Ex Vivo Imaging di postnatale cerebellare granuli migrazione cellulare Utilizzando confocale macroscopia

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i neuroni in migrazione in fette di cervello viventi. Ciò si ottiene sezionando prima il cervelletto da un ratto P 10. I prossimi passi sono la preparazione di fette cerebellari acute e l'etichettatura dei neuroni con una sonda fluorescente.

Quindi l'esperimento time-lapse viene eseguito attraverso l'imaging macro confocale o la microscopia confocale. Il passo finale è quello di tracciare i neuroni nei filmati risultanti. In definitiva, la microscopia ex vivo viene utilizzata per mostrare il ruolo di fattori endogeni o sostanze tossiche che regolano la migrazione neuronale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale, è che l'imaging macro confocale aumenta la sensazione di vista lasciando le fette di arte cerebrale posizionate direttamente sull'inserto inguinale. Per la prima volta, ho avuto l'idea di questo metodo quando ho avuto difficoltà a trasferire e stabilizzare fette di arte cerebrale per esperimenti di microscopia confocale Inizia avendo accesso al cranio di una testa di cucciolo di ratto P 10 decapitato, usando le forbici dell'iride sottili fai delicatamente due incisioni laterali dalla base alla regione rostrale del cranio. Quindi rimuovere il cranio sezionato con due pinze numero tre, rompendo qualsiasi adesione tra il cervello e il cranio.

Ora, raccogli il cervello con l'estremità del cucchiaio di una spatola e mettilo in una capsula di Petri da 35 millimetri con due millilitri di HBSS freddo con ghiaccio. Ora, sotto uno stereomicroscopio, isolare il cervelletto dal cervello mediante lacerazioni D usando due pinze numero tre. Versare il cervelletto in un nuovo piatto con tampone ghiacciato.

Quindi, utilizzando gli stessi strumenti, rimuovere e scartare il midollo spinale residuo e la membrana di pelatura. Preparare un manico di bisturi solido numero tre con una lama chirurgica numero 15. Usando la lama sotto uno stereomicroscopio, tagliare il cervelletto tra il verus e l'emisfero destro.

Ora al vibrato, metti una goccia di colla cianocrilata sul disco del campione e attendi da 15 a 25 secondi affinché il vapore del solvente si dissipi prima di trasferire il cervelletto sul disco. Quindi, fissare il bordo del cervelletto al disco del campione e attendere 10 secondi. Ora, utilizzando il manipolatore, inserire il disco del campione nel vassoio del tampone in modo che l'asse trasversale del cervelletto sia perpendicolare al portacoltello.

Assicurati di fissare il disco usando una chiave per allume. Quindi coprire accuratamente il cervelletto con HBSS e caricare il ghiaccio tritato nel bagno di raffreddamento. Per affettare il campione, posizionare una lama pulita, in modo che il suo bordo sia proprio dietro il bordo posteriore del campione.

Definiscilo come il punto di partenza per la glassa. Quindi utilizzare il comando avanti per definire il punto finale appena oltre il bordo anteriore del campione. Ora imposta lo spessore della fetta a 180 micron.

Quindi impostare la velocità di sezionamento su 2,5 e la frequenza su otto e iniziare a sezionare il campione. Raccogli fino a cinque fette per cervelletto. Prelevare ogni sezione utilizzando una pipetta di vetro di cinghiale tronca larga.

Trasferire le sezioni in un piatto contenente HBSS freddo con ghiaccio. Dopo aver raccolto le fette sotto uno stereomicroscopio, rimuovere con cura le meningi utilizzando due pinze numero cinque. Inoltre, separare delicatamente i LOE per un migliore caricamento della sonda.

Dopo aver affettato il campione, utilizzare una pipetta di cinghiale tronca larga per trasferirli con un po' di HBSS in una piastra a sei pozzetti, caricare fino a tre fette in ciascun pozzetto. Successivamente, dopo aver svuotato il terreno in ogni caricato, aggiungere cinque millilitri di soluzione di caricamento contenente 10 micromolari del colorante fluorescente per proteggere i campioni dalla luce, coprire la piastra con un foglio. Quindi mettere la piastra su un mutatore impostato a 35 giri/min.

Lasciare incubare la piastra per 10 minuti a temperatura ambiente per consentire al colorante di etichettare i pozzetti delle cellule. Ora trasferisci le fette come prima sulla membrana di un inserto transwell con tre micron di pori. Quindi aspirare il mezzo di caricamento, lasciando solo le fette.

Ora rimuovi l'inserto e le fette per riempire il pozzetto con 1,9 millilitri di DMEM. Quindi rimetti l'inserto e aggiungi altri 100 microlitri di DMEM per coprire i tessuti. Incubare questo preparato per due ore, dopodiché le cellule dei granuli saranno visibili.

Trasferire la piastra senza coperchio in una camera ambientale con flusso di gas costante su un microscopio confocale. Quindi posizionare il coperchio di vetro sull'inserto della piastra del microscopio confocale per gli esperimenti time-lapse. Lasciare incubare le cellule nella camera per altre due ore prima di procedere.

Per visualizzare le cellule dei granuli che migrano nelle fette di tessuto, illuminare la preparazione con una luce a 488 nanometri e utilizzare un obiettivo a secco due volte. Rileva le emissioni fluorescenti da 500 a 530 nanometri utilizzando l'immagine J.Per ogni immagine del filmato time-lapse, eseguire una proiezione Zack utilizzando la modalità di deviazione standard, regolare il contrasto e i livelli di luminosità di ciascuna immagine in modo che le celle granulari etichettate siano facili da vedere. Ora, scegli il plug-in di tracciamento manuale dal menu di analisi delle particelle.

Usa il plug-in per fare clic sul punto centrale di ciascun corpo cellulare etichettato durante la sequenza di immagini time lapse. Quindi esporta i dati di tracciamento grezzi in un foglio di calcolo per ulteriori analisi. Riorganizza i dati di tracciamento grezzi esportati dall'immagine J con uno strumento intelligente fatto in casa che identifica ogni cella e le posizioni associate utilizzando il programma.

Calcola la distanza totale di viaggio e la velocità media di migrazione per ogni cella. Nel primo cervelletto postnatale, le cellule granulari mostrano cambiamenti significativi nella loro modalità e velocità di migrazione quando attraversano diversi strati corticali. Sono state esaminate le cellule granulari marcate con CTG in fette di tessuto cerebellare di ratto PM.

Come descritto, le cellule granulari sono migrate radialmente nello strato molecolare con una velocità media di 18 micron all'ora. Un'altra preparazione è stata poi utilizzata per testare l'effetto dei farmaci che si prevede possano alterare il tasso di migrazione. L'applicazione del paycap 38 al terreno di coltura ha comportato una diminuzione del 79% della velocità delle cellule granulari nello strato molecolare, un calo a 2,5 micron all'ora.

La somministrazione di PI one, un inibitore del TPA endogeno, ha ridotto la velocità di migrazione delle cellule dei granuli del 78% rispetto alla velocità di controllo a 4,2 micron all'ora. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come tracciare le cellule nel pallone della teoria in via di sviluppo. Mentre provo questa procedura, è importante ricordarsi di fornire parametri ambientali appropriati e costanti essenziali per la migrazione cellulare dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare i processi fattualeli nel cervello.