 50 ml di PBS intranasale. Somministrare DT goccia a goccia direttamente alle narici di topi anestetizzati come descritto in 3.3.1. Mi TreatCE con dosi giornaliere che iniziano il trattamento in giorno -2 prima della vaccinazione fino al giorno 2 post-vaccinazione (Figura 3B). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio viene descritto come la genetica e modelli di mouse chimerici inversa può essere utilizzata per chiarire i meccanismi fisiologici e molecolari dell&#39;immunità indotta dal vaccino. Influenza genetica inversa è stabilito in molti laboratori e ha svolto un ruolo principale nella comprensione patogenesi dell&#39;influenza, la replica, e la trasmissione 17. Un punto chiave nel nostro protocollo è il salvataggio di vaccini antinfluenzali adattate freddo esprimono epitopi stranieri. Mentre la stra...

La generazione di memoria immunologica in assenza della malattia è la base fisiologica di vaccinazione efficace 1. Recentemente, sistemi di approcci basati biologia, hanno rivelato che i vaccini di successo come il vaccino contro la febbre gialla, inducono una forte induzione di risposte immunitarie innate e l&#39;attivazione di diversi sottoinsiemi di cellule dendritiche (DC), che a loro volta, portano a multilineare attivazione di antigene specifiche cellule T 2,3. Dal momento che le DC sono l&#39;unica popolazione di cellule immunitarie con la possibilità di attivare le cellule T naïve antigene-specifiche 4, lo studio della loro funzione durante la vaccinazione è fondamentale per capire le risposte immunitarie ai vaccini e per progettare strategie future contro gli agenti patogeni difficili. Un sistema che consente di risalire diverse sottopopolazioni PVS durante la risposta immunitaria ai vaccini sarebbe auspicabile, al fine di stabilire un accurato cinetica della migrazione DC a tessuti linfoidi, e quindi quello di fornirecomprensione dei meccanismi fisiologici responsabili per l&#39;avvio di specifici vaccini immunità adattativa. Genetica inversa a base di approcci offrono la possibilità di generare modificato, vaccini vivi attenuati che possono essere utilizzati in via sperimentale con questo scopo. Dal momento della sua attuazione in materia di ricerca di influenza, genetica inversa basata plasmide-è stato ampiamente impiegato per generare ceppi influenzali ricombinanti compreso LAIVs. Protocolli standard per salvare virus influenzali ricombinanti richiedono multi-trasfezione di linee altamente transfectable cellulari con plasmidi ambisense (che producono sia positivi che negativi senso RNA) che contengono i segmenti virali otto influenzali, nonché di amplificazione in un sistema permissiva come Madin-Darby rene canino ( MDCK) cellule e / o di gallina embrionate uova 5. Tuttavia, l&#39;applicazione di genetica inversa per generare strumenti molecolari per studiare i meccanismi immunitari della vaccinazione rimane inesplorato. La generazionedi nuovi modelli di mouse che permettono specifico esaurimento delle sottopopolazioni di cellule del sistema immunitario, tra cui DC, ha aperto nuove possibilità per comprendere i meccanismi immunitari fondamentali alla base di protezione del vaccino-suscitato. Il confronto tra le funzioni sottoinsieme DC nei topi e nell&#39;uomo ha rivelato che, in larga misura, mouse e DCS umani sono funzionalmente omologhe 6,7, questi risultati, suggeriscono fortemente che lo sviluppo di modelli murini consentendo specifica esaurimento delle DC nello stato stazionario e in condizioni infiammatorie, può servire per capire la fisiologia delle risposte DC nell&#39;uomo. Negli ultimi anni una serie di modelli di topo sono state generate portando transgeni esprimenti il recettore simian tossina difterica (DT) (DTR) sotto il controllo della regione del promotore di un gene di interesse 8,9. Dal momento che i tessuti di topo non naturalmente esprimono DTR, questi modelli consentono esaurimento condizionale di sottoinsiemi di cellule che trasportano il gene targeting di interesse sul inoculazione mouse con DT. Così, il nostro ability ad esaurire DC specifici e altri leucociti in vivo durante i processi fisiologici, è stata notevolmente rafforzata dallo sviluppo di ro-based DTR. Tuttavia, mentre questi modelli di topi transgenici sono stati ampiamente utilizzati per comprendere l&#39;ontogenesi del sistema immunitario, la loro applicazione per lo sviluppo del vaccino è stato appena testato. Qui, combinando l&#39;influenza genetica inversa e competitivi chimere del midollo osseo a base di DTR, proponiamo un metodo per studiare la cinetica di vaccino immunità così come la funzione del gene individuo durante la risposta immunitaria ai vaccini in vivo. L&#39;applicazione di questa tecnologia per la valutazione preclinica di nuovi vaccini contro le malattie infettive difficili potrebbe contribuire a razionalizzare la progettazione di vaccini e per testare vaccini candidati in vivo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&acuto; s Medium Eagle modificato (DMEM 1x)</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ovuli embrionati</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M Filtri in nylon</td><td>Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per lisi dei globuli rossi (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 Blocco BD Fc per topi (2.4G2)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-topo SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td><td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-Anti-topo MHCII (Md/114.15.2)eBioscience</td><td></td> <td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-Anti-topo CD11b (M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td><td>Biolegend</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td><td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td><td>BD Bioscience</td><td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -Anti-topo CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-Anti-topo CD3&epsilon; (145-2611)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>Colorante di proliferazione CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil-Solfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ovoalbumina&nbsp;</td><td>Sonde molecolari&nbsp;</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>Tossina difterica (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-TPCK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACcitometro a flusso Canto II</td><td>BD Biosciences Software di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>analisi cellulare FlowJo 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchia blu di tripano (0,4%)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Contacellule automatico Countess</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

intranasale somministrazione di ricombinante influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

I vaccini sono una delle più grandi conquiste dell'umanità e hanno salvato milioni di vite nel corso dell'ultimo secolo. Paradossalmente, poco si sa sui meccanismi fisiologici che mediano le risposte immunitarie ai vaccini, forse a causa del successo complessivo della vaccinazione, che ha ridotto l'interesse per i meccanismi molecolari e fisiologici dell'immunità vaccinale. Tuttavia, diversi importanti agenti patogeni per l'uomo, tra cui il virus dell'influenza, rappresentano ancora una sfida per la vaccinazione e possono trarre vantaggio da strategie basate sul sistema immunitario. 
Sebbene la genetica inversa dell'influenza sia stata applicata con successo alla generazione di vaccini antinfluenzali vivi attenuati (LAIV), l'aggiunta di strumenti molecolari nelle preparazioni di vaccini, come i componenti traccianti per seguire la cinetica della vaccinazione in vivo, non è stata affrontata. Inoltre, la recente generazione di modelli murini che consentono la deplezione specifica dei leucociti durante gli studi cinetici ha aperto una finestra di opportunità per comprendere i meccanismi immunitari di base alla base della protezione indotta dal vaccino. Qui, descriviamo come la combinazione di genetica inversa e modelli murini chimerici possa aiutare a fornire nuove informazioni su come funzionano i vaccini a livelli fisiologici e molecolari, utilizzando come esempio un vaccino influenzale ricombinante, adattato al freddo e vivo attenuato (LAIV). Abbiamo utilizzato LAIV generati in laboratorio che ospitano traccianti cellulari e chimere competitive del midollo osseo (BMC) per determinare la cinetica precoce dell'immunità vaccinale e i principali meccanismi fisiologici responsabili dell'inizio dell'immunità adattativa specifica per il vaccino. Inoltre, mostriamo come questa tecnica possa facilitare gli studi sulla funzione genica in singoli animali durante le risposte immunitarie ai vaccini. Proponiamo che questa tecnica possa essere applicata per migliorare le attuali strategie profilattiche contro gli agenti patogeni per i quali sono necessarie contromisure mediche urgenti, ad esempio l'influenza, l'HIV, il Plasmodium e i virus della febbre emorragica come il virus Ebola.

Generazione di ricombinanti vaccini influenzali vivo attenuato può essere ottenuto mediante trasfezione di plasmidi che codificano le otto segmenti del virus dell&#39;influenza sotto il controllo di promotori bidirezionali 5. Un vaccino influenzale adattato fredda solito contiene sei segmenti di un ceppo adattato fredda, nonché l&#39;HA e NA del ceppo influenzale di scelta (ad esempio, H1N1) (Figura 1A). Il principio di freddo-adattamento si basa sulla replicazione virale limitato a ...

C'è una generale mancanza di conoscenza su come funzionano i vaccini. Qui proponiamo l'uso combinato della genetica inversa e dei topi chimerici del midollo osseo per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie precoci dell'ospite ai vaccini, con particolare attenzione alle cellule dendritiche e all'immunità delle cellule T.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere un sistema per valutare l'attivazione fisiologica dell'immunità adattativa specifica per il vaccino. Questo viene raggiunto innanzitutto utilizzando la genetica inversa per generare vaccini antinfluenzali vivi attenuati contenenti un peptide immunogeno specifico, quindi utilizzando un embrione di pollo per moltiplicare il virus. Successivamente, le cellule vengono prelevate dai linfonodi di topi vaccinati e l'analisi fax viene utilizzata per tracciare la migrazione delle cellule dendritiche.Nel saggio successivo, le cellule T CD8 positive reattive al peptide immunogeno vengono marcate e iniettate in topi vaccinati, seguite da analisi FACS per misurare la proliferazione di tali cellule e analizzare la risposta immunitaria in modo più dettagliato. Viene realizzato un chimero competitivo del midollo osseo infondendo cellule del midollo osseo esprimenti il recettore della tossina difterica in topi congeneici irradiati, che vengono successivamente esposti alla tossina difterica. Dopo un'esaurimento riuscito, il topo viene vaccinato e vengono utilizzati anticorpi marcati e tetramer per identificare le cellule T CD8 positive.Riconoscim

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Lenhard, A. et al. Un modello murino per la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno dopo la co-infezione virale riproduce la malattia aggravata dall'età. J. Vis. Esp. (2022)Questo video mostra un modello di co-infezione topina in cui il virus influenzale innesca la transizione di Streptococcus pneumoniae da colonizzatore a patogeno. Descrive le fasi coinvolte nella colonizzazione batterica, nelle infezioni virali e nella progressione della malattia.

Un modello murino per studiare la transizione patogena di Streptococcus pneumoniae dopo la co-infezione virale

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

Questo video dimostra l'immunizzazione BCG intranasale nei topi, attivando risposte immunitarie sia innate che adattative, portando allo sviluppo di cellule T di memoria residenti nei polmoni e cellule B effettrici, migliorando così la protezione contro le infezioni da Mycobacterium.

Immunizzazione intranasale con BCG in un modello murino

Il video mostra un metodo per creare virus influenzali ricombinanti adattati al freddo. Comporta la trasfezione di cellule umane con plasmidi bidirezionali, seguita dall'incubazione a temperatura più bassa per produrre virus adatti alla produzione di vaccini, caratterizzati da una ridotta replicazione in condizioni più calde.

Generazione di virus influenzali vivi attenuati ricombinanti per vaccini

Dimostriamo la procedura per l'inoculazione intra-tracheale di Haemophilus influenzae nel tratto respiratorio inferiore dei topi. Questo è uno strumento molto utile per studiare le vie di segnalazione che regolano l'infiammazione delle vie aeree nei modelli murini.

Intra-tracheale Amministrazione<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In modelli murini per studiare infiammazione delle vie aeree

Influenza A virus (IAVs) è importanti patogeni respiratori umani. Per capire la patogenicità di IAVs e per eseguire test preclinici di approcci vaccinali romanzo, modelli animali che imita la fisiologia umana sono necessari. Qui, descriviamo le tecniche per valutare IAV patogenesi, le risposte umorali e l'efficacia del vaccino utilizzando un modello murino di infezione.

Studi del Virus di riossidazione A in un modello murino di infezione

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Questo documento descrive i protocolli di valutazione della risposta Tfh e GC B nel modello di topo di infezione da virus influenzale.

Valutazione delle cellule di aiuto follicolare T e della risposta del centro germinale durante l'infezione da virus influenzale A nei topi

Questo protocollo fornisce istruzioni per la somministrazione intranasale di IAV e l'analisi a valle del danno polmonare di topo e delle modifiche trascrizionali associate ai tipi di cellule polmonari.

Modellazione della riparazione alveolare polmonare displastica e funzionale dopo l'infezione influenzale

Scopri come valutare l'immunità adattiva indotta da vaccini influenzali ricombinanti nei topi chimerici. Questo metodo combina genetica inversa e analisi delle cellule dendritiche per studiare le risposte immunitarie.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

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