Name: Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Impara a differenziare cellule staminali embrionali di topo in progenitori neurali con metodo monostrato senza siero. Questo protocollo scalabile consente screening ad alto rendimento e studio dello sviluppo neuronale.

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Work è stato finanziato da una borsa di studio per lo Sviluppo e la Promozione della Scienza e della Tecnologia dal Ministero dell'Istruzione thailandese a W.W. e da sovvenzioni da Tenovus e dall'Anonymous Trust a M.P.S.

1. Carta Preparazione NOTA: Il protocollo si basa sull&#39;utilizzo di una miscela di due distinti mezzi: DMEM / F12 addizionato con modificato supplemento N2 e Neurobasal supplementato con supplemento B27, tipicamente in un rapporto 1: 1. <ol><li> Preparare il supplemento N2 modificato mescolando i componenti in una provetta da 15 ml. Non vortice o filtrare questo; mescolare capovolgendo la provetta fino a quando la soluzione è limpida. <ol><li> Inizia pipettando 7,2 ml di DMEM / F12, quindi aggiungere 1 ml di 25 mg / ml di insulina (composta in 0,01 M HCl) e mescolare bene invertendo il tubo. Ci vogliono un paio di minuti fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Aggiungere 1 ml di 100 mg / ml apo-transferrina (preparati in acqua), 33 ml di 0,6 mg / ml progesternone (costituiti in etanolo), 100 ml di 160 mg / ml (1 M) putrescina (preparati in acqua ), 10 ml di 3 mM selenito di sodio (preparati in acqua) e 666 ml di 7,5% di siero albumina bovina e mescolare bene il tubo. Aliquota in 2,5 ml e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi. </li></ol></li><li> Preparare il supporto. <ol><li> Per 250 ml di DMEM / F12 aggiungere 2,5 ml di N2. Mescolare bene ma non scuotere o filtro. </li><li> Per 250 ml di Neurobasal media aggiungi 5 ml di supplemento B27. Mescolare bene ma non scuotere o filtro. </li><li> Mescolare il supporto da operazioni 1.2.1 e 1.2.2 in un rapporto 1: 1. In alcuni casi un 1: 3 mix può essere richiesto (integrato come il 1: 1 mix al punto 1.2.4). </li><li> Per il mix di aggiungere 0,5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 0,2 mm) e 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale 0,1 mm) e mescolare bene senza agitare. Conservare il supporto a 4 ° C per un massimo di 3 settimane e non esporre alla luce. Questo mix finale si chiama N2B27. </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di gelatina. <ol><li> Preparare una soluzione di gelatina 1% in acqua ultrapura e autoclave a 121 ° C, 15 psi, per 15 min. È importante che la bottiglia utilizzata per questo è completamente pulito da detergenti o disinfettanti, quindi si raccomanda una nuova bottiglia èutilizzato per questo ed è sempre risciacquato solo in acqua ultrapura tra usi. Aliquota della soluzione all&#39;1% in 50 ml aliquote e conservare a 4 ° C per mesi. </li><li> Scaldare un&#39;aliquota di 1% di gelatina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° fino a scioglimento e aggiungere 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato calda (PBS). Mescolare bene e pipettare sufficiente a coprire il fondo di ogni bene o un piatto. Lasciare la gelatina per rivestire la superficie per almeno 30 min. </li></ol></li></ol> 2. placcatura celle NOTA: Questo protocollo vale anche per il mouse ESC coltivato in 10% di siero di leucemia fattore inibitorio (LIF), la sostituzione di siero con LIF o supporti privi di siero con LIF e proteina morfogenetica dell&#39;osso 4 (BMP4) o MEK e GSK3 inibitori (supporti 2i) con o senza LIF. Tuttavia, i tempi e l&#39;efficienza della differenziazione possono variare a seconda del supporto e le cellule (vedi la discussione). Per gli esperimenti riportati qui abbiamo usato la linea 46C del mouse ESC (che ha un reporter EGFP buttato in one degli alleli Sox1 endogeni), coltivati ​​in GMEM con 10% siero e LIF. Per ottenere risultati ottimali, è importante che le cellule sono dissociate e ripiastrate nei media N2B27; semplicemente cambiando di supporti da GMEM / siero / LIF a N2B27 si traduce sempre in efficienza differenziazione ridotto rispetto replating cellule. <ol><li> Far crescere le cellule in GMEM con 10% di siero, 1 mM piruvato di sodio, aminoacidi non essenziali 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanolo, e LIF 13 100 unità / ml. Per avere una cultura subconfluenti di topo ESC, piatto 1 x 10 6 cellule in un pallone di coltura T25 che avrà 2-3 giorni. </li><li> Osservare le cellule al microscopio in campo chiaro. Quando le cellule sono subconfluenti e pronti per il passaggio, sciacquare due volte in PBS. Aggiungere 1 ml di cellule dissociazione reagenti e ritorno per l&#39;incubatore per 2 - 5 min. Sebbene tripsina e di altri enzimi possono essere utilizzati anche per la dissociazione cellulare, possono avere un impatto negativo sulla adesione cellulare così le densità di placcatura dovranno essere regosted. </li><li> Una volta che le cellule iniziano a sollevare dalla piastra, toccare il vaso loro rimuovere in una sospensione di cellule singole. Raccogliere le cellule in un totale di 10 ml di mezzi di comunicazione e di dissociazione delle cellule del reagente e pipetta in una provetta da centrifuga da 15 ml. </li><li> Spin le cellule a 300 xg per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di N2B27 preriscaldata pipettando su e giù 3 - 5 volte. Quando pipettando sospensione giù, pipetta contro il lato del tubo per evitare la creazione di bolle. Contare le cellule con un contatore di cellule automatico o un emocitometro e registrare la concentrazione. </li><li> Preparare una sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule per unità di volume da placcare per pozzetto in N2B27 pre-riscaldato. Una densità di 10.500 cellule per cm 2 in un piatto da 6 pozzetti (cioè, 1 x 10 5 cellule per pozzetto di un piatto 6 pozzetti) è ottimale. Vedi Tabella 1 per il numero consigliato di cellule per cm 2 e plating volumi di media per una serie di recipienti di coltura cellulare. </li><li> Aspirare la gelatina dal recipiente di coltura e la piastra della sospensione cellulare in funzione della densità suggerito e volume in Tabella 1. Non agitare le piastre in quanto ciò concentrare le cellule al centro. Collocare le culture in un incubatore umido a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Modificare i media ogni 1 - 2 giorni, sostituendo tutti i media con N2B27 fresca. Pipetta delicatamente come vampate di calore le cellule potrebbero incidere densità e diminuire l&#39;efficienza differenziazione nei giorni successivi. Dove vitalità iniziale dopo la placcatura è povero, piastra le cellule in un 1: 3 mix dei media N2 e B27-integrati e cambiare questo N2B27 dopo i primi due giorni. Le cellule cominceranno a differenziare e dovrebbero mostrare espressione Sox1 (visibile fluorescenza verde del reporter nella linea cellulare 46C usato qui) entro 4 - 6 giorni. </li></ol> 3. immunofluorescenza NOTE: Il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di imbarcazione. Il volume di ogni reagente è descritta per pozzetto di 6 pozzetti e può essere installato su qualsiasi superficie. Replating è sconsigliato a causa della bassa redditività in seguito. <ol><li> Rimuovere terreno di differenziamento e fissare le cellule aggiungendo 500 ml di 4% (v / v) paraformaldeide, lasciare per 15 min. </li><li> Lavare e permeabilize le cellule con 2 ml di PBS-T (tampone fosfato salino con 0,5% (v / v) di Tween-20) due volte. Le cellule possono essere mantenute in PBS-T fino a 2 mesi a 4 ° C. </li><li> Sostituire PBS-T con 1 ml di PBS-T con 10% (v / v) di siero (dalla stessa specie come anticorpo secondario). Incubare 1 ora sulla sedia a dondolo piatto a temperatura ambiente per bloccare qualsiasi legame non specifico. </li><li> Dopo 1 ora, lavare le cellule due volte con 2 ml di PBS-T, e incubare in 500 microlitri IgG topo contro βIII-tubulina (diluito 1: 1000 in PBS-T con siero 10%). Mettere sul rocker piatto, e lasciare O / N a 4 ° C. </li><li> Da questo punto, proteggere sempre il recipientedalla luce. Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di fluorescenza marcato anti-topo IgG (diluito a 2 mg / ml in PBS-T con siero 10%). Mettilo sul bilanciere piatto per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS-T, quindi aggiungere 500 ml di DAPI (diluito a 0,5 mg / ml in PBS-T) e lasciar riposare per 5 minuti. </li><li> Lavare nuovamente le cellule e tenerli in PBS-T. Le cellule sono pronte per essere fotografata e possono essere conservati per un massimo di 2 settimane a 4 ° C. Si noti che il segnale GFP svanisce nel tempo in modo non è opportuno confrontare l&#39;intensità GFP delle cellule fisse e in diretta o di cellule fissate in tempi diversi. </li></ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo di differenziamento neurale monostrato è stato in uso per oltre un decennio 6. Il protocollo è altamente efficiente, composto terreno specifico, e fatto in un sistema monostrato che rende il sistema più applicabile per preclinica (ad esempio, la selezione della droga) utilizza. Tuttavia, vi sono alcuni fattori critici che determinano l&#39;efficienza differenziazione. Questo articolo sottolinea questi fattori e la soluzione per ogni ostacolo. Densità delle c...

Le cellule staminali embrionali sono cellule pluripotenti derivate da embrione precoce con la capacità di proliferare indefinitamente in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in tutti i tipi cellulari adulti seguenti reintroduzione in un apposito embrione stadio (formando una chimera), iniezione in singenici o immunocompromessi host (formando un teratoma) o in vitro soggetto a segnali appropriati 1. La differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in lignaggi neuronali è stato descritto nel 1995 e prevedeva la formazione di aggregati multicellulari di sospensione (corpi embrionali, EBS) in mezzi di siero contenenti integrati con l&#39;acido retinoico morfogeno 2-4. Da allora una serie di protocolli sono stati sviluppati per permettere la differenziazione neuronale 5. Molti ancora utilizzare l&#39;aggregazione, gli altri co-coltura con induzione tipi di cellule e molti prevedono l&#39;utilizzo di mezzi privi di siero. Tutti i protocolli hanno vantaggi and svantaggi e la natura precisa neurali o cellule neuronali prodotte anche varia secondo il protocollo usato. Il protocollo ideale sarebbe robusto, scalabile e fare uso di mezzi di comunicazione e substrati completamente definiti, essere suscettibili di monitoraggio non invasivo del processo di differenziazione e causare la generazione delle popolazioni pure di cellule progenitrici neurali in grado di essere modellato da stimoli esterni e per differenziare in tutti i sottotipi neuronali e gliali con elevata efficienza e la resa in un tempo relativamente breve. Negli ultimi dodici anni abbiamo utilizzato un metodo per la generazione di progenitori neurali e neuroni di topo CES in una bassa densità, privo di siero cultura monostrato aderente 6-10. Questo protocollo soddisfa molti dei criteri di cui sopra: nelle nostre mani l&#39;efficienza della differenziazione è stato abbastanza costante nel corso di molti anni, e una varietà di linee cellulari, si può essere scalato verso l&#39;alto o verso il basso (usiamo con successo navi di piastre da 96 pozzetti per 15 centimetri di diametro dishes) ei supporti utilizzati sono ben definiti. Il processo è suscettibile di microscopia timelapse per il monitoraggio della differenziazione e una varietà di segnali patterning può essere aggiunto per indurre la generazione di tipi distinti di sottotipi neuronali (es Shh e Fgf8 per i neuroni dopaminergici 6). Tuttavia, ci sono alcune sfide per l&#39;efficace applicazione di questo protocollo. Uno degli aspetti chiave è un&#39;attenta preparazione dei media. Abbiamo sempre prepariamo il supporto in-house nonostante la disponibilità di alternative commerciali. Uno degli integratori utilizzati (N2; vedi Protocol) ha modifiche nel corso dello standard versioni disponibili in commercio. Infine, una delle fasi più importanti per il successo di questo metodo è la densità cellulare ottimale placcatura. Questo è principalmente perché mentre la natura autocrina di uno dei segnali che inducono (Fgf4 11) richiede che le cellule sono presenti sufficienti per consentire viabil ottimalelità e la differenziazione, a troppo elevate densità di differenziazione è compromessa (forse in parte a causa della produzione autocrina di LIF 12). È quindi importante che la preparazione sia supporti e placcatura cellule vengono eseguite accuratamente e costantemente per garantire risultati ottimali.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per dissociazione cellulare StemPro Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Ricostituire con sterile 0,01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Ricostituire con acqua sterile</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Ricostituire con etanolo</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Ricostituire con acqua sterile</td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Ricostituire con acqua sterile</td></tr><tr><td>Frazione di albumina bovina V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Assicurarsi che sia completamente disciolta prima dell'uso poiché la glutammina è solitamente sedimentata</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Fattore inibitorio della leucemia</td><td>preparato internamente come in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Mouse anti & beta; Anticorpo IgG della tubulina III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-topo marcato con fluorescenza</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>25 cm2 pallone per coltura tissutale</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato cultura

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

La capacità di differenziare le cellule staminali embrionali di topo (ESC) per progenitori neurali consente lo studio dei meccanismi di controllo specifica neurali nonché la generazione di tipi di cellule neuronali mature per ulteriori studi. In questo protocollo si descrive un metodo per la differenziazione di ESC per progenitori neurali usano senza siero, cultura monostrato. Il metodo è scalabile, efficiente e si traduce in produzione di circa il 70% di cellule progenitrici neurali entro 4-6 giorni. Esso può essere applicato a ESC da vari ceppi coltivate sotto una varietà di condizioni. Progenitori neurali possono essere autorizzati a differenziare ulteriormente in neuroni funzionali e glia o analizzati al microscopio, il flusso delle tecniche di citometria o molecolari. Il processo di differenziazione è suscettibile di microscopia time-lapse e può essere combinato con l&#39;uso di linee giornalista per monitorare il processo di specifica neurale. Noi forniamo istruzioni dettagliate sulla preparazione dei media e l&#39;ottimizzazione della densità cellulare per consentire il processo di Be applicato alla maggior parte delle linee ESC e una varietà di recipienti di coltura cellulare.

In questo esperimento, abbiamo utilizzato la linea cellulare 46C 14, le cellule staminali embrionali di topo con un endogena Sox1-reporter GFP, per monitorare la differenziazione neuronale. Utilizzando questa linea cellulare, espressione di Sox1, un marker per progenitore neuronale, può essere rilevata da fluorescenza verde. Placcatura densità è un fattore critico per raggiungere la differenziazione neuronale. Cellule staminali embrionali di topo sono stati placcati in 6 pozzetti a diverse densità che variano...

Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è differenziare cellule staminali embrionali di topo verso una linea neurale in una coltura cellulare monolayer priva di siero. Questo risultato si ottiene innanzitutto rivestendo il contenitore di coltura con gelatina. Nel secondo passaggio, le cellule staminali embrionali vengono dissociate in una sospensione di singole cellule in mezzo di differenziamento e diluite alle densità di semina appropriate.Nell'ultimo passaggio, le cellule vengono seminate su una piastra rivestita con gel ENC. Infine, la microscopia a immunofluorescenza viene utilizzata per confermare il successo della differenziazione mediante la visualizzazione dei marcatori neurali di interesse. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la semina a una densità appropriata è fondamentale per ottenere una buona differenziazione.E diversi fattori influenzano direttamente e indirettamente la densità di semina. Prima di seminare le cellule, riscaldare un'aliquote di gelatina al 1% in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius fino a completa dissoluzione. Quindi mescolare la gelatina con 500 millilitri di PBS tiepido e coprire il fond

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Biologia dello sviluppo

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l'efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Il video dimostra un protocollo che utilizza terreni privi di siero per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali di topo. La concentrazione desiderata di cellule staminali embrionali, sospese in terreni privi di siero, viene placcata su vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina. A una densità cellulare ottimale, le cellule producono fattori di segnalazione autocrini che, insieme ai fattori che inducono la differenziazione neurale nei terreni privi di siero, innescano la...

Generazione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali in colture monostrato prive di siero

Questo video dimostra un metodo per la generazione in vitro di cellule progenitrici neurali (NPC) da cellule staminali embrionali di topo (mESC). Le mESC vengono coltivate in sospensione per formare corpi embrioidi (EB), che vengono poi guidati a differenziarsi in NPC tramite trattamento con acido retinoico in una coltura aderente.

Una tecnica per generare cellule progenitrici neurali da cellule staminali embrionali di topo

Il video ha mostrato un metodo di coltura cellulare per differenziare le cellule progenitrici neurali in neuroni. Incubando le cellule in un terreno ricco di sostanze nutritive integrato con fattori di crescita, le cellule progenitrici sono maturate in neuroni con assoni e dendriti sviluppati. Un agente stabilizzante ha assicurato la vitalità cellulare e protetto dal danno ossidativo durante tutto il processo di differenziazione.

Differenziazione delle cellule progenitrici neurali in neuroni

Questo video dimostra una tecnica per la differenziazione delle cellule staminali embrionali in una popolazione in rete di neuroni con sinapsi funzionanti. Delinea le fasi coinvolte nella differenziazione delle cellule staminali embrionali in neuroni, nell'induzione della formazione della rete neuronale e nell'arricchimento della coltura con neuroni in rete.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in una popolazione di neuroni in rete

Il siero utilizzato nelle culture embrione contiene componenti sconosciuti che possono influenzare l'esito degli esperimenti soprattutto in studi che coinvolgono le interazioni di segnalazione. Qui abbiamo utilizzato un sistema di coltura ossigenato senza siero e dimostrare che embrioni di topo metà della gestazione in coltura per 16-40 ore esibiscono sviluppo morfologico paragonabile agli embrioni in via di sviluppo in utero.

Embrionali di topo di sviluppo in un embrione di tutta la cultura di sistema privo di siero

Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.

Analisi di acido retinoico-indotta neurale differenziazione di cellule staminali embrionali di topo a organi embrionali due e tridimensionali

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

Descriviamo la procedura per la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo in cellule neuronali utilizzando il metodo della goccia sospesa. Inoltre, eseguiamo un'analisi fenotipica completa attraverso RT-qPCR, immunofluorescenza, RNA-seq e citometria a flusso.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

Impara a differenziare cellule staminali embrionali di topo in progenitori neurali con metodo monostrato senza siero. Questo protocollo scalabile consente screening ad alto rendimento e studio dello sviluppo neuronale.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

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