Name: Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Scopri la riduzione dei patogeni nei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV. Questo metodo inattiva i batteri preservando la qualità delle componenti ematiche per trasfusioni più sicure.

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1. Batteri Sospensione Preparazione: <ol><li> Da una piastra di coltura striato, asetticamente inoculare una singola colonia in una bottiglia sterile da 250 ml contenente 100 ml del terreno di coltura appropriato (Tabella 1) mediante ansa sterile. </li><li> Mettere la bottiglia in un incubatore scuotendo orbitale alle condizioni appropriate (Tabella 1) per 1-2 giorni, controllando la crescita periodicamente. Impostare la velocità shaker a 140 RPM. </li><li> Trasferire asetticamente la sospensione batterica in due sterili 50 ml provette coniche e centrifugare le provette a 3000 xg per 20 minuti a 23 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet batterico con 15 ml di acqua peptonata sterile. Vortex come necessario. Unire la coltura batterica in sospensione in una provetta / contenitore. </li><li> Titolo la cultura magazzino in triplice copia per sezione 4, per determinare il titolo delle colture. </li><li> Mettete in frigorifero per un massimo di 2 settimane a 477; 2 ° C fino al momento dell&#39;uso. Re-titolo cultura al momento dell&#39;uso, vedi passo 4.8. </li></ol> 2. piastrinico prodotto Preparazione: <ol><li> Raccogliere un prodotto standard aferesi piastrinica umana ad una banca del sangue accreditato. Il prodotto piastrinica deve soddisfare le seguenti specifiche di raccolta: 90-360 ml di volume e di 0,8 -3,8 x 10 6 piastrine / ml concentrazione. <ol><li> Verificare che il prodotto piastrinico ha riposato per un minimo di 2 ore prima del trattamento per la riduzione degli agenti patogeni. Conservare i prodotti a 22 ± 2 ° C in un incubatore di piastrine senza agitazione per queste 2 ore. Dopo due ore di assicurare il prodotto piastrinico viene agitata a 22 ± 2 ° C in un incubatore piastrinica. Utilizzare il prodotto per un massimo di 22 ore dopo la raccolta. </li></ol></li><li> Utilizzando una siringa 3 ml rimuovere un campione di 2 ml per misurare il pH 22C del prodotto piastrinico. Utilizzare un emogasanalizzatore per garantire il prodotto ha un pH&gt; 6,6. Utilizzare lo stesso campione per misurare la concentrazione piastrinica del prodotto piastrinico utilizzando un analizzatore ematologico. Assicurarsi che il prodotto è conforme alle 0.80-3.8 x 10 6 piastrine / ml requisito concentrazione collezione. </li><li> Visivamente valutare il vortice del prodotto piastrinico. Se il prodotto ha un &quot;0&quot; agitare il prodotto verrà scartato. </li><li> Tenere la sacca di piastrine sotto una fonte di luce bianca diretta e spremere il sacco piastrinica brevemente. Osservare visivamente il modello vorticoso del campione di piastrine. Punteggio ottenuto il prodotto utilizzando la seguente scala. NOTA: 2 - Swirl positivo: turbine disomogeneità visibile in tutta la borsa con forte contrasto. 1 - Intermedio Swirl: Alcuni disomogeneità visibile, ma solo in alcuni luoghi e con scarso contrasto. 0 - Swirl Negativo: omogeneità torbida rimanente prima e dopo spremitura del sacco delle piastrine </li></ol> 3. Riboflavina e ai raggi UV Processo: <ol><li> TranSFER il prodotto piastrinica ad una borsa riboflavina e raggi UV illuminazione luce e storage utilizzando un dispositivo di aggancio tubi sterili. Dopo il trasferimento rimuovere il sacco di raccolta unità di piastrine vuoto utilizzando un sigillante tubo e gettare il sacchetto vuoto come rifiuti a rischio biologico. </li><li> Rimuovere un sacchetto 35 ml di 500 mM riboflavina soluzione madre dal suo involucro protettivo esterno luce. Dock Sterile kit riboflavina sulla linea di ingresso del sacco trattamento e stoccaggio. Lasciare il contenuto per drenare nell&#39;unità piastrinica. </li><li> Appendere il sacchetto / trattamento e stoccaggio sacchetto riboflavina impostato dal sacchetto riboflavina e di esprimere dolcemente aria residua dal sacchetto trattamento e stoccaggio e nel sacchetto riboflavina. Assicurare una piccola quantità di prodotto piastrinico è espresso anche nel sacchetto riboflavina per risciacquare qualsiasi riboflavina residua nel prodotto piastrinico. Lasciare che la soluzione di riboflavina e piastrine scarico nella borsa trattamento e stoccaggio e poi serrare la linea di ingresso. Rimuovere il sacchetto vuoto riboflavina noiing un sigillante tubo e gettare il sacchetto vuoto come rifiuti a rischio biologico. </li><li> Dock Sterile una linea di tubi da 6 &quot;con connettore siringa femminile sulla linea di ingresso della borsa illuminazione e di stoccaggio. Attaccare una siringa da 10 ml (togliere il pistone) sul connettore della siringa femminile. </li><li> Aggiungere asetticamente 5 ml di batteri nel cilindro della siringa con una pipetta. Aprire il morsetto sulla linea di aspirazione e permettere ai batteri di scarico in prodotto piastrinico. Lavare la siringa consentendo qualche prodotto piastrinico di rifluire nel cilindro della siringa 10 ml. Rimuovere il corpo della siringa da 10 ml. </li><li> Asetticamente allegare una siringa da 30 ml e lavare la porta di ingresso di un minimo di due volte per garantire i batteri azionari è mescolato nel prodotto piastrinico. Dopo che il prodotto è ben miscelato, utilizzare un pulito siringa da 5-10 ml e rimuovere un campione di pretrattamento 2 ml. Utilizzando una nuova siringa garantire l&#39;aria introdotta dal passo inoculazione o campionamento passo è stato rimosso. <ol><li> Titolo campione di pre-trattamento per sezione 4. </li></ol></li><li> Rimuovere la linea di aspirazione dal sacchetto trattamento e stoccaggio e pesare il prodotto. </li><li> Posizionare il prodotto nella illuminatore e seguire i comandi sullo schermo per iniziare un trattamento di piastrine standard. <ol><li> Entrare in ID operatore. </li><li> Fissare e montare la borsa alla piastra Illuminatore. </li><li> Inserire l&#39;ID campione nel Illuminatore utilizzando il lettore di codici a barre o la tastiera inserimento manuale. </li><li> Tipo di prodotto di scansione. </li><li> Chiudere il morsetto di quarzo. </li><li> Il dispositivo di illuminazione consegnerà automaticamente 6.24 J / ml di energia. Il tempo tipico trattamento richiede 5-10 minuti. </li></ol></li><li> Dopo il trattamento dock sterile una linea di tubi da 6 &quot;con connettore siringa femminile sulla linea lampadina campione di trattamento e di custodia. Assicurarsi che il prodotto è ben miscelato e poi allegare una siringa da 5 ml e rimuovere un campione di post-trattamento 2 ml. <ol><li> Titolo post-trattamento samPle per sezione 4. </li></ol></li></ol> 4. batterica Titer <ol><li> Stima il titolo dei campioni pre-trattamento e post-trattamento e preparare il numero appropriato di 5 ml provette di diluizione necessari per eseguire una diluizione seriale punto finale di ogni campione. Asetticamente riempire i tubi necessari con 1,8 ml di acqua peptonata. </li><li> Titolo ogni campione utilizzando uno schema di diluizione in serie di 10 volte. Trasferire asetticamente 0,2 ml dal campione non diluito per la prima provetta di diluizione (10 -1). Vortex questo tubo di diluizione e trasferimento 0,2 ml al prossimo tubo di diluizione. Continuare la diluizione seriale attraverso il numero di diluizioni. <ol><li> Trasferire asetticamente 100 microlitri di ogni diluizione da placcare ad una piastra di agar adeguato (Tabella 1). </li></ol></li><li> Utilizzando una spatola cellulare sterile, distribuire uniformemente il campione su ogni piatto di agar. </li><li> Capovolgere e incubare le piastre a condizioni appropriate ( <strong&gt; Tabella 1) per 1-2 giorni di controllo per la crescita periodicamente. </li><li> Conte piatti con 30-300 colonie. Piastre contenenti più di 300 colonie sono considerate troppo numerose per essere contate (TNTC). Piastre contenenti meno di 30 colonie sono considerati sotto del limite di quantificazione (LOQ). </li><li> Calcolare il titolo di ciascun campione e registrare i risultati come UFC / ml. <ol><li> Utilizzare la seguente equazione per calcolare CFU / ml: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Se non ci sono colonie sulla piastra di diluizione più basso, utilizzare la seguente equazione per calcolare il limite di rilevamento (LOD): <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> e <img alt="Equazione 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Dove: N = più basso numero di particelle (CFU) a product che può essere rilevato con sicurezza. P = probabilità che un microrganismo sarà rilevati; per un&#39;affidabilità del 95% di rilevare un microrganismo, P = .05. V = volume totale prodotto in ml v = volume placcato (ml) x livello diluizione del piatto </li></ol></li><li> Per controllo negativo, piastra 0,5 ml di acqua peptonata che viene utilizzato per le diluizioni seriali su ciascuna delle due piastre di agar. Utilizzare lo stesso tipo piatto come i campioni da testare. Capovolgere e incubare la piastra a le condizioni adeguate per 1-2 giorni la verifica per la crescita periodicamente. <ol><li> Se si osserva la crescita su entrambi i piastra di agar, la bottiglia di acqua peptonata utilizzata deve essere scartata; i risultati dello studio sono anche invalidate. </li></ol></li><li> Per Controllo positivo, ri-titolo la coltura madre di batteri che è stato utilizzato. Capovolgere e incubare le piastre a condizioni appropriate per 1-2 giorni la verifica per la crescita periodicamente. Il titolo deve essere di ± 1,0 log CFU / ml di recordEd magazzino titolo (vedi sezione 1.5) per lo studio di essere considerata valida. </li></ol>

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</ol>

Tutti gli autori di questo documento sono attualmente impiegati per Terumo BCT, sviluppatore e produttore del sistema Mirasol PRT. Spese di pubblicazione di questo video-articolo sono state pagate dal Terumo BCT.

Lo screening batterica è diventata pratica comune in istituti bancari di sangue e per molte posizioni che serve come il metodo principale per prevenire trasfusione di piastrine batteri contaminati. Sebbene lo screening batterica interdice in genere la maggior parte dei rapida crescita batteri Gram negativi come S. marcescens, E. coli ed E. cloacae, si fa fatica a rilevare lenta crescita batteri Gram-positivi, come S. aureus, Streptococcus spp. e S. epidermidis 8. Purtroppo, questi batteri Gram positivi e tre sono implicati in rialzo del 50% di tutte le unità di piastrine contaminati e trasfusione di prodotti piastrinici contenenti questi tre organismi ha portato a mortalità dei pazienti 1. Proiezione batterica si basa sul titolo batterica in un prodotto piastrinico essere abbastanza sufficientemente alto in modo che almeno un microrganismo è contenuto all&#39;interno del tipico esempio di screening 4-8 ml. Se il titolo batterico non è sufficientemente elevato per un batterio da catturare nel volume del campione 4-8 ml, l&#39;unità è in modo non corretto contrassegnato come negativo e viene rilasciato per la trasfusione. Un approccio alternativo allo screening batterica potrebbe essere quella di impiegare un processo proattivo che può essere eseguito su tutte le unità di piastrine e che potrebbe rendere i organismi contaminanti come non funzionale. In questo studio, alti titoli di batteri sono stati volutamente aggiunti unità di piastrine per testare la capacità totale riduzione del processo di riduzione della luce patogeno riboflavina e UV. Sebbene le cariche batteriche testati in questo studio molto superiori a quelle normalmente presenti nei prodotti ematici al momento della donazione, questo studio aiuta a dimostrare che il processo riboflavina e la luce UV è in grado di ridurre in modo significativo il titolo di batteri vitali in una unità di piastrine contaminato da 2.6 al 5.4 log (riduzione 99,7-99,9996% dei batteri contaminanti) (Figura 2). Per ottenere un accuravalore di riduzione logaritmica te, è fondamentale che l&#39;operatore ha una buona tecnica asettica con precise competenze pipettaggio quando si eseguono le operazioni di titolo batteriche. Pipettaggio impreciso quando si eseguono diluizioni seriali può portare ad un accumulo di errori, quindi una misurazione titolo impreciso. I dati raccolti in questo studio supporta lavoro precedente con riboflavina e raggi UV, che ha sfidato il sistema contro di basso livello, batteriemia clinicamente rilevante (&lt;20 CFU / unità). Lo studio precedente è stato progettato per simulare un evento reale contaminazione clinica ei risultati hanno mostrato riboflavina e la luce UV è stato efficace nel prevenire la crescita batterica nel corso del periodo di conservazione delle piastrine di 7 giorni. Modellazione sulla base dei dati del precedente studio suggerisce che le attuali stime di rischio di contaminazione batterica dei prodotti piastrinici potrebbero essere ridotti di ben il 98% rispetto ai livelli attuali 8. Il processo di luce riboflavina e UV confronta favorevolmente a schermo battericaING, che ha dimostrato solo una efficacia del 66% per rilevare contaminanti batterici nelle unità di piastrine quando provocati con una carica batterica clinicamente rilevante 8. Come per tutte le tecnologie, trattamento PRT di prodotti piastrinici per prevenire le complicanze associate alla unità di piastrine batteri contaminati ha i suoi limiti. Sistemi PRT non sono efficaci contro le spore batteriche e non inattivano endotossine, quindi anche se un sistema PRT può inattivare alti titoli di batteri Gram-negativi il endotossine residuo può ancora causare shock settico nel ricevente. PRT è meglio eseguita presto durante la conservazione prima che i batteri possono propagare a titoli elevati. In conclusione, come dimostrato dalla combinazione di questi due studi, il processo di riboflavina e la luce UV è efficace nel ridurre le cariche batteriche di entrambi i microrganismi Gram positivi e Gram negativi e può offrire una valida alternativa allo screening batterica. Ordinariamente treatinprodotti g piastrine con riboflavina e raggi UV ha anche il vantaggio di ridurre la potenziale trasmissione di altri agenti per via ematica, come virus e parassiti.

La trasfusione di piastrine, plasma, globuli rossi confezionati e prodotti di sangue intero svolgono un ruolo importante nella medicina moderna e può essere usato per il trattamento di varie condizioni mediche, sostituire i liquidi vitali e, infine, salvare vite umane. Le piastrine sono un prodotto cellulare che sono o isolati da sangue intero e riunito in una dose transfusable o raccolti attraverso il processo di aferesi piastrinica. Il ruolo principale di piastrine nel corpo è quello di fermare l&#39;emorragia nei siti della ferita e per aiutare a mantenere l&#39;emostasi. I pazienti affetti da una conta delle cellule delle piastrine basso (trombocitopenia) sono suscettibili di eventi di sanguinamento spontaneo e sono trasfusi con piastrine per portare contare di nuovo in un range di normalità loro cella piastrine. Piastrine raccolti sono conservati per un massimo di 5-7 giorni e sono conservati a 22 ± 2 ° C, mentre sotto costante agitazione. Nonostante il risparmio proprietà di trasfusioni di piastrine vita ci rimane un lieve rischio per ricevono trasfusioni a causa di contamination di questi prodotti da parassiti, batteri e virus 11. L&#39;attuazione di test virale acidi nucleici (NAT) è diminuito in modo significativo il rischio di trasmissione virale ematica principali agenti, come il virus dell&#39;epatite C (HCV), il virus dell&#39;epatite B (HBV) e del virus di immunodeficienza umana (HIV) 5. Una recente pubblicazione dal Canadian Blood Services stima il rischio residuo per questi agenti siano 1 per 8 milioni di donazioni per l&#39;HIV, 1 per 6,7 milioni di donazioni per l&#39;HCV e 1 per 1,7 milioni di donazioni per l&#39;HBV 15. Anche se i batteri tipicamente garner meno attenzione nel pubblico in generale, la frequenza di contaminazione batterica nei prodotti piastrinici è stata stimata essere alto come 1: 1.000 7 e perché milioni di prodotti piastrinici vengono trasfusi ogni anno molti destinatari sono esposti a potenzialmente in pericolo di vita complicazioni come la sepsi 6. La ricerca suggerisce che la carica batterica al momentodi contaminazione è basso, &lt;100 unità formanti colonie (CFU) / prodotto 2,16, ma l&#39;ambiente e la temperatura ambiente ricco di stoccaggio di nutrienti permette contaminando batteri di proliferare a pericolosamente alti titoli prima della trasfusione. Attualmente, i metodi approvati disponibili per evitare prodotti batteriologicamente contaminati da raggiungere un destinatario piastrinica è attraverso l&#39;uso di sistemi di coltura e rapide punto di test cura. Brevemente, per sistemi di coltura basati prodotti piastrinici sono memorizzati su un agitatore a 22 ° C per 12-24 ore per permettere ai batteri di proliferare nel prodotto, su cui un campione 4-8 ml viene rimosso dal prodotto piastrinico e inoculata in una bottiglia contenente terreni di coltura. La bottiglia è posto in uno strumento che monitora la bottiglia per la crescita batterica. Se lo strumento rileva crescita batterica in bottiglia è contrassegnato e la corrispondente unità di piastrine viene scartato. Mentre questo processo è un ragionevole successo a rilevare gro veloceorganismi ala, molte delle specie a crescita lenta non crescono ad un titolo abbastanza alta da rilevare, creando così il potenziale per unità di falsi negativi per essere rilasciato per trasfusioni 7,12,14,16,22. A differenza dei sistemi di coltura a base di rilevamento, un rapido punto di test cura viene in genere eseguito più tardi nel periodo di conservazione delle piastrine in cui la carica batterica è aumentato significativamente. I titoli più elevati sono richiesti dal punto di test per la cura sono meno sensibili rispetto ai sistemi di coltura basati, e solo di rilevare in modo affidabile i batteri una volta raggiunta un titolo ≥1 x 10 3 CFU / ml 17. Tuttavia tali test possono fornire risultati entro 1 ora di campionamento. La variabilità nello svolgimento di queste prove hanno portato al rilascio di un prodotto falso negativo, provocando una reazione settica fatale nel ricevente 9. Un modo alternativo per combattere il problema della contaminazione batterica di prodotti piastrinici è attraverso l&#39;uso di routine di un proc riduzione degli agenti patogeniess che possono inattivare batteri contaminanti, invece di cercare di individuarli. Utilizzando riboflavina come fotosensibilizzatore, in combinazione con la luce UV, ha dimostrato di ridurre l&#39;infettività di una vasta gamma di contaminanti patogeni ematica, inclusi batteri 3,4,8,10,19-21 .Il uso di riboflavina e UV luce per la riduzione degli agenti patogeni non è tossico e non mutagena, e componenti leggeri trattati con riboflavina e UV hanno dimostrato di essere sicuro per riceventi trasfusioni, nonché a chi tratta prodotti ematici 18. In breve, le molecole di riboflavina possono associare gli acidi nucleici (DNA e RNA) di batteri, parassiti, virus e ogni cellula nucleata (ad esempio, globuli bianchi). L&#39;esposizione alla luce UV si attiva riboflavina, causando una modificazione chimica gruppi funzionali degli acidi nucleici (principalmente basi guanina), impedendo così la replicazione e / o la trascrizione degli acidi nucleici e lasciando l&#39;organismo inattivato 13. Cellule Anucleated come piattoville in globuli rossi non sono influenzati dalla chimica riboflavina causa della mancanza di acido nucleico. Lavoro precedente con la tecnologia riboflavina e ai raggi UV ha valutato un gruppo selezionato di batteri utilizzando un disegno sperimentale destinato a simulare un prodotto piastrinico contaminato con una carica batterica clinicamente rilevante (&lt;20 CFU / prodotto) 8. L&#39;obiettivo di questo studio era di valutare il processo di luce e ai raggi UV contro riboflavina alto titolo contaminazione batterica (&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml) in prodotti piastrinici trattati nel plasma per misurare la capacità di riduzione batterica totale del sistema. Sulla base dei dati raccolti da studi hemovigilance 1, un gruppo di comuni che si verificano gram microrganismi positivi negativi e gram è stato selezionato per la valutazione in questo studio e comprendeva le seguenti specie: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (forma vegetativa), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Tutti gli organismi, ad eccezione di B. cereus, sono stati ottenuti da ATCC e una priorità fu posta su ottenere ceppi batterici che sono stati identificati come essere isolato da componenti del sangue. Il B. cereus testato in questo studio è un ceppo isolato clinico internamente da un prodotto piastrinico contaminato.

<table><tbody><tr><td>Mirasol Illuminator</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol Sacca per trattamento/conservazione</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore ematologico</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull; T diff&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di gas ematici</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di aggancio sterile</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore piastrinico</td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore orbitale</td><td>Agitatore Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a secco</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Classe II A/B3 Armadio di biosicurezza</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per tubi</td><td>Sebra</td><td>Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td>Table Top Centrifuga</td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 30 ml</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Provetta di diluizione da 5 ml</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 ml</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta ripetuta</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &; l Puntale Filtrante</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica monouso da 25 ml</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica monouso da 5 ml</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &; M Riboflavina</td><td>Terumo BCT</td><td>35 mL 500 &micro; M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Brucella Agar con 5% di sangue di cavallo</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Water BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Brodo di soia</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Agar</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo inattivato a caldo</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce uv: efficacia contro alto titolo contaminazione batterica

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Contaminazione di unità di piastrine da parte dei batteri è da tempo riconosciuto come un rischio significativo di trasfusione a causa delle loro condizioni di conservazione post-donazione. I prodotti sono ordinariamente conservati a 22 ° C in un agitatore agitazione, una condizione che può promuovere la crescita batterica. Sebbene il numero totale di batteri che si ritiene essere introdotti in un prodotto piastrinico è estremamente basso, questi batteri possono moltiplicarsi ad un alto titolo prima della trasfusione, potenzialmente causando gravi eventi avversi. Lo scopo di questo studio era di valutare un processo di riduzione dei patogeni riboflavina basato contro un gruppo di batteri che sono stati identificati come contaminanti comuni dei prodotti piastrinici. Questo pannello comprendeva i seguenti organismi: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Ogni unità di piastrine è stato inoculato con una carica batterica elevata e campioni sono stati rimossi bOTH prima e dopo il trattamento. Una colonia formando test, utilizzando un sistema di punti di diluizione fine, è stata utilizzata per determinare le pre-trattamento e post-trattamento titoli batteriche. Riduzione logaritmica è stato calcolato sottraendo il titolo post-trattamento dal titolo pretrattamento. Sono stati osservati i seguenti riduzioni di log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B. neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K . pneumoniae 2.8 log (99,8%). I risultati di questo studio suggeriscono il processo potrebbe contribuire a ridurre il rischio di gravi eventi avversi associati alla trasfusione contaminazione batterica.

La riduzione di undici diverse specie batteriche è stata valutata utilizzando il processo PRT basato riboflavina e raggi UV. Questi agenti rappresentano alcuni dei contaminanti più comuni di prodotti piastrinici e comprendono cinque Gram positivi e Gram negativi sei organismi. Almeno sei prodotti piastrinici sono stati valutati per l&#39;organismo e ciascun prodotto è stato inoculato con abbastanza batteri per produrre&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml titolo finale di batteri nel prodotto piastrinico. Prima del trattamento è stato rimosso un campione per determinare il titolo di pretrattamento, dopo di che il prodotto piastrinico è stato prontamente trattato con la riboflavina e processo UV. Dopo il trattamento dei prodotti piastrinici sono state osservate le seguenti riduzioni di log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B.neotomae 5.4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K. pneumoniae 2.8 log (99,8%) (Figura 2). Tutte le unità rispettate le specifiche del sistema, come indicato sopra per la riboflavina e processo UV. Test riduzione supplementare è stata eseguita con S. pyogenes utilizzando buffy coat piastrine derivate. Nessuna differenza significativa è stata osservata nella riduzione di S. pyogenes in cappotto buffy piastrine derivate rispetto piastrine aferesi (dati non riportati). <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabella 1: le condizioni di crescita per le specie batteriche valutati utilizzando riboflavina e raggi UV. Un gruppo di due batteri Gram-positivi e Gram negativi che hanno dimostrato di contaminare i prodotti piastrinici sono stati selezionati per questo studio. Le condizioni di crescita (temperatura e tipo di supporto) utilizzati per diffondere e titer gli organismi sono mostrati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figura 1: processo di riduzione degli agenti patogeni riboflavina luce e ai raggi UV. Riboflavina è stato disciolto in soluzione fisiologica 0,9% ad una concentrazione di 500 mM nominale. La soluzione era sterile e drenaggio collegato in ogni prodotto piastrinico. Batteri è stato aggiunto in modo asettico a ciascuna unità di piastrine e quindi trattati con 6,2 J / ml di energia UV (circa 6-10 min). In questo studio in vitro dell&#39;unità piastrinica post-trattamento è stato campionato per determinare il titolo batterico finale. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figura 2: Riduzione delle diverse specie batteriche quando trattati con riboflavina e raggi UV riboflavina e la luce UV è stato utilizzato per ridurre le cariche batteriche di contaminanti batterici comuni dei prodotti piastrinici.. La riduzione log 10 è la differenzatra il titolo media pre-trattamento e il titolo media post trattamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Le condizioni di conservazione dei prodotti piastrinici creano un ambiente ideale per la moltiplicazione dei contaminanti batterici a livelli pericolosi. L'obiettivo di questo studio è stato quello di utilizzare un saggio di formazione di colonie per valutare un processo di riduzione dei patogeni a base di riboflavina contro la contaminazione batterica ad alto titolo nei prodotti piastrinici umani.

Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la riduzione dei comuni contaminanti batterici nei prodotti piastrinici mediante un processo di riduzione dei patogeni basato su riboflavina e luce UV. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una scorta di batteri ad alta titolazione. Il secondo passaggio consiste nell'ottenere un prodotto piastrinico umano e valutare la qualità cellulare dell'unità.Successivamente, l'unità di piastrine viene dosata con riboflavina e inoculata con una concentrazione nota di batteri. L'ultimo passaggio consiste nel trattare l'unità con luce UV. Infine, la riduzione batterica viene misurata confrontando campioni pre-trattamento e post-trattamento per determinare i batteri vitali mediante un saggio di piastramento per diluizione endpoint.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come lo screening batterico, è che la riboflavina e la luce UV possono inattivare altri agenti patogeni come H-I-V, H-C-V, malaria e Babesia. Le implicazioni di questa tecnologia vanno oltre i patogeni trasmessi dal sangue, poiché la tecnologia è in grado di inattivare anche le cellule bianche del sangue e i prodotti ematici donati, che sono stati associati a eventi avversi da trasfusione, come la malattia da trapianto contro l'ospite associata alla trasfusione.Ho avuto per la prima volta l'idea di utilizzare questo metodo per inattivare agenti patogeni nel sangue attraverso studi che stavo conducendo sull'interazione tra composti, in particolare composti fotochimici, e gli acidi nucleici. La tecnica si basa sul fatto che gli agenti patogeni, a differenza dei globuli rossi, delle piastrine e delle proteine plasmatiche, contengono acidi nucleici genomici essenziali per la replicazione e la trasmissione della malattia. Pertanto, agendo sulla chimica degli acidi nucleici nel contesto dei prodotti sanguigni presenti, possiamo inattivare in modo più selettivo gli agenti patogeni preservando al contempo la qualità dei costituenti dei globuli rossi, delle piastrine e delle proteine plasmatiche. Dimostrazione della procedura.Oggi saranno Nick HOA, scienziato di laboratorio, e Denise Gilmore, tecnico di laboratorio. Per prima cosa, preparare una bottiglia sterile da 250 millilitri contenente 100 millilitri di terreno di coltura specifico per il batterio di interesse. Utilizzando un’ansa di inoculo sterile, inoculare una singola colonia batterica da una piastra di coltura a striscio nel terreno.Successivamente, posizionare il flacone in un incubatore con agitazione orbitale. Impostare la velocità dell'agitatore a 140 giri/min e incubare la coltura per uno o due giorni. Controllare periodicamente la coltura per verificare la crescita batterica.Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione batterica in due provette coniche sterili da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 3000 ×g per 20 minuti a 23 °C. Successivamente, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet batterico con 15 millilitri di acqua sterile per peptidi.Vortexare i tubi per favorire la sospensione, quindi unire le colture batteriche risospese per ottenere la coltura madre. Riempire ciascun tubo di diluizione da cinque millilitri con 1,8 millilitri di acqua peptidata. Trasferire 200 microlitri di campione non diluito nel primo tubo, vortexare il tubo, quindi trasferire 200 microlitri nel tubo successivo.Ripetere fino a raggiungere il diluizione appropriata. Trasferire 100 microlitri di ogni diluizione su una piastra agar idonea. Utilizzando un distributore di cellule sterile, stendere uniformemente. Distribuire il campione attraverso l'AER per una piastra di controllo negativo.500 microlitri della soluzione peptidica in acqua su due piastre di agar. Utilizzando un’asta di vetro sterile, distribuire uniformemente il campione sulla superficie dell’agar, capovolgere tutte le piastre e incubarle alla temperatura appropriata per uno o due giorni dopo l’incubazione. Se si osserva crescita su una delle piastre di controllo negativo, la soluzione peptidica in acqua è contaminata e il titolo non è valido.Se le piastre del controllo negativo sono negative, contare le colonie su tutte le piastre con da 30 a 300 colonie. Quindi calcolare il titolo di ogni campione in esame e registrare i risultati in termini di poche unità per millilitro. Refrigerare le colture batteriche fino a due settimane a quattro gradi Celsius.Per garantire l'accuratezza, eseguire nuovamente la titolazione della coltura prima dell'uso. Ottenere un prodotto piastrinico umano standard ottenuto mediante aferesi, con un volume compreso tra 90 e 360 millilitri e una concentrazione compresa tra 0,80 e 3,8 milioni di piastrine per microlitro. Lasciare riposare il sacchetto per almeno due ore in un incubatore per piastrine a 22 gradi Celsius, quindi agitare delicatamente a 60 RPM fino all'uso.Prelevare un campione di due millilitri del prodotto piastrinico e utilizzare un analizzatore di gas del sangue a 22 gradi Celsius per verificare che il pH sia superiore a 6,6. Utilizzando lo stesso campione, misurare la concentrazione di piastrine con un analizzatore ematologico per assicurarsi che rientri nel range desiderato. Successivamente, ispezionare visivamente il sacchetto delle piastrine tenendolo sotto una sorgente di luce bianca diretta.Spremere brevemente il sacchetto e osservare il modello vorticoso del campione. Se persiste un'omogeneità torbida prima e dopo aver premuto il sacchetto, non utilizzare le piastrine con un dispositivo di collegamento a tubo. Trasferire le piastrine in un sacchetto per l'illuminazione con riboflavina e luce UV e per il successivo stoccaggio.Rimuovere il sacchetto per piastrine vuoto utilizzando un sigillatore per tubi e smaltirlo come rifiuto biologico. Successivamente, rimuovere l'involucro esterno protettivo dalla luce della soluzione sterile di riboflavina 500 micromolare. Collegare la busta di riboflavina alla linea di ingresso del sacchetto di trattamento e conservazione, e far defluire il contenuto nell'unità di piastrine.Quindi appendere il sacchetto del prodotto piastrinico e il set del sacchetto di trattamento al sacchetto di riboflavina. Premere delicatamente per espellere l'aria residua dal sacchetto di trattamento nel sacchetto di riboflavina. Risciacquare qualsiasi residuo di riboflavina nel sacchetto delle piastrine con una piccola quantità di prodotto piastrinico.Lasciare defluire la soluzione di riboflavina e piastrine nuovamente nel sacchetto di trattamento. Quindi chiudere il tubo di ingresso con una molletta. Rimuovere il sacchetto vuoto di riboflavina utilizzando il sigillatore per tubi e smaltire correttamente il sacchetto vuoto in modo sterile.Collegare un tubo da sei pollici con connettore femmina per siringa alla linea di ingresso del sacchetto di illuminazione e conservazione. Fissare un cilindro di siringa da 10 millilitri alla linea del tubo. Successivamente, aggiungere cinque millilitri della sospensione di gambo batterico nel cilindro della siringa.Quindi aprire la pinza della linea di ingresso e lasciare che i batteri defluiscano nel prodotto piastrinico. Risciacquare il corpo della siringa permettendo a una parte del prodotto piastrinico di tornare indietro. Dopo il risciacquo, rimuovere il corpo della siringa.Collegare una siringa da 30 millilitri e sciacquare il porto di ingresso almeno due volte dopo che il prodotto è stato ben miscelato. Utilizzare una siringa pulita da cinque millilitri ed aspirare un campione di pretrattamento da due millilitri. Usare una siringa nuova per rimuovere qualsiasi aria introdotta nel sacchetto.Quindi rimuovere la linea di ingresso dalla borsa del trattamento e pesare la soluzione di piastrine. Iniziare il trattamento delle piastrine inserendo prima l'ID dell'operatore, quindi montare la borsa sull'illuminatore pla. Successivamente, inserire l'ID del campione utilizzando un lettore di codici a barre.Immettere il tipo di prodotto e il suo peso nel software. Successivamente, chiudere la morsa in quarzo per erogare automaticamente 6,24 joule per millilitro di energia ultravioletta. Il trattamento tipico dura da cinque a dieci minuti.Nel frattempo, titolare il campione pre-trattamento dopo il trattamento UV, titolare un campione post-trattamento per saggiare la sopravvivenza batterica e quindi titolare la coltura batterica stock come controllo positivo. La titolazione della coltura stock dovrebbe essere entro un'unità logaritmica di UFC per millilitro rispetto alla sua titolazione registrata. La riduzione di 11 diverse specie batteriche è stata valutata utilizzando un processo di riduzione dei patogeni basato sulla riboflavina e sulla luce UV.Sono stati valutati almeno sei prodotti piastrinici per organismo, ciascuno dei quali è stato inoculato. Con una concentrazione batterica sufficiente, un titolo finale superiore a 10.000 UFC per millilitro è stato rilevato nei campioni prelevati prima del trattamento e immediatamente dopo il trattamento con riboflavina e luce UV, rispetto alle soluzioni pre-trattamento. Tutti i carichi batterici sono stati ridotti di almeno 2,6 unità logaritmiche, pari a circa un fattore 400, mediante il trattamento con riboflavina e luce UV.Dopo questi studi effettuati con batteri ad alto titolo, possono essere condotti ulteriori studi utilizzando titoli di inquinamento più clinicamente rilevanti. Questi ultimi rappresentano effettivamente i livelli di batteri che potrebbero essere presenti nei prodotti al momento della donazione. L'obiettivo di tali studi con inquinamento a basso titolo è valutare la capacità del metodo di prevenire la crescita batterica e di mantenerli negativi alla coltura durante il periodo di conservazione, inclusi periodi prolungati di stoccaggio a temperatura ambiente.Successivamente all'introduzione di questa tecnologia, i ricercatori e i professionisti del settore medico possono valutare la capacità di inattivare un ampio spettro di agenti patogeni e utilizzare tale tecnologia per prevenire la trasmissione di malattie attraverso trasfusioni. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come misurare la riduzione logaritmica dei batteri in un prodotto piastrinico altamente contaminato trattato con riboflavina e luce UV.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo articolo viene descritto il processo utilizzato da Örebro University Hospital per la produzione di piastrine doppia dose di buffy coat concentrati preparati a partire da donazioni di sangue intero e trattati con il sistema INTERCEPT Blood per l'inattivazione dei patogeni.

Preparazione e inattivazione dei patogeni di Double Dose Buffy prodotti piastrinici cappotto con il sistema INTERCEPT Blood System

Fonte: Cheng, C., et al. Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra un metodo per valutare gli effetti fototossici della flavina mononucleotide (FMN) sui batteri patogeni. Le colture batteriche sono esposte a concentrazioni crescenti di FMN e illuminate con luce visibile per generare specie reattive dell'ossigeno (ROS) che danneggiano i componenti cellulari. I batteri sopravvissuti vengono quindi...

Inattivazione dei batteri mediante mononucleotide flavina attivato dalla luce

Fonte: Cheng, C., et al. Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5'-fosfato. J. Vis. Exp. (2022).In questo video, una miscela di reazione tamponata contenente L-metionina, nitro blu tetrazolio (NBT) e flavina mononucleotide (FMN) viene irradiata con luce viola per indurre la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Ciò porta all'inattivazione batterica e alla formazione di formazan spettrometricamente rilevabile.

Quantificazione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce attraverso la generazione di specie reattive dell'ossigeno

Fonte: Zhao, K., et al. Un modello in vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico sul biofilm di Staphylococcus aureus . J. Vis. Esp. (2018)Il video mostra un protocollo di terapia fotodinamica per valutare gli effetti antibatterici sui biofilm batterici Gram-positivi. I biofilm sono suddivisi in quattro gruppi: due ricevono un precursore del fotosenziatore e due ricevono un buffer. Tutti vengono incubati al buio, seguiti dall'esposizione alla luce...

Trattamento attivato dalla luce dei biofilm batterici utilizzando un precursore fotosensibilizzatore

Questo video dimostra il processo di riduzione dei patogeni basato sulla riboflavina e sulla luce UV contro la contaminazione batterica ad alto titolo nei prodotti piastrinici umani. Questo processo potrebbe aiutare a ridurre il rischio di gravi eventi trasfusionali avversi associati alla contaminazione batterica.

Un trattamento con riboflavina e luce UV dei prodotti piastrinici per eliminare i batteri

Impianto infezioni correlate all'assistenza è una complicazione clinico significativo. Questo studio descrive un approccio con plasma ricco di piastrine (PRP) per prevenire infezioni associate all'impianto, presenta il protocollo per la preparazione di PRP con costante concentrazione piastrinica, e riporta le proprietà antimicrobiche recentemente identificate di PRP e protocolli correlati per esaminare tali proprietà...

PRP come un nuovo approccio per prevenire l&#39;infezione: Preparazione e<em&gt; In vitro</em&gt; Proprietà antimicrobiche di PRP

Gestione del magazzino della piastrina basato su contenuti di microparticelle in concentrati piastrinici di screening è una nuova iniziativa di miglioramento di qualità in banche del sangue. L'obiettivo è quello di differenziare attivato dalle piastrine non attivato per ottimizzare l'uso delle piastrine. Fornendo le piastrine non attivato ai pazienti di Ematologia-Oncologia potrebbe ridurre il loro rischio alto per diventare refrattario.

Routine di metodo di Screening per microparticelle in trasfusioni della piastrina

Qui presentiamo un protocollo per inattivare i batteri patogeni con specie reattive dell'ossigeno prodotte durante la fotolisi del mononucleotide flavina (FMN) sotto irradiazione di luce blu e viola di bassa intensità. La fotolisi FMN ha dimostrato di essere un metodo semplice e sicuro per i processi sanitari.

Inattivazione di agenti patogeni tramite fotolisi in luce visibile della riboflavina-5′-fosfato

La formazione di piastrine procoagulanti è stata correlata con un aumentato rischio di trombosi. Di seguito viene presentato un preciso protocollo per l'isolamento delle piastrine lavate dal sangue umano, volto a quantificare l'esposizione alla fosfatidilserina e al rilascio di microvescicole, caratteristiche distintive delle piastrine procoagulanti.

Caratterizzazione piastrinica procoagulante mediante misurazione dell'esposizione alla fosfatidilserina e del rilascio di microvescicole da piastrine purificate umane

La funzione piastrinica sotto flusso può essere valutata e la rianimazione emostatica simulata può essere modellata utilizzando un dispositivo microfluidico, che ha applicazioni nella medicina traumatologica e trasfusionale.

Microfluidica nella valutazione della funzione piastrinica

Scopri la riduzione dei patogeni nei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV. Questo metodo inattiva i batteri preservando la qualità delle componenti ematiche per trasfusioni più sicure.

Trattamento dei prodotti piastrinici con riboflavina e luce UV: Efficacia Contro alto titolo contaminazione batterica

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