Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura
14 maggio 2015
Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di differenziare le cellule staminali embrionali di topo in un lignaggio neurale in una coltura cellulare monostrato priva di siero. Ciò si ottiene ricoprendo prima il recipiente di coltura con gelatina. Nella seconda fase, le cellule staminali embrionali vengono associate in una sospensione di singola cellula in terreno di differenziazione e diluite alle densità di placcatura appropriate.
Nella fase finale, le cellule vengono seminate sulla piastra rivestita di gel ENC. In definitiva, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per confermare il successo della differenziazione mediante la visualizzazione dei marcatori neurali di interesse. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà poiché la placcatura alla densità appropriata è fondamentale per ottenere una buona differenziazione.
E ci sono diversi fattori che influenzano la densità di placcatura sia direttamente che indirettamente. Prima di impiattare le cellule, scaldare un'aliquota di gelatina all'1% in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius fino a quando non si sarà sciolta. Quindi mescolare la gelatina con 500 millilitri di PBS caldo e coprire il fondo del contenitore di coltura cellulare con una quantità di soluzione sufficiente a ricoprire la superficie mentre la gelatina è di rivestimento.
Sciacquare due volte la coltura sub confluente di cellule staminali embr di topo in PBS. Quindi aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione alla coltura. Dopo due-cinque minuti, picchiettare il recipiente per rimuovere il monostrato in una sospensione a singola cellula e raccogliere la coltura in un totale di 10 millilitri di terreno e reagente di dissociazione cellulare.
Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri e farle girare in una centrifuga. Quindi, dopo un'attenta aspirazione del supinato, risospendere il pellet in 10 millilitri di preriscaldamento N due B 27 spingendo contro il lato del tubo. Per evitare la formazione di bolle, contare ora le cellule che registrano la concentrazione e risospenderle al numero appropriato di celle per unità di volume per pozzetto in preriscaldamento N due B 27 secondo la tabella.
Quindi aspirare la gelatina dal recipiente di coltura e piastrare le cellule senza agitare il contenitore. Metti le colture in un incubatore umido a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Sostituzione del mezzo ogni uno o due giorni.
Con N 22 B 27 fresco, le cellule inizieranno a differenziarsi e a mostrare calzini, un'espressione entro quattro o sei giorni per colorare le cellule per l'imaging in immunofluorescenza. Rimuovere il terreno di differenziazione dalle colture e fissare le cellule in 500 microlitri di para formaldeide al 4% dopo 15 minuti, lavare e permeare le cellule due volte con due millilitri di PBS con tween. Quindi bloccare qualsiasi legame non specifico con un'incubazione di un'ora delle cellule.
In un millilitro di PBS tween integrato con siero su una piastra a dondolo dopo aver lavato le cellule, come appena dimostrato. A 500 microlitri di IgG di topo contro beta tre tubulina alle colture per un'incubazione notturna sulla piastra a bilanciere a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo.
Dopo aver lavato le cellule, incubare i campioni in un anticorpo secondario anti-US IgG marcato in fluorescenza a temperatura ambiente, protetto dalla luce con oscillazione dopo un'ora. Sciacquare nuovamente le cellule e colorarle con 500 microlitri di DPI per cinque minuti. Infine, dopo aver lavato le cellule un'ultima volta, conservarle in PBS tween per un massimo di due settimane a quattro gradi Celsius.
Fino alla ripresa. In questo esperimento, sono state utilizzate cellule staminali embrionali di topo con un reporter endogeno SOX one GFP per tracciare la differenziazione neurale. Il sesto giorno, le cellule sono state fissate e colorate per il marcatore neuronale beta tre tubulina.
Alla densità ottimale, le cellule si sono differenziate in progenitori neurali e neuroni, mentre posizionandola a una densità più elevata si è ottenuta una diminuzione del numero di cellule SOX 1 GFP e beta tre tubuline positive. Anche il volume del contenitore per colture cellulari influisce sulla densità ottimale della piastra. Ad esempio, le cellule coltivate in una piastra a 96 pozzetti richiedono una densità cellulare di circa 10 volte superiore.
Le cellule sono state piastrate in una piastra di coltura a sei pozzetti per raggiungere la densità ottimale e due di confluenza. Durante la differenziazione, le cellule staminali embrionali cambiano gradualmente la loro morfologia. Ad esempio, in queste immagini, si può osservare la morfologia cellulare e della colonia dal primo al sesto giorno dopo la combustione alla densità cellulare ottimale.
Il quarto giorno, le cellule iniziano a diventare progenitori neurali, come dimostra la comparsa di un segnale fluorescente verde dal reporter SOX one GFP. Ed entro il sesto giorno, la maggior parte delle cellule sono SOX 1 positive. Sebbene sia prevista l'esistenza di alcune cellule non neurali Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare la differenziazione neurale delle cellule staminali emry di topo in una coltura cellulare monostrato.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la differenziazione di cellule staminali embrionali murine in progenitori neurali mediante un metodo in monocstrato privo di siero. Questo approccio consente la generazione di tipi cellulari neurali maturi ed è adatto per l'adattamento in formato multiwell per lo screening di composti.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Ricerca sulle Cellule Staminali
Sfondo
- Le cellule staminali embrionali possono differenziarsi in vari tipi cellulari.
- I progenitori neurali sono essenziali per lo studio dello sviluppo neurale.
- I metodi di coltura senza siero possono migliorare la riproducibilità.
- Una densità di semina adeguata è fondamentale per una differenziazione efficace.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo affidabile per la generazione di progenitori neurali.
- Facilitare lo studio dei processi di specificazione neurale.
- Permettere schermate ad alto rendimento per composti che influenzano la differenziazione neurale.
Metodi Utilizzati
- Rivestimento dei vasi di coltura con gelatina.
- Creazione di una sospensione monocellulare di cellule staminali embrionali.
- Seeding delle cellule su piastre rivestite con gelatina.
- Utilizzo della microscopia a immunofluorescenza per confermare il successo della differenziazione.
Risultati principali
- Differenziamento riuscito di cellule staminali embrionali in progenitori neurali.
- La visualizzazione dei marcatori neurali conferma il differenziamento.
- Stabilimento di densità di semina ottimali per un efficace differenziamento.
- Il metodo è scalabile per applicazioni di screening di composti.
Conclusioni
- Il metodo in monostrato senza siero è efficace per la generazione di progenitori neurali.
- L'immunofluorescenza è una tecnica affidabile per valutare la differenziazione.
- Questo protocollo può essere adattato per diverse applicazioni di ricerca in neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente la generazione scalabile di progenitori neurali da cellule staminali embrionali murine in un sistema monocellulare definito e privo di siero, supportando la validazione precoce degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci per le neuroscienze. Il metodo fornisce una piattaforma riproducibile e quantitativa per valutare gli effetti dei composti sulla differenziazione neurale, facilitando l'identificazione di composti promettenti e aumentando la previsione di efficacia nei percorsi preclinici. La sua compatibilità con linee reporter e formati di coltura ad alta densità permette l'integrazione in flussi di lavoro di screening per studi sulla modulazione di vie metaboliche e sull'interazione con il bersaglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei meccanismi di specificazione neuronale e la validazione funzionale di bersagli nello sviluppo neurogenico mediante differenziamento diretto.
- Valore operativo: Fornisce un sistema definito e privo di siero che riduce la variabilità e migliora la riproducibilità tra esperimenti e linee cellulari.
- Valore predittivo: Permette la valutazione delle variazioni indotte da composti chimici nel rendimento dei progenitori neurali e nell'espressione dei marcatori, fornendo informazioni sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione delle vie di segnalazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera una popolazione omogenea di progenitori neurali adatta allo screening di composti e alla valutazione fenotipica della differenziazione neurale.
- Valore operativo: Adattabile a formati multiwell (ad esempio, 96 pozzetti) con ottimizzazione scalabile della densità di semina, consentendo applicazioni da media ad alta produttività.
- Prontezza del saggio: Compatibile con immunofluorescenza, citometria a flusso e letture molecolari per l'analisi multiparametrica dell'efficienza di differenziazione e dell'espressione dei marcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Permette il passaggio dalla generazione di progenitori neurali alla maturazione di neuroni e cellule gliali funzionali, supportando la modellizzazione di malattie rilevanti.
- De-risking meccanicistico: Facilita lo studio dell'impegno di linea e della dinamica di differenziazione mediante l'uso di linee reporter (ad esempio, SOX1-GFP) per monitorare in tempo reale la specificazione neurale.
- Utilità preclinica: Consente la valutazione degli effetti di composti sulla maturazione neurale e sulla differenziazione gliale, supportando studi di farmacologia della sicurezza e di meccanismo d'azione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, supportando la validazione del bersaglio attraverso l'analisi meccanicistica della differenziazione neurale e consentendo lo sviluppo di saggi per lo screening di composti nei portafogli di neuroscienze.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di neurosviluppo e la validazione di bersagli mediante differenziazione mirata e letture basate su marcatori.
- Screening: Permette la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi in coltura a monocstrato, con la densità di semina come parametro critico per una generazione costante di progenitori neurali.
- Analisi: Fornisce output quantitativi tramite immunofluorescenza (ad esempio, SOX1-GFP, βIII-tubulina) e citometria a flusso per misurare l'efficienza di differenziazione e la risposta ai composti.
- Ricerca traslazionale: Collega la generazione precoce di progenitori neurali alla maturazione successiva in neuroni e cellule gliali funzionali, sostenendo la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Un protocollo definito e scalabile favorisce il riutilizzo su diverse linee di cellule staminali embrionali, tipi di vasi di coltura e campagne di screening, riducendo lo sforzo di sviluppo ripetuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di differenziazione neurale.
- Valore operativo: Condizioni standardizzate e prive di siero migliorano la riproducibilità e la scalabilità tra laboratori e linee cellulari.
- Valore strategico: Informa le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo una valutazione precoce degli effetti dei composti sull'impegno della linea neurale e sull'efficienza di differenziazione.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei target in neuroscienze aggiustata per il rischio, attraverso la riduzione del rischio meccanicistico e la validazione del percorso.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nelle tecniche di differenziamento e nella microscopia a immunofluorescenza.
- È subordinato all'accesso a incubatori con anidride carbonica, centrifughe, microscopi e reagenti come gelatina, N2B27, reagenti di dissociazione e anticorpi.
- Necessita della standardizzazione della densità di semina e delle procedure di rivestimento con gelatina tra diversi utilizzatori e sedi al fine di garantire la riproducibilità.
- L'adattamento a diverse linee di cellule staminali embrionali o a costrutti con reporter potrebbe richiedere un'ottimizzazione della densità di semina e dei tempi di differenziamento.
- I limiti pratici includono la sensibilità alla densità di semina e la necessità di una dissociazione accurata del monostrato per evitare la formazione di aggregati o sospensioni cellulari non completamente dissociate.
