Name: Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a visualizzare la migrazione dei neuroni granulari nel cervelletto postnatale utilizzando la macroscopia confocale. Questo metodo permette di studiare i fattori endogeni che regolano la migrazione neuronale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Istituto per la Ricerca e l&#39;Innovazione in Biomedicina (IRIB), la piattaforma di imaging cellulare della Normandia (PRIMACEN), Inserm, IBiSA, l&#39;Università di Rouen, il Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR - PERENE, Interreg 4A), il LARC-Neuroscienze di rete e la regione Alta Normandia.

Animali (maschi o ratti Wistar femmine) sono nati e allevati in una struttura accreditata animali (approvazione B.76-451-04), secondo la guida francese per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. Gli esperimenti sono stati condotti sotto la supervisione di ricercatori autorizzati (MB, DV e LG), in conformità con la Direttiva Europea del Consiglio della Comunità (2010/63 / UE del 22 settembre 2010) e del Ministero dell&#39;Agricoltura francese. 1. Preparazione di mezzi e strumenti <ol><li> In un armadio di sicurezza biologica, preparare BSS di 1x Hank (HBSS) in acqua sterile da 10x soluzione madre contenente CaCl 2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l), senza MgCl 2. Aggiungere NaHCO3 (350 mcg / ml) a 1x soluzione di HBSS. </li><li> In un armadio di sicurezza biologica, aggiungere N2 supplemento (da una soluzione madre 100x) e la penicillina (100 unità / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) soluzione per mezzo aquila modificato (DMEM) mix nutriente Dulbeccoture F-12 (1: 1). </li><li> In condizioni sterili, preparare una aliquota (25 microlitri, 2 mM) del citoplasmatico colorante fluorescente cosiddetto Cell Tracker verde in DMSO (1.075 ml di 1 mg). Diluire un&#39;aliquota in 5 ml di DMEM in un tubo da 15 ml. </li><li> Preparare riempito portaghiaccio per mantenere i media a 4 ° C. </li><li> Decontaminare parti superiori del banco di laboratorio e gli strumenti con il 70% di etanolo. </li></ol> 2. La dissezione di cervelletto di ratti P10 <ol><li> Rapidamente decapitare cuccioli di ratto (P10) con le forbici curve di funzionamento dietro le orecchie, al fine di ottenere l&#39;inizio del midollo spinale. </li><li> Al lato posteriore della testa decapitata, fare mediana incisione della pelle dal collo al naso con iris belle forbici e separare la pelle dal cranio con iris belle forbici e Dumont # 3 pinze. </li><li> Usare bene le forbici iris per fare delicatamente due incisioni laterali dalla base alla regione rostrale del cranio. Rimuovere il teschio sezionato con due # 3 pinze. Staccare il reggisenoin qualsiasi aderenza con il cranio con le stesse pinze. </li><li> Trasferire il cervello con l&#39;estremità di un cucchiaio spatola per capsula di Petri (Ø 35 mm) contenente 2 ml di ghiacciata HBSS medio. </li><li> Mettere la piastra di Petri contenente il cervello in una capsula di Petri grande (Ø 100 mm) pieno di ghiaccio e trasferimento alla fase dello stereomicroscopio. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, isolare il cervelletto dal cervello da dilacerazione utilizzando due # 3 pinze. Analogamente, rimuovere il midollo spinale residuo e la piale-membrana. </li><li> Trasferire il cervelletto in un nuovo piatto di Petri HBSS-riempita (Ø 35 mm, 2 ml) con la fine cucchiaino di una spatola e tenere in ghiaccio. </li></ol> 3. Preparazione di acuta cerebellari fette <ol><li> Sotto lo stereomicroscopio, tagliare il cervelletto tra verme e l&#39;emisfero destro come indicato dalle due teste freccia in figura 2A con uno standard manico bisturi # 3 solido e una lama chirurgica # 15. </li><li> Mettere una goccia di cianocolla oacrylate sul disco dei campioni vibratome e aspettare 15-25 secondi per eliminare vapori di solventi tossici. </li><li> Raccogliere il cervelletto taglio con l&#39;estremità cucchiaino di una spatola e rimuovere l&#39;eccesso HBSS con tovaglioli di carta puliti. </li><li> Portare il cervelletto vicino al disco di preparato. Fissare il bordo tagliato al disco campione e attendere 10 secondi. </li><li> Inserire il disco di preparato nel vassoio buffer con il manipolatore, e ruotarla in modo all&#39;asse trasversale del cervelletto è perpendicolare al portalama. Fissare il disco di preparato con una chiave a brugola e riempire con delicatezza il vassoio buffer con HBSS medio fino a quando il cervelletto è coperto. </li><li> Carico ghiaccio tritato nel bagno di raffreddamento. </li><li> Pulire i tre volte lama con il 70% di etanolo per eliminare l&#39;olio. </li><li> Inserire la lama nel porta-lama e fissarlo con la vite di fissaggio. </li><li> Posizionare il bordo destro della lama dietro il bordo posteriore (dal punto di vista dell&#39;utente) del campione e definire come punto di partenza. Utilizzare avanti comando per definire tegli punto finale dopo il bordo anteriore del campione. </li><li> Selezionare sezionamento velocità a 2,5 e sezionamento frequenza 8. Selezionare lo spessore di taglio a 180 micron. Avviare sezionamento dei tessuti. </li><li> Pick up ogni sezione con un bicchiere ampio tunnel troncato pipetta Pasteur e trasferimento in HBSS contenenti capsula di Petri (Ø 35 mm) tenuti in ghiaccio. </li><li> Utilizzando due # 5 pinze, rimuovere le meningi accuratamente dal cervelletto quando interferire con la lama. Raccogliere un massimo di 5 fette al cervelletto (Figura 2B, C). </li><li> Rimuovere le meningi dalle fettine cerebellari accuratamente con due # 5 pinze allo stereomicroscopio e separare i lobuli dolcemente per meglio sonda carico. </li></ol> 4. fluorescente colorazione delle condizioni di vita Interneuroni <ol><li> Trasferimento fette cerebellare con una pipetta Pasteur di vetro ampio tunnel troncato a un 6-pozzetti (max 3 fette / per pozzetto). Aspirare il mezzo HBSS. </li><li> Incubare fette (3 max) in 5 ml di lsoluzione oading del colorante fluorescente (10 mM). </li><li> Per proteggere dalla luce, coprire la micropiastra con un foglio di alluminio. Mettere su un tavolo giroscopio-mobile a 35 rpm per 10 minuti a RT per facilitare marcatura delle cellule. </li><li> Fette di trasferimento sulla membrana di un Transwell inserto (3,0 micron dimensione dei pori; Figura 2D) con una pipetta Pasteur di vetro wide-bore troncato. Aspirare il mezzo carico con pipetta. </li><li> Togliere l&#39;inserto e riempire il pozzo con 1,9 ml di DMEM. Sostituire l&#39;inserto e aggiungere 100 ml di DMEM sulla parte superiore della fetta per coprire il tessuto. </li><li> Posizionare la piastra contenente gli inserti culturali nella camera incubatrice (37 ° C, 5% di CO 2) per 2 ore, che è sufficiente osservare GC in ML. Lie tessuti piane per consentire attacco sulla membrana inserto (figura 2E). Assicurarsi che le fette non stanno asciugando. </li></ol> 5. ex vivo Imaging Attraverso confocale macroscopia <ol><li> Trasferire il piatto senzail coperchio di plastica in un incubatore fissare al supporto di un macroscope confocale. Mettere un coperchio di vetro sull&#39;inserto piatto del macroscopio. Mantenere la temperatura della camera a 37,0 ° C ± 0,5 ° C, e forniscono le fette con flusso di gas costante (95% O 2, 2 5% CO) attraverso i portapiatti per mantenere costante il pH. Attendere per 2 ore supplementari prima dell&#39;esperimento time-lapse. </li><li> Per visualizzare la distanza di migrazione GC nelle fettine di tessuto, illuminare la preparazione con una luce di lunghezza d&#39;onda 488 nm per mezzo di un diodo laser attraverso un macroscopio confocale a scansione laser dotata di un obiettivo a secco X2 (lavoro: 39 mm, diametro 58 mm, NA = 0,234), e rilevare emissione di fluorescenza 500-530 nm. <ol><li> Per risolvere finemente il movimento di GC, acquisire immagini con un ulteriore fattore di zoom ottico di 1,5-2,0. Raccogliere immagini di GN in un singolo piano focale o fino a 10 differenti piani focali lungo l&#39;asse z ogni 30 min fino a 12 ore. </li></ol></li&gt; <li> Quando necessario, rimuovere il coperchio di vetro e aggiungere piccoli volumi (1-10 microlitri) di attivatori biologici o inibitori in DMEM con una pipetta 10 microlitri di studiare il loro effetto sulla migrazione GC. </li></ol> Monitoraggio 6. cellulare <ol><li> Per ogni volta del film, effettuare z-stack proiezione attraverso la modalità Ecart-tipo in ImageJ. Modulare il contrasto ei livelli di luminosità delle immagini successive per facilitare l&#39;identificazione e la tracciabilità di GC etichettati. Mappa manualmente ogni posizione dell&#39;istantanea riferimento (t = 0). <ol><li> Utilizzare il plugin &quot;traccia manuale&quot; nel menu di particelle Analizzare e determinare cliccando sul punto di gravità di ogni cellula del corpo durante time-lapse. Esportare i dati di tracciamento grezzi in un foglio di calcolo. </li></ol></li><li> Riorganizzare i dati di tracciamento prime esportate da ImageJ con un programma intelligente fatta in casa (http://primacen.fr, scritto in codice PHP) che identifica ogni cellula e le posizioni associate. Utilizzando il programma, calculatall&#39;e la distanza totale percorsa e la velocità media di migrazione per ogni cella. Classificare e confrontare le caratteristiche della migrazione delle cellule in condizioni di controllo e di trattamento sotto opportuni filtri che utilizzano lo stesso programma. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive la cultura del P10 ratto fettine di cervelletto acute nel sistema Transwell e la marcatura fluorescente di GC con un colorante verde fluorescente per studiare la migrazione delle cellule durante lo sviluppo postnatale attraverso macroscopia confocale. Questo protocollo permette osservazioni della migrazione delle cellule per un periodo fino a 12 ore e le prove di possibili ruoli di fattori, tra cui la migrazione agonisti o antagonisti di neuropeptidi, inibitori dell&#39;enzima, segnalazione cellulare modulatori o sostanze tossiche durante l&#39;esperimento di regolazione. Un piccolo foro nell&#39;inserto membrana con un puntale è necessario per facilitare la somministrazione di composti nel mezzo di incubazione. Una curva puntale fatta in casa può essere utilizzato per facilitare la fornitura di soluzione. Una questione di studi di migrazione cellulare in viva fette di tessuto è che i movimenti del tessuto stesso può fare il monitoraggio difficili cellulare. Mentre gli approcci precedenti hanno proposto per stabilizzare dolcemente slices con una rete di nylon, o di un sottile strato di coda di ratto collagene 7,17, un importante vantaggio di questa tecnologia è la semplice e diretto trasferimento di una piastra di coltura a 6 pozzetti contenenti cerebellare fette su inserti membrana dal CO 2 incubatore all&#39;obiettivo di un macroscope confocale. Temperatura integrato e di CO 2 controller forniscono anche parametri ambientali adeguate e costanti essenziali per la migrazione delle cellule 9. Pertanto, condizioni di coltura sono mantenuti durante le osservazioni ed i movimenti dei tessuti sono ridotte al minimo in quanto le fette sono ben attaccati alla membrana inserto. Stabilizzazione del tessuto viene verificata seguendo la posizione dei bordi fetta o cellule di Purkinje che devono essere corretti riferimenti durante l&#39;acquisizione. Inoltre, fettine cerebellari (da 12 a 18) distribuiti nelle 6 pozzetti della piastra possono essere rapidamente osservati in dettaglio con un tavolino motorizzato ed uno zoom ottico. A causa della grande distanza di lavoro (X2, 39 mm) dell&#39;obiettivo secca, epi-osservazione è libera di immersione e somministrazione di composti nel mezzo di coltura è molto più facile. Pertanto, i parametri ambientali e le similitudini di sostegno della cultura di CO 2 incubatore e confocale macroscopia portano ad un massimo di conservazione del campione biologico. Un altro vantaggio del protocollo è il grande campo visivo e di conseguenza il numero di celle che possono essere osservati simultaneamente. Ad esempio, abbiamo precedentemente determinato che la densità di GC fluorescenti con migrazione radiale nella ML era 1124 ± 138 cellule / mm 2 18. Macroscopia confocale (X2, NA = 0,234) ha una risoluzione laterale inferiore rispetto alla microscopia confocale (40X, NA = 1.25), ma cellule corpi di GC possono essere facilmente monitorati e la velocità media delle migrazioni è comparabile tra i due approcci tecnologici 7,18 . Oltre miglioramento tecnico per le acquisizioni di immagini, la qualità di fette di tessuto e the la qualità dell&#39;etichettatura sono punti chiave per esperienze di successo. Tenere sempre i supporti e tessuti su ghiaccio durante i processi di dissezione, eliminare olio su vibratome lame e non utilizzare le fette di tessuto a contatto con la colla. Sezioni sagittali e trasversali sono adattati a radiali e tangenziali migrazione rispettivamente. Utilizzare diverse lunghezze di incubazione per il rilevamento appropriata nei diversi strati corticali del cervelletto. Tempi di incubazione lunghi (fino a 8 ore) sono necessari per rilevare la migrazione di numerosi GC nel PCL e il IGL. Dal momento che la migrazione GC è un processo fisiologico durante le finestre spazio-temporali specifici, il controllo positivo è che le cellule devono migrare correttamente. In particolare, numerosi GC mandrino nel ML è uno degli indici di salute principale per cerebellare fette sagittali. Per gli esperimenti di partenza, l&#39;osservazione dei movimenti GC nella ML è suggerito. Infatti, la forma di GC con corpo cellulare allungato verticalmente dovrebbe essere considerato come un punto di riferimento per avviare acquisizione con successivo controllo (2 ore) e trattamento (2 ore) periodi che possono essere facilmente eseguite nella ML. Coloranti fluorescenti, come la famiglia Tracker cellulare o proteine ​​fluorescenti espresse attraverso costrutti genetici possono essere utilizzati come traccianti per gli studi di migrazione cellulare. A causa delle cinetiche lente delle migrazioni GC (1 pila ogni 30 min), esperimenti multicolore possono essere eseguite in modo sequenziale dal 4 laser travi (405, 488, 532 e 633 nm) sono disponibili sul sistema. Considerando la migrazione radiale centripeta e centrifuga, il monitoraggio di altri interneuroni possono anche essere realizzati 18. In particolare, meno numerosi tipi di cellule possono essere facilmente localizzati con un ampio campo di vista. Infine, questo protocollo può essere usato per studiare la migrazione delle cellule in altri stadi di sviluppo cerebellare ma anche altre aree del cervello.

Nel cervelletto in via di sviluppo, otto diversi tipi di neuroni sono prodotti in sequenza tra la seconda settimana embrionale e la seconda settimana postnatale nei roditori 1. Provenienti inizialmente da una zona germinale primaria, granuli immaturi (GC) sono gli ultimi neuroni da produrre dallo strato esterno granulare (EGL), una zona germinale secondario 2. Durante le prime tre settimane postnatali, la corteccia cerebellare è una struttura lamellare organizzata in quattro strati tra cui la EGL, lo strato molecolare (ML), lo strato di Purkinje cella (PCL) e lo strato granulare interno (IGL) (Figura 1). Attraverso la migrazione centripeta, immaturo GC, interneuroni glutamatergiche, raggiungere la IGL entro circa 2 giorni. Con la terza settimana post-natale, la EGL scompare e l&#39;IGL costituisce il cosiddetto strato granulare (GL) nel cervelletto adulto. Nella GL, GC ricevere ingressi sinaptici eccitatori da fibre muschio e le cellule pennello unipolari, eingressi sinaptici inibitori di assoni delle cellule Golgi. Nel ML, assoni GC fanno sinapsi eccitatorie con i neuroni GABAergici, comprese le cellule di Purkinje, cellule cestino, cellule stellate e cellule Golgi 2. Osservazione in tempo reale di movimento delle cellule in fettine cerebellari acute ottenuti dai primi roditori postnatali dimostra che GCs modificano la loro forma in concomitanza con i cambiamenti nella modalità e la velocità di migrazione durante il loro percorso nella corteccia cerebellare 3. Nelle prime due settimane postnatali, precursori GC proliferano attivamente nella parte superiore della EGL. Nella parte centrale della EGL, postmitotici GC migrare tangenzialmente nella direzione del loro processo più ampio. Al confine EGL-ML, GC rallentare il loro movimento, le cellule iniziano a entrare in un processo breve discesa verticale nella ML. Nel ML, GC ha un corpo cellulare allungato in verticale, un processo finale sottile e un processo che porti più voluminoso, e migrano radialmente lungo le fibre gliali Bergmann. NelPCL, GC fermare il loro movimento, ma dopo una fase stazionaria prolungata (2 ore), che attraversano la frontiera PCL-IGL. Nel IGL, GC migrano verso il fondo dello strato in assenza di supporto in fibra gliale. Una volta che le punte del processo che conduce avvicinarsi al confine sostanza IGL-bianca (WM), GC lento e l&#39;arresto del movimento. Sezioni trasversali del cervelletto sono preferiti per studi sulle migrazioni tangenziali nel EGL mentre fette sagittali sono dedicati alla migrazione radiale nel ML, PCL e IGL. Alcuni fattori di regolamentazione dei movimenti GC compreso neuropeptidi (ad esempio, la somatostatina, PACAP) sono stati individuati finora, ma i meccanismi completi coinvolti nel controllo spazio-temporale delle migrazioni GC in ogni strato corticale sono ancora in gran parte sconosciute 1,4,5,6. Migrazione GC è stato studiato nel corso degli ultimi 20 anni attraverso video e microscopia confocale in illuminazione luce sia trasmessa per colture cellulari isolate o rivelazione a fluorescenza per acufettine cerebellari te. DII Inizialmente lipofile e, più recentemente &quot;Tracker cellulare&quot; coloranti e proteine ​​fluorescenti di cellule espresso sono stati utilizzati per confocale o microscopia a due fotoni 7,8. Esperimenti di successo dipendono da una serie di procedure specifiche che rendono il protocollo semplice ma non facile. In particolare, fette acuta devono essere stabilizzati durante le osservazioni generalmente con una fatta in casa di nylon della maglia della rete 9. L&#39;intensità di illuminazione luce deve essere la più bassa possibile per evitare fototossicità e photobleaching come proposto dalla scansione multipoint approccio microscopio confocale. Inoltre, la temperatura e CO 2 sono parametri ambientali da instabilità possono influire migrazione neuronale. Per facilitare e perfezionare le procedure sperimentali, abbiamo sviluppato un protocollo macroscopia confocale che limita i movimenti fetta, assicura parametri ambientali costanti, riduce photobleaching, aumenta il campo visivo (dell&#39;ordine di millimetri) e consequdipendentemente dal numero di cellule (decine) che possono essere monitorati mediante analisi dell&#39;immagine. Così, 180 micron fette spesse sono coltivate su inserti di membrana, e 6 pozzetti vengono trasferiti direttamente sotto un obiettivo motorizzato 2X di un macroscope confocale commerciale dotata di una grande camera di incubazione, la temperatura e CO 2 controller e un sistema di controllo delle vibrazioni. Time-decade e z-stack vengono poi effettuate per diverse ore e strumenti farmacologici o molecole bioattive possono essere aggiunti o consegnati nel mezzo di incubazione. Questo metodo potrebbe anche essere adattato per studiare la migrazione degli altri tipi di neuroni nel cervelletto o cerebrum a diversi stadi di sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s miscela di nutrienti eagle medium modificato (DMEM) F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Canada</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Integratore di Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Inserti in poliestere Transwell-Clear</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>cluster di colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale diametro 35 mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale diametro 100 mm</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polipropilene (15 ml)</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 70%</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica cappa per aspirazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Classe II A2</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta a volume regolabile (0,5-10 &; L)</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>Gyro-rocker, incubatore SSL3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2, Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtomo a lama vibrante, VT1000S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macroscopio confocale, TCS LSI</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-controller</td><td>Stereomicroscopio PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, M205 C</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici operatorie, curve, smussate/smussate</td><td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a iride fine temprate, dritte, affilate/affilate</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #3 e #5</td><td>FST</td><td>11293-00 e 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Lame per iniettori vibratome/bordo singolo</td><td>Leica Microsystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi standard #3 solido</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica #15</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare utilizzando confocale macroscopia

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Durante lo sviluppo postnatale, granuli immaturi (interneuroni eccitatori) mostrano migrazione tangenziale strato granulare esterno, e poi la migrazione radiale nello strato molecolare e lo strato di cellule di Purkinje per raggiungere lo strato granulare interna della corteccia cerebellare. Predefinito in processi migratori induce o morte cellulare o smarrimento dei neuroni, portando a deficit in diverse funzioni cerebellari. Migrazione cellulare granule centripeta coinvolge diversi meccanismi, come chemiotassi e degradazione della matrice extracellulare, per guidare le cellule verso la loro posizione finale, ma i fattori che regolano la migrazione delle cellule in ogni strato corticale sono solo parzialmente noti. Nel nostro metodo, fettine cerebellari acute sono preparati da P10 ratti, cellule granulari sono etichettati con un marcatore fluorescente e citoplasmatica tessuti sono coltivate su inserti membrana da 4 a 10 ore prima di iniziare il monitoraggio in tempo reale della migrazione cellulare da macroscopia confocale a 37 ° C nelpresenza di CO 2. Durante la loro migrazione nei diversi strati corticali del cervelletto, i granuli possono essere esposti agli agonisti o antagonisti neuropeptidi, gli inibitori della proteasi, antagonisti di effettori intracellulari o sostanze addirittura tossiche come alcol o metilmercurio per indagare il loro possibile ruolo nella regolazione della migrazione neuronale .

Nei primi anni del cervelletto postnatale, GC mostrano cambiamenti significativi nella loro modalità e la velocità di migrazione che attraversano diversi strati corticali 1 (Figura 1). Questa sezione illustra esempi di risultati che si possono ottenere attraverso lo studio della migrazione GC nel loro ambiente cellulare naturale. P10 ratto fette di tessuto cerebellare etichettati con un colorante fluorescente verde sono esaminati al macroscopio confocale (Figura 3A) e ci dimostrano che GC migrano radialmente in ML con una velocità media di 18 micron / ora (Figura 3B, C). Ad oggi, il ruolo delle interazioni / comunicazioni tra le cellule neuronali e gliali compresi i fattori normativi e meccanismi molecolari coinvolti nel controllo della migrazione delle cellule in ogni strato corticale sono in gran parte sconosciuti. Di conseguenza, il problema principale è quello di identificare neuropeptidi, neurotrasmettitori, neurotrofine e componenti della matrice extracellulare che potrebbero giocare un ruolo in questi corticale layer-specicambiamenti FIC della velocità durante il loro processo di migrazione. Ipofisi adenilato-ciclasi attivando polipeptide (PACAP) viene rilevata principalmente nel PCL, ma anche nella ML e l&#39;IGL durante le prime due settimane postnatali nel roditori 7,10,11. Applicazione PACAP38 (10 -6 M) al mezzo di coltura ha comportato una riduzione della velocità 79% della GC nella ML. Ad esempio, la velocità di migrazione di GC del ML sceso da 11,9 micron / hr in condizioni di controllo a 2,5 micron / hr dopo somministrazione di PACAP38 (Figura 4A). Tissue-tipo attivatore del plasminogeno (tPA) è un membro della cascata proteolitica che porta alla degradazione dei componenti della matrice extracellulare (EM), come ad esempio molecole di adesione cellulare o laminina 12,13. tPA e plasminogeno, un substrato di tPA, vengono rilevati in strati corticali durante lo sviluppo del cervelletto 14,15,16 postnatale. La somministrazione di PAI-1 (10 -7 M), un inibitore di tPA endogena, ridotto del 78% GCmigrazioni nella ML. Ad esempio, GC ridotta velocità di migrazione nel ML da 19,2 micron / hr in condizioni di controllo a 4,2 micron / hr dopo l&#39;aggiunta del PAI-1 (Figura 4B). Questi risultati indicano che PACAP esercita un effetto inibitorio diretta sui movimenti GC e che la serina proteasi tPA facilita la migrazione di GC nella ML del ratto sviluppo del cervelletto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figura 1: rappresentazione 3D della migrazione GC nella corteccia cerebellare postnatale. 1-4, estensione dei processi di GC e la migrazione tangenziale in EGL. 5, la migrazione radiale nella ML lungo Bergmann fibre gliali. 6, transitoria fase stazionaria nel PCL. 7, migrazione Glial indipendente radiale nel IGL. 8, completamento della migrazione GC nel IGL GC, cellule dei granuli, in rosso;. EGL, Strato granulare esterno; B, Bergmann glia, in viola scuro, G, cellule Golgi, in giallo, cf, fibre rampicanti, in azzurro, g, granuli postmigratory, in verde chiaro, IGL, strato granulare interno; mft, fibra di muschio terminale, in verde scuro, ML, strato molecolare, P, cellula di Purkinje, in viola chiaro, strato PCL, Purkinje cellule. Questo dato è stato modificato da 5. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figura 2: ex vivo cultura del P10 fettine cerebellari (A) cervelletto Dissected dal P10 di ratto.. Barra di scala = 6 mm. (B) Micrografia di vivere a 180 micron di spessore fetta cerebellare attraverso stereomicroscopia. Barra di scala = 3 mm. (C) Aun ingrandimento maggiore, i quattro strati corticali (EGL, ML, PCL, IGL) del cervelletto sono già distinguibili. Barra di scala = 1 mm. (D) Dopo la marcatura fluorescente, fette di tessuto sono collocati su inserti cultura (diametro 24 mm) in un 6-pozzetti. (E) Rappresentazione schematica di un inserto culturale con membrana in poliestere coltura di tessuti trattati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figura 3: la migrazione dinamica dei CV negli strati corticali di ratto P10 cervelletto (A) Vista Macroconfocal (xyz, proiezione 2D) di una fetta cerebellare P10 ratto in cui GC sono etichettati con un colorante fluorescente verde citoplasmatica.. Barra di scala = 75 micron. (B) Time-lapse imaging mostra GCmovimenti nella ML di macroscopia confocale per 4 ore in condizioni di controllo. Asterisco (*) indica il simbolo soma GC. Tempo (in minuti) è indicato nella parte inferiore di ciascuna microfotografia. Barra di scala = 10 micron. (C) le modifiche sequenziali nella distanza percorsa dal GC soma. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figura 4:. Effetto del neuropeptide e proteasi inibitore della migrazione GC (A) GC è stata monitorata in ML da macroscopia confocale per 2 ore in condizioni di controllo e poi per 2 ore in presenza di Pituitary adenilato-ciclasi attivando polipeptide (PACAP). (B) GC è stata monitorata in ML da macroscopia confocale per 2 ore in condizioni di controllo e poi per 2 ore in presenza di inibitore dell&#39;attivatore del plasminogeno-1 (PAI-1).

Durante lo sviluppo postnatale del cervelletto, le cellule granulari immature originate dalla zona germinale mostrano modalità distinte di migrazione per raggiungere la loro destinazione finale e per stabilire reti neuronali. Questo protocollo descrive la preparazione di fette cerebellari e l'approccio macroscopico confocale utilizzato per studiare i fattori che regolano la migrazione neuronale.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i neuroni in migrazione in fette cerebrali vive. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando il cervelletto di un ratto postnatale di 10 giorni (P10). I passaggi successivi consistono nel preparare fette cerebellari acute e nel marcare i neuroni con una sonda fluorescente.Successivamente, l'esperimento in time-lapse viene eseguito mediante imaging confocale macroscopico o microscopia confocale. L'ultimo passaggio consiste nel tracciare i neuroni nei filmati ottenuti. Infine, la microscopia ex vivo viene utilizzata per evidenziare il ruolo di fattori endogeni o sostanze tossiche che regolano la migrazione neuronale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale è che l'immagine confocale macro aumenta il campo visivo, consentendo di lasciare le fettine cerebrali direttamente posizionate sull'inserto per l'inguine. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando incontrai difficoltà nel trasferire e stabilizzare le fettine cerebrali per esperimenti di microscopia confocale. Inizia accedendo al cranio della testa di un ratto P10 decapitato, utilizzando forbici da iride fini per effettuare delicatamente due incisioni laterali dalla base fino alla regione rostrale del cranio. Quindi rimuovi il cranio dissezionato con due pinze numero tre, rompendo qualsiasi adesione tra il cervello e il cranio.Ora, prelevare il cervello con l'estremità a cucchiaio della spatola e trasferirlo in una piastra Petri da 35 millimetri contenente due millilitri di HBSS freddo su ghiaccio. Successivamente, sotto un microscopio stereoscopico, isolare il cervelletto dal cervello mediante incisioni D utilizzando due pinzette numero tre. Trasferire il cervelletto con la spatola in una nuova piastra contenente tampone ghiacciato.Quindi, utilizzando gli stessi strumenti, rimuovere e scartare il midollo spinale residuo e la membrana pellicolare. Preparare un manico per bisturi solido di numero tre con una lama chirurgica numero 15. Utilizzando la lama sotto un microscopio stereo, tagliare il cervelletto tra il verme e l'emisfero destro.Ora, al vibrato, applicare una goccia di colla cianoacrilica sul disco del campione e attendere da 15 a 25 secondi affinché i vapori del solvente si disperdano prima di trasferire il cervelletto sul disco. Successivamente, fissare il bordo del cervelletto al disco del campione e attendere 10 secondi. Ora, utilizzando il manipolatore, inserire il disco del campione nel vassoio tampone in modo che l'asse trasversale del cervelletto sia perpendicolare al supporto della lama.Assicurarsi di fissare il disco utilizzando una chiave in alluminio. Quindi coprire con attenzione il cervelletto con HBSS e aggiungere ghiaccio tritato nel bagno di raffreddamento. Per sezionare il campione, posizionare una lama pulita in modo che il suo bordo sia esattamente dietro il margine posteriore del campione.Definire questo punto come punto di partenza per la formazione del ghiaccio. Quindi utilizzare il comando di avanzamento per definire il punto finale appena oltre il bordo anteriore del campione. Impostare ora lo spessore della fetta a 180 micrometri.Impostare quindi la velocità di sezionamento a 2,5 e la frequenza a otto, quindi avviare il sezionamento del campione. Raccogliere fino a cinque sezioni per ogni cervelletto. Prelevare ogni sezione utilizzando una pipetta di vetro larga troncata.Trasferire le sezioni in una piastra contenente HBSS freddo su ghiaccio. Dopo aver raccolto le fette sotto un microscopio stereoscopico, rimuovere con attenzione le meningi utilizzando due pinzette numero cinque. Inoltre, separare delicatamente gli LOE per un migliore carico della sonda.Dopo aver sezionato il campione, utilizzare una pipetta larga troncata per trasferirlo con un po' di HBSS in una piastra a sei pozzetti, inserendo fino a tre sezioni in ogni pozzetto. Successivamente, dopo aver rimosso il mezzo da ciascun pozzetto caricato, aggiungere cinque millilitri di soluzione di carico contenente 10 micromolar del colorante fluorescente, proteggendo i campioni dalla luce, e coprire la piastra con della pellicola d'alluminio. Quindi posizionare la piastra su un agitatore impostato a 35 giri al minuto.Lasciare in incubazione la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente in modo che il colorante etichetti le cellule nei pozzetti. Trasferire quindi le sezioni come in precedenza sulla membrana di un inserto transwell dotato di pori di tre micron. Aspirare quindi il mezzo di carico, lasciando solo le sezioni.Ora rimuovere l'inserzione e le fette per riempire la pozzetta con 1,9 millilitri di DMEM. Quindi reinserire l'inserzione e aggiungere altri 100 microlitri di DMEM per coprire i tessuti. Incubare questa preparazione per due ore, dopo le quali le cellule granulari saranno visibili.Trasferire la piastra senza coperchio in una camera ambientale con flusso costante di gas su un microscopio confocale. Quindi posizionare il vetrino coprioggetto sull'inserimento della piastra del microscopio confocale per esperimenti in time-lapse. Lasciare incubare le cellule nella camera per altre due ore prima di procedere.Per visualizzare le cellule granulari in migrazione nelle sezioni di tessuto, illuminare il preparato con luce a 488 nanometri e utilizzare un obiettivo secco 2x. Rilevare le emissioni fluorescenti da 500 a 530 nanometri utilizzando ImageJ. Per ogni immagine del filmato in time-lapse, eseguire una proiezione Zack in modalità deviazione standard, regolando il contrasto e i livelli di luminosità di ciascuna immagine in modo che le cellule granulari marcate siano facilmente visibili. A questo punto, selezionare il plugin di tracciamento manuale dal menu di analisi delle particelle.Utilizzare il plugin per fare clic sul punto centrale di ogni corpo cellulare etichettato nell'intera sequenza di immagini in time-lapse. Successivamente, esportare i dati grezzi di tracciamento in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Riorganizzare i dati grezzi esportati da Image J mediante uno strumento casalingo intelligente che identifichi ogni cellula e le posizioni associate utilizzando il programma.Calcolare la distanza totale percorsa e la velocità media di migrazione per ogni cellula. Nel cervelletto postnatale precoce, le cellule granulari mostrano cambiamenti significativi nel modo e nella velocità di migrazione mentre attraversano diversi strati corticali. Le cellule granulari marcate con CTG in sezioni di tessuto cerebellare di ratti PM sono state esaminate.Come descritto, le cellule granellari hanno migrato radialmente nel livello molecolare con una velocità media di 18 micrometri all'ora. Un altro preparato è stato quindi utilizzato per testare l'effetto di farmaci che si prevede alterino il tasso di migrazione. L'applicazione di pay cap 38 nel mezzo di coltura ha determinato una diminuzione del 79% della velocità delle cellule granellari nel livello molecolare, riducendola a 2,5 micrometri all'ora.L'amministrazione di PI uno, un inibitore della TPA endogena, ha ridotto la velocità di migrazione delle cellule granulari del 78%, passando dalla velocità di controllo a 4,2 micrometri all'ora. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come tracciare le cellule nel pallone teorico in via di sviluppo. Mentre si tenta questa procedura, è importante ricordare di fornire parametri ambientali adeguati e costanti, essenziali per la migrazione cellulare dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i processi olfattivi nel cervello.

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Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.

Time-lapse imaging delle Migrazioni neuroblasti in fette acuta del prosencefalo topo adulto

Fonte: Chan, U., et al., Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei neuroni dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi. J. Vis. Exp. (2021).Questo video dimostra l'analisi dello sviluppo dei neuroni dei granuli cerebellari mediante l'imaging di fette di tessuto cerebrale prefissate da topi etichettati con una proteina fluorescente, Acquisizione di immagini Z-stack ad alta risoluzione con un microscopio confocale e misurazione di parametri...

Visualizzazione della sinaptogenesi dei neuroni dei granuli cerebellari in diversi stadi di sviluppo

Fonte: Bénard, M., et al. Imaging ex vivo della migrazione postnatale delle cellule dei granuli cerebellari mediante macroscopia confocale. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra un metodo macroscopico confocale per tracciare la migrazione ex vivo di cellule granulari in fette cerebellari da cervelli di ratto postnatale.

Imaging ex vivo della migrazione postnatale delle cellule dei granuli cerebellari mediante macroscopia confocale

Migrazione neuroblasti è un evento fondamentale nella neurogenesi postnatale. Descriviamo un protocollo per l'etichettatura efficiente dei neuroblasti di elettroporazione in vivo postnatale e la successiva visualizzazione della loro migrazione utilizzando time-lapse imaging di fette di cervello acuto. Includiamo una descrizione per l'analisi quantitativa delle dinamiche neuroblasti di monitoraggio video.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

Morfogenesi neuronale e la migrazione sono eventi cruciali alla base un corretto sviluppo del cervello. Qui, descriviamo i metodi per manipolare geneticamente colture di neuroni granulari del cervelletto e del cervelletto in via di sviluppo per la valutazione della morfologia e delle caratteristiche migratorie dei neuroni.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Lo strato granulare esterno cerebellare è il sito della più grande amplificazione transito nel cervello sviluppo. Qui, vi presentiamo un protocollo di indirizzare la modificazione genetica di questo strato al culmine della proliferazione usando ex vivo elettroporazione e la cultura di fette cerebellare da embrionali Giorno 14 embrioni di pollo.

Ex Cultura Vivo del Chick cerebellare fette e spazialmente mirata elettroporazione di granuli precursori delle cellule

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'osservazione diretta dei migratori radiali di neuroni corticali. Nell'utilizzo dell'elettroporazione uterina, la coltura organotipica della fetta e l'imaging confocale a tempo intervallo sono combinati per studiare direttamente e dinamicamente gli effetti di sovraespressione o di downregolazione di geni di interesse nei neuroni migratori e di analizzare la loro differenziazione durante lo sviluppo.

Impressione confocale dei migratori dei neuroni nella cultura di fetta organotipica del cervello embrionale del mouse usando<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione

Qui, forniamo un metodo affidabile e a basso costo per generare colture individulamente cervello organotipiche fetta da embrioni del mouse adatti per la microscopia confocale e tecniche di imaging live.

Ex Utero Elettroporazione e colture Organotypic fetta di cervelli embrionali del Mouse per vivere-Imaging di migrazione interneuroni GABAergici

Questo protocollo descrive una tecnica cronica di impianto della finestra cranica che può essere utilizzata per l'imaging longitudinale di strutture neuro-glio-vascolari, interazioni e funzione sia in condizioni sane che malate. Serve come alternativa complementare all'approccio di imaging transcranico che, sebbene spesso preferito, possiede alcune limitazioni critiche.

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

Qui descriviamo un metodo per visualizzare la sinaptogenesi dei neuroni granuli nel cervelletto del topo nel corso dello sviluppo postnatale del cervello quando queste cellule perfezionano le loro strutture sinaptiche e formano sinapsi per integrarsi nel circuito cerebrale generale.

Utilizzo dell'elettroporazione postnatale in vivo per studiare la morfologia dei granuli cerebellari e lo sviluppo delle sinapsi

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Impara a visualizzare la migrazione dei neuroni granulari nel cervelletto postnatale utilizzando la macroscopia confocale. Questo metodo permette di studiare i fattori endogeni che regolano la migrazione neuronale.

Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

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